专利名称：中药数字化色谱指纹谱相似度评价系统的制作方法
技术领域：
本发明属于中药指纹图谱相似度评价系统，特别属于用计算机对中药数字 化指纹图谱相似度评价系统。
技术背景随着中国经济的发展，中药及其各种产品的标准化也越来越重要，中药数 字化指纹图是中药标准化的重要组成部分，但不同产地的中药其数字化指纹图 谱都或多或少的存在着差别，这为不同地方的药监、药检部门如何快速的判断 中药的真伪造成了困难。 发明内容本发明所要解决的技术问题在于提供一种能够快速准确的对中药指纹图谱 相似度评价的计算机系统。本发明解决技术问题的技术方案为中药数字化色谱指纹谱相似度评价系 统，包括高效液相色谱仪对物质进行检测，将检测结果输入存储程序的数字计 算机，该存储程序的数字计算机执行如下步骤a) 输入经高效液相色谱仪检测的正品及检品原始数据库，将样品数据按照参照样品的保留时间进行一点或多点的校正后，形成待处理正品、检品数据库， 设定正品库中的一个正品为标准样品，以其数据为标准数据，将其余正品、检品数据与标准数据进行匹配后，形成了正品指纹图谱集及检品指纹图谱集；b) 在正品的指纹图谱集中，选出含量较高的n个峰做为n强峰，以不同样品 所具有保留时间相同的色谱峰为共有峰，共有峰占样品总峰数的比率为共有率 P,统计所有样品的共有率，设定共有率下限P^将所有样品共有率P与共有率下限Pm进行比较,若该样品的共有率P大于共有率下限PK.则保留该样品的数据，若该样品的共有率P小于共有率下限Pm，则要设定n强峰出现的频率Yps，判断该 样品n强峰出现频率与YK的大小，若样品n强峰的出现频率大于标准频率Ym，则 保留该样品的数据，否则将判断样品的保留时间与已知成份的保留时间是否相 同，若保留时间相同，则保留该样品的数据，否则，删除此样品的数据；将数 据按照保留时间重新排序，形成正品特征指纹图谱库；c) 将a步骤所生成的检品指纹图谱集与正品特征指纹图谱库中的数据进行 峰匹配，形成检品指纹图谱库，计算检品与各正品之间的相似度，并计算相似 度均值J样；d) 计算正品特征指纹图谱库中各个样品的相似度及相似度均值J，以正品相 似度均值最小值J为阈值，判断检品相似度均值J #与特征指纹库中的相似度均 值J，若检品相似度均值J肖大于正品特征指纹库中的相似度均值J，，则为合格 产品，并将其数据加入到正品原始数据库中，以增加正品指纹图谱库的代表性， 若检品相似度均值J肖小于正品特征指纹库中的相似度均值J，则为不合格产品。所述的数据区配包括以下步骤在待处理正品数据库中，设定基准正品样品，以基准正品样品的保留时间， 相对峰面积，n强峰，来设定设定相对保留时间a基准，相对峰面积S基准，n强峰 n基准，设定标准窗口，标准窗口的步长为W，判断待处理正品数据库中的其它数 据的相对保留时间a样与a基准之差的绝对值是否小于等于步长W，若该样品的相 对保留时间a #与a絲之差的绝对值小于等于步长W，则该样品的相对峰面积S 值添加于a基准所在行的相应样品号下，若该样品的相对保留时间a样与a基准之差 的绝对值大于步长W，则在a基准所在列中增加ct样，该样品的相对峰面积S值添 加于a肖所在行的相应样品号下，将数据库中所有正品按照相对保留时间的大小进行排序，形成了正品指纹图谱集。将待处理的检品数据库中的样品数据，与基准正品样品进行比较，以相同 的方法，形成了检品指纹图谱集。所述的峰匹配子程序包括以下步骤在待处理正品数据库中，选择正品特征指纹图谱集中的a值，设定标准窗口，标 准窗口的步长为W，判断待处理检品数据库中数据的相对保留时间a #与a之差 的绝对值是否小于等于步长W，若该样品的相对保留时间a #与a之差的绝对值 小于等于步长W，则该样品的相对峰面积S值添加于a所在行的相应样品号下， 若该样品的相对保留时间a #与a之差的绝对值大于步长W，则删除该样品数 据，将数据库中所有检品按照相对保留时间的大小进行排序，形成了检品指纹 图谱库。d)步骤也可以为计算正品特征指纹图谱库中各个样品的差异率R，以正品 差异率最大值R为阈值，计算检品与正品的差异率为检品差异率R肖，判断检品 差异度均值R样与特征指纹库中的差异度均值R，若检品差异率R样小于正品特 征指纹库中的差异率R，，则为合格产品，并将其数据加入到正品原始数据库中， 以增加品指纹图谱库的代表性，若检品差异率R样大于正品特征指纹库中的相似 度均值J，则为不合格产品。为了使特征指纹图谱库更有代表性，所述的正品原始数据库的正品原始数 据为不小于10个。在分析峰数较多的样品时，虽可选择一峰位居中的峰作内标峰，但它与两 端的色谱峰保留值相差较大，此时对两端色谱峰的相对保留值的精度会产生一 定的影响，从而导致定位的偏差。为此可采用多点校正，形成多个相对保留值 系列，以此作为比较依据。在数据匹配过程中，窗口 W其大小根据情况选定录入，将各样品的a(相对 保留时间)值和选为基准样品的a值逐一进行比较，符合条件者，该样品的a值 以标准a值为准(其自身的a值去掉)，s(归一化面积值)值追加到标准a值后的 该样品列上。不符合条件者，将其a值追加到标准a值列中，s值随后追加到该 样品上。处理完第一个样品后，第二个样品再和基准样品与第一个样品形成的 "标准a值"比较，以此类推。当遇到同时有两个或两个以上的a值落于同一a 值的窗口范围内时，取接近标准a值的那个数值。本发明通过设定共有率，能够有效的去掉那些众多样品中出峰数较少的峰; 设定n强峰的出现频次限度，可以保证那些在众多样品中出现频次较多的强峰 不因共有率的限度而丢失，而在限度以下的强峰则被去掉。通过录入已确定成分的a值，保证样品中已确定的成分不受其它参数设置 的影响，而将始终保留在指纹谱中。为了充分利用虽为正品但因所含个别成分含量过高或过低而被系统判为不 合格品的样品，还可将正品与不合格或不合格品与不合格按一定比例混合勾兑， 从而调整个别成分的含量，使外交部勾兌后的样品成为合格品。本发明所述的相似度的按照下列公式计算-S — 2m___2f卜"('.)~ (,')1 (i)S为两指纹图谱相似程度， 一张指纹图谱色谱峰总数为np共有峰面积或峰 高为hu，另一张指纹图谱色谱峰数为n2，共有峰面积或峰高为h2t，两张指纹图 谱的共有峰数为n。相似度均值按照下列公式计算S均"lX (z、l,2,3'A,") (2)差异率值按照下列公式计算X,—每个特征指纹峰的面积归一化值或相对面积值的平均值； X, —各样品中相应特征峰的面积归一化值或相对面积值；n—特征指纹数。本发明与现有技术相比，针对中药复杂组分的分析、鉴定，建立相似度评 价系统，提高了峰间可比性，做到了整体性与模糊性的科学处理，实现了图谱 的数据化。将色谱图转换成稳定而易于比较的数据表并将重叠率、检出率、差异率、特征指纹峰、归一化面积值、n强峰等一系列参数及其计算统计引入到该系统中，这些参数的引入使中药的比较鉴定更具有客观的量化数据，使该相似度评价系统能够在中药质控和质标中发挥更大的作用。
图l为本发明的流程图。图2为本发明数据匹配子程序的流程图。图3为本发明峰匹配子程序的流程图。图4为本发明C步骤为差异度判断的流程图。图5为决明子空白溶液的指纹图谱。图6为大决明子生品的HPLC指纹图谱。图7为小决明子生品的HPLC指纹图谱。图8为标准品溶液的HPLC指纹图谱。图9为望江南生品的HPLC指纹图谱。图10为15批大决明子的HPLC指纹图谱。图11为22批小决明子的HPLC指纹图谱。 图12为5批小决明子清炒品的指纹图谱。 图13为IO批望江南正品的指纹图谱。在图6—9中，A1—A16大决明子生品中各种成份的吸收峰，B1—B16小决 明子生品中各种成份的吸收峰，Cl为芦荟大黄素，C2为大黄酸，C3为大黄素， C4为大黄酚，C5为大黄素甲醚，D1—D9为望江南生品中各种成份的吸收峰。在图10中El—E13为大决明子正品的指纹图谱，E14—E15为大决明子待 检品中指纹图谱。在图11中，F1—F19为小决明子正品的指纹图谱，F20—F22为小决明子待 检品的指纹图谱。在图12中G1—G5为5批小决明子清炒品的指纹图谱。在图13中H1-H10为10批望江南正品的指纹图谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做详细的说明。实施例1: 如图l所示在步骤101 — 106中，输入经高效液相色谱仪检测的正品及检品原始数据库， 将样品数据按照参照样品的保留时间进行一点或多点的校正后，形成正品、检 品待处理数据库，设定正品库中的一个正品为标准样品，以其数据为标准数据， 将其余正品、检品数据与标准数据进行数据匹配后，形成了正品指纹图谱集及 检品指纹图谱集；在步骤107 —IIO中，在正品的指纹图谱集中，选出含量较高的n个峰做为n 强峰，以不同样品所具有保留时间相同的色谱峰为共有峰，共有峰占样品总峰数的比率为共有率P，统计所有样品的共有率，设定共有率下限Pw，将所有样品 共有率P与共有率下限PPS进行比较，若该样品的共有率P大于共有率下限P^则保留该样品的数据，若该样品的共有率P小于共有率下限PB,则转到步骤130—133， 设定n强峰出现的频率Y^判断该样品n强峰出现频率与YK的大小，若样品n强 峰的出现频率大于标准频率Yw则转到步骤IIO，否则将判断样品的保留时间与 已知成份的保留时间是否相同，若保留时间相同，则转到步骤IIO，否则，删除 此样品的数据；在步骤111一112中，将数据按照保留时间重新排序，形成正品特 征指纹图谱库。；在步骤120—123中，将步骤105所生成的检品指纹图谱集与正品特征指纹 图谱库中的数据进行峰匹配，形成检品指纹图谱库，计算检品与各正品之间的 相似度，并计算相似度均值J^在步骤113 — 117中，计算正品特征指纹图谱库中各个样品的相似度及相似 度均值J，以正品相似度均值最小值J为阈值，判断检品相似度均值Jff与特征指 纹库中的相似度均值J，若检品相似度均值J #大于正品特征指纹库中的相似度 均值J，，则为合格产品，并将其数据加入到正品原始数据库中，以增加品指纹 图谱库的代表性，若或检品相似度均值J ff小于正品特征指纹库中的相似度均值 J，则为不合格产品。如图2所示，在步骤201—209中，在待处理正品数据库中，设定基准正品 样品，以基准正品样品的保留时间，相对峰面积，n强峰，来设定设定相对保 留时间a基准，相对峰面积S基准，n强峰n基准，设定标准窗口，标准窗口的步长 为W，判断待处理正品数据库中的其它数据的相对保留时间a样与a基准之差的绝 对值是否小于等于步长W，若该样品的相对保留时间a样与a基准之差的绝对值小 于等于步长W，则该样品的相对峰面积S值添加于a基准所在行的相应样品号下，若该样品的相对保留时间a #与a ^之差的绝对值大于步长W,则在a目所在列 中增加o^，该样品的相对峰面积S值添加于a肖所在行的相应样品号下，将数 据库中所有正品按照相对保留时间的大小进行排序，形成了正品指纹图谱集。在步骤201 —210中，将待处理的检品数据库中的样品数据，设定标准窗口 ， 标准窗口的步长为W，判断待处理检品数据库中数据的相对保留时间a样与a基 准之差的绝对值是否小于等于步长W，若该样品的相对保留时间ci样与ct基准之差 的绝对值小于等于步长W，则该样品的相对峰面积S值添加于a基准所在行的相 应样品号下，若该样品的相对保留时间a样与ci基准之差的绝对值大于步长W，则 在a目所在列中增加a #，该样品的相对峰面积S值添加于a #所在行的相应样 品号下，将数据库中所有检品按照相对保留时间的大小进行排序，形成检品指 纹图谱集。如图3所示，在步骤301 — 308中，在待处理正品数据库中，选择正品特征指纹 图谱集中的a值，设定标准窗口，标准窗口的步长为W，判断待处理检品数据库中 数据的相对保留时间a #与ct之差的绝对值是否小于等于步长W，若该样品的相 对保留时间a #与cl之差的绝对值小于等于步长W，则该样品的相对峰面积S值 添加于a所在行的相应样品号下，若该样品的相对保留时间a #与a之差的绝对 值大于步长W，则删除该样品数据，将数据库中所有检品按照相对保留时间的 大小进行排序，形成了检品指纹图谱库。实施例2:除步骤113 — 117变为步骤401—406外，其余与实施例l相同。 在步骤401—406中，计算正品特征指纹图谱库中各个样品的差异率R，以 正品差异率最大值R为阈值，计算检品与正品的差异率为检品差异率Rff，判断 检品差异度均值R #与特征指纹库中的差异度均值R，若检品差异率R #小于正品特征指纹库中的差异率R，，则为合格产品，并将其数据加入到正品原始数据 库中，以增加正品指纹图谱库的代表性，若检品差异率Rff大于正品特征指纹库 中的相似度均值J，则为不合格产品。将本发明实施例1用于决明子及其炮制品、代用品望江南的HPLC指纹相 似度评价。决明子为豆科植物决明Om/a o&M /o//a L.或小决明Cosw'a L. 的干燥成熟种子。秋季采收成熟果实，晒干，打下种子，除去杂质。前者全国 各地多有栽培，产量大，主产于江苏、安微、四川等地，习称大决明子；后者 多为野生，产量较小，主产于广西、安徽、云南等省区，习称小决明子。有清 热明目，润肠通便之功效。望江南子&wewCaw/aoccWe"toto呈扁平状近圆形， 一端略长，长3.5 4.5mm，宽2.5 3.5mm，厚1 1.5mm。表面灰绿色或灰棕 色，在两平面中央有椭圆形凹斑。质坚硬，不易破碎，横切面可见灰白色胚乳 与两片平直紧贴的黄色子叶，味淡，有小毒。张铁军等对全国21个省(市)进 行实地调查，结果表明目前作决明子药用的除正品决明子外，还有望江南， 仅在广东潮州一带，又称圆决明。1.实验材料、仪器与试剂1.1实验材料本实验所用大决明子生药正品13批、小决明子生药正品19批、大决明子 生药待检品2批，小决明子生药待检品3批，望江南生药正品10批，上述药材均为商品药材。1.2仪器与试剂Agilent 1100高效液相色谱仪(包括Agilent1100四元泵，Agilent 1100 二极管 阵列检测器，Agilent 1100色谱化学工作站)；FA 2004电子分析天平(上海恒平科学仪器有限公司)；BK 14- C2 0孔玻璃仪器快速烘干器(郑州长城科工贸有限公司)；超声波清洗机(上海必能信超声有限公司)；ZFQ85A型旋转蒸发器(上海医械专机厂)；芦荟大黄素对照品(批号766-200210)、大黄素对照品(批号756-200110)、 大黄酸对照品(批号774-200311)、大黄酚对照品(批号796-200204)、大黄素 甲醚对照品(批号758-2004080)均购自中国药品生物制品检定所。乙腈、甲醇 为色谱纯，盐酸、磷酸及氯仿为分析纯。2.实验方法2.1供试品制备2丄1决明子炮制品取小决明子生药正品19批中的一批，按下列方法制备炮制品，每种炮制品 制备5批。清炒品生品以文火炒至微有爆裂声并有香气。 酒炙品生品加酒泡过夜，文火炒干。 盐炙品生品加盐水拌匀，闷透，文火炒干。 醋炙品生品加醋闷润过夜，文火炒干。 醋蒸品生品加醋闷润过夜，蒸2h,晾千。2丄2对照品溶液称取芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、大黄素甲醚、大黄酚对照品适量，以甲醇为溶剂，配制成20pg/ml的芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、大黄素甲醚、大 黄酚五种成分的对照品溶液及其混合对照品溶液。 2丄3供试品溶液取决明子样品，粉碎，过80目筛，称取2.0g，加1.5mol/L的盐酸溶液30ml， 加热回流1.5h，放冷，加氯仿25ml，回流20min，取出，分取氯仿层，酸水层再 加氯仿25ml，回流20min，分取氯仿层，同上法操作，加氯仿再回流提取二次， 合并四次氯仿提取液，加水20ml振摇洗脱，弃去水层，将氯仿液蒸干，残渣加 甲醇15ml使溶解，过滤，定量转移至25ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀， 经0.45pm微孔滤膜过滤，即得。2.2色谱条件色谱柱Zorbax Eclipse XDB - d8(4.6mmx250mm，5iim),保护柱Zorbax SB -<:18柱(4.611111^12.5111111,5^1111);流动相乙腈(A) - 0.1。/o磷酸水溶液(B)作梯 度洗脱，Omin， 10%A-90%B; 5 min， 15%A-85%B; 10min， 40%A-60%B; 40min， 70%A - 30%B; 41min后100。/oA。流速l.Oml/min;柱温室温；检 测波长278nm，参比波长550nm;光谱数据记录范围220 500nm，波长间 隔2nm;色谱记录时间0 50min;进样量10^1。 2.3色谱指纹峰标定2.3.1特征峰选定按2丄3供试品溶液的制备方法做空白试验，结果见图 5。检出峰中峰面积最大值及峰高最大值分别在200毫吸收度及5毫吸收度以下, 因此选取面积阈值(Area Reject) =200，峰高阈值(Height Reject) =5对所有供 试品进行积分，选取有积分值的峰做为决明子的特征峰。取决明子生品的供试 品溶液按选定色谱条件测定，记录其色谱图，按规定方法积分，结果见图6、图 7。2.3.2部分特征峰确认取芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素、大黄 素甲醚纯组分对照品溶液和混合对照品溶液按上述色谱条件测定，见图8。 比较各对照品溶液的色谱图与供试品溶液的色谱图，根据色谱保留时间，初步确定图6、图7中的A12、 B12、 A15、 B15和A16、 B16号峰分别为大黄素、 大黄酚和大黄素甲醚峰，大黄酚峰所在峰在所选定的特征峰中，其峰高值居中。3. 内标峰的确定本实验决明子特征指纹谱的建立以大黄酚为内参照峰，在分析望江南样品 时，以大黄素甲醚为内参照峰。4. 指纹图谱。 4.1指纹图谱取大、小决明子、小决明子的炮制品、望江南的供试品溶液按选定色谱条 件测定，记录其色谱图。以大黄酚为内参照峰，分别计算E1 E15大决明子样品、F1 F22小决明 子样品、小决明的5种炮制品的相对保留时间cn及归一化面积值An。的相对保 留时间a及归一化面积值Ar。以大黄素甲醚为内参照峰，计算E1 E13大决明子样品、F1 F19小决明 子样品、H1 H10望江南样品的相对保留时间(X2及归一化面积值Ar2。计算的 相对保留时间a及归一化面积值Ar。4丄1大决明子的特征指纹图谱库4.L1.1大决明子的特征指纹图谱库以El正品为基准样品，共有峰窗口为0.02， n强峰数为8，共有率要求^80%， n强峰出现频次要求^8，对其余的El E13大决明子正品的on、 Ai^进行数据处 理，得13批大决明子的特征指纹图谱库、n强峰、n强峰出现频次表、相似度 表。大决明子的特征指纹图谱库有16个特征峰，相似度阈值为0.745。4丄1.2对E14、 E15大决明子样品的验证将E14、 E15大决明子样品的cn、 An和大决明子的特征指纹图谱库进行比较。E14、 E15样品的相似度低于阈值0.745，因此其应为不合格品。4丄1.3小决明子与大决明子特征指纹图谱库的比较以大决明子的特征指纹图谱库为标准，以F1 F19小决明子正品为待鉴样 品(相对保留时间为on ，归一化面积值为An)，对小决明子进行分析。结果显示 所有小决明子的相似度值均低于大决明子的相似度阈值0.745。4.1.2小决明子的特征指纹图谱库4丄2.1小决明子的特征指纹图谱库以Fl样品为基准样品，共有峰窗口限度为0.02， n强峰数为8，共有率要 求^80%， n强峰出现频次要求^8，对其余18批小决明子正品的w、 An进行数 据处理，得19批小决明子的特征指纹图谱库、n强峰、n强峰出现频次表、相 似度表。小决明子的特征指纹图谱库有13个特征峰，相似度阈值为0.816。4.1.2.2 对F20、 F21、 F22小决明子的验证 将F20、 F21、 F22小决明子样品的oii、 和小决明子的特征指纹图谱库 进行比较，三者的相似度均低于相似度阈值0.816，因此判定这三种样品为不合 格品。4丄2.3大决明子与小决明子特征指纹图谱库的比较以小决明子的特征指纹图谱库为标准，以E1 E13大决明子正品为待鉴样 品，对大决明子进行分析。结果显示所有大决明子的相似度值均低于小决明子 的相似度阈值0.816。4丄3决明子综合指纹图谱库以Fl小决明子正品为基准样品，共有峰窗口限度为0.02， n强峰数为8， 共有率要求^80%， n强峰出现频次要求28，对E1 E13大决明子样品及F1 F19 号批小决明子样品进行数据处理，得决明子的综合特征指纹图谱库，库中共有特征峰12个，相似度阈值为0.641。4丄4炮制品与决明子特征指纹图谱库的比较 4丄4.1炮制品与小决明子特征指纹图谱库的比较因炮制品系由小决明子制得，因此以小决明子的特征指纹图谱库为标准， 对炮制品进行分析。各炮制品与小决明子特征指纹图谱库的比较，结果显示各 炮制品的相似度值均低于小决明子特征指纹图谱库的相似度阈值0.816。4丄4.2炮制品与决明子综合特征指纹图谱库的比较以32批决明子的综合特征指纹图谱库为标准，对炮制品进行分析，显示各 炮制品的相似度值均高于决明子综合特征指纹图谱库的相似度阈值0.641。 4丄5望江南与大、小决明子及决明子综合特征指纹图谱库的比较 4丄5.1望江南与大决明子特征指纹图谱库的比较以E1号大决明子样品为基准样品，共有峰窗口限度为0.02， n强峰数为8， 共有率要求^80%， n强峰出现频次要求^8,对El EB大决明子样品的a2、 Ar2 进行数据处理，得13批大决明子的特征指纹图谱库并对望江南进行分析。结果 显示望江南的相似度在0.151 0.189之间，远小于大决明子特征指纹图谱库的 相似度阈值0.720。4丄5.2望江南与小决明子特征指纹图谱库的比较以Fl小决明子样品为基准样品，共有峰窗口限度为0.02， n强峰数为8， 共有率要求^80%， n强峰出现频次要求^8，对Fl F19小决明子样品的a2、 Ar2 进行数据处理，得19批小决明子的特征指纹图谱库并对望江南迸行分析。结果 显示望江南的相似度在0.203 0.251之间，远小于小决明子特征指纹图谱库的 相似度阈值0.813。4丄5.3望江南与决明子综合特征指纹图谱库的比较以Fl小决明子样品为基准样品，共有峰窗口限度为0.02， n强峰数为8， 共有率要求280%， n强峰出现频次要求28，对E1 E13大决明子样品及F1 F19 号小决明子样品(相对保留时间为a2 ，归一化面积值为Ar2)进行数据处理，得 32批决明子的综合特征指纹图谱库并对望江南进行分析。结果显示望江南的相 似度在0.202 0.242之间，远小于决明子综合特征指纹图谱库的相似度阈值 0.699。以往的文献报道中均采用大黄酚为测定指标来控制决明子及其制剂的质 量，但在大、小决明子的特征指纹图谱中大黄酚并非为含量最高成分且含量分 布并不均匀。在13批大决明子的8强峰中，9批大决明子含有大黄酚，列第5 的有1个，第6的有3个，第7的有4个，第8的有1个；在19批小决明子的 8强峰中，19批小决明子均含大黄酚，列第4的有7个，第5的有8个，第6 的有2个，第7、第8的各1个。13批大决明子的特征指纹图谱库的相似度阈值为0.745， 19批小决明子的 特征指纹图谱库的相似度阈值为0.816。大、小决明子间的特征峰不相同，大决 明子的特征峰为16个，其中相对保留时间为0.374、 0.529、 0.553、 0.563的四 个峰在小决明子的特征指纹图谱库中没有；小决明子的特征峰为13个，其中相 对保留时间为0.666的峰在大决明子的特征指纹图谱库中没有。决明子综合特征指纹图谱库中，大、小决明子的检出峰数、检出率、重叠 峰数、重叠率均相同，但相似度却仅为0.641，说明大、小决明子特征成分间的 含量差异较大。以小决明子生品为基准样品，采集小决明子生品和其炮制品指纹图谱共17 个特征峰的相对峰比值数据，其中一个峰((x=0.669)为生品所特有，三个峰(a =0.372， 0.446， 0.564)为炮制品所特有，说明药材炮制前后其内在质量发生了很大变化，其层次聚类树图也说明了这一点。代用品望江南和大、小决明子及其综合特征指纹图谱库相比较，各项评价指标均相差较大，不可作为决明子的代用品。将本发明实施例1用于不同温度的决明子袋泡剂指纹相似度评价。 决明子含蒽醌类化合物和萘骈吡喃酮类等多种化学成分，具有清肝明目、润肠通便的功效，已开发出多种制剂，采用梯度洗脱的高效液相色谱法来表征决明子袋泡剂的色谱指纹特征。5. 仪器与试药 5.1仪器惠普1100高效液相色谱仪，包括Agilent 1100四元泵，惠普1100二极管阵 列检测器，惠普色谱化学工作站。超声波清洗机(上海必能信超声有限公司);ZFQ 85 A型旋转蒸发器(上海医械专机厂)。5.2样品与试剂5批大决明子生药样品符合《中华人民共和国药典》2005版规定。芦荟大 黄素对照品(批号766-200210)、大黄素对照品(批号756-200110)、大黄酸对 照品(批号774-200311)、大黄酚对照品(批号796-200204)、大黄素甲醚对照 品(批号758-2004080)均购自中国药品生物制品检定所。乙腈、甲醇为色谱纯， 盐酸、磷酸为分析纯。6. 方法与结果 6.1样品制备6.1.1决明子袋泡剂的制备取决明子生品，粉碎，过80目筛，称取2g， 用滤纸袋包装，制备决明子袋泡剂。6丄2对照品溶液的制备称取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，以甲醇为溶剂，配制成200昭'mL—'的戸荟大黄素、大 黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚纯组分对照品溶液和五种对照品的混合溶 液。6丄3供试品溶液制备将袋泡剂加入沸水35 mL,置盖分别保温20、 40 min，将袋取出，浸出液加盐酸4.7mL，加热回流1.5 h,放冷，加氯仿25 mL， 回流20min，取出，分取氯仿层，酸水层再加氯仿25mL，回流20 min，分取 氯仿层，同上法操作，加氯仿再回流提取二次，合并四次氯仿提取液，加水20 mL 振摇洗脱，弃去水层，将氯仿液蒸干，残渣加甲醇微热使溶解，定量转移至10mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。放置，取上清液经0.45pm微孔滤膜过滤。6.2色谱条件色谱柱Zorbax Eclipse XDB - C18 (4.0 mmx250誰，5 iim)，保护柱Scienhome Ci8柱(3.0mmx20mm， 5 pm);流动相乙腈(A) -0.1 。/o磷酸水溶液(B)作梯度 洗脱，Omin， 10%A ^%B; 5 min， 15%A 85%B; 10min， 40%A 60% B; 40min， 70%A 30%B; 41min后100o/oA;流速l.OmL.mirT1;柱温 室温；检测波长278 nm，参比波长550 nm;进样量10 ^L。分析时间为50 min。 6.3决明子袋泡剂指纹特征的测定及技术参数制备决明子袋泡剂10批，分别获得其保温20 min和保温40 min的供试品 溶液，1 —10号为保温40分钟的供试品溶液，11—20号为保温20分钟的供试 品溶液，以第1号决明子袋泡剂为基准样品，共有峰窗口限度为0.02， n强峰 数为8，共有率要求^80%， n强峰出现频次要求28，对决明子袋泡剂样品的相 对保留时间(a)和相对峰面积(Ar)进行数据处理，得1一20号决明子袋泡剂 提取液的特征指纹图谱库。结果显示，决明子袋泡剂保温40min的提取液(l 10号)的检出峰数为15个，检出率为100 %，重叠峰数为15个，重叠率为100%;而决明子袋泡剂保温20 min的提取液(11 20号)的检出峰数为11 12 个，检出率为73.33 % 80%，重叠峰数为11 12，重叠率为84.62 °/。 88.89%。以决明子袋泡剂保温40 min提取液Cl 10号)建立的特征指纹图谱库， 其相似度阈值为0.746。决明子袋泡剂保温20 min提取液(U 10号)的特征 指纹图谱与指纹图谱库相比较，其相似度在0.513 0.627之间，低于决明子袋 泡剂保温40min提取液Cl 10号)的相似度阈值0.746。6.4不同产地决明子袋泡剂HPLC指纹图谱的比较分别取产地为河北、安徽、江苏、浙江、上海的5批决明子生药样品，每 批制备保温40min的袋泡剂提取液10份(31 40号)和20 min的袋泡剂提取 液10份(41 51号)，按6.3决明子袋泡剂指纹特征的测定及技术参数项进行测 定，结果显示，不同产地的决明子袋泡剂保温40min的提取液Gl 40号)的 检出峰数为15个，检出率为100%,重叠峰数为15个，重叠率为100%;而不 同产地的决明子袋泡剂保温20min的提取液(41 50号)的检出峰数为12 13 个，检出率为80% 86.67%，重叠峰数为12 13，重叠率为88.88 % 92.86 %。 以不同产地决明子袋泡剂保温40min提取液Gl 40号)建立的特征指纹图谱 库，其相似度阈值为0.736。不同产地决明子袋泡剂保温20min提取液(41 50 号)的特征指纹图谱与指纹图谱库相比较，其相似度在0.513 0.629之间，低 于不同产地的决明子袋泡剂保温40 min提取液(31 40号)的相似度阈值0.736。 可见，保温时间不同，决明子袋泡剂提取液的检出峰数、检出率、重叠峰数、 重叠率则不同；保温时间对决明子袋泡剂有效成分的浸出量有较大影响，采用相似度评价可有效地控制不同产地的决明子袋泡剂在不同保温时间下的内在质
权利要求
1、中药数字化色谱指纹谱相似度评价系统，包括高效液相色谱仪对物质进行检测，将检测结果输入到存储程序的数字计算机，其特征在于该存储程序的数字计算机执行如下步骤a)输入经高效液相色谱仪检测的正品及检品原始数据库，将样品数据按照参照样品的保留时间进行一点或多点的校正后，形成待处理正品、检品数据库，设定正品库中的一个正品为标准样品，以其数据为标准数据，将其余正品、检品数据与标准数据进行匹配后，形成了正品指纹图谱集及检品指纹图谱集；b)在正品的指纹图谱集中，选出含量较高的n个峰做为n强峰，以不同样品所具有相同保留时间的色谱峰为共有峰，共有峰占样品总峰数的比率为共有率P，统计所有样品的共有率，设定共有率下限P限，设定n强峰出现的频率Y限。将所有样品共有率P与共有率下限P限进行比较，若该样品的共有率P大于共有率下限P限，则保留该样品的数据，若该样品的共有率P小于共有率下限P限，则进行n强峰出现的频率比较，判断该样品n强峰出现频率与Y限的大小，若样品n强峰的出现频率大于标准频率Y限，则保留该样品的数据，否则将判断样品的保留时间与已知成份的保留时间是否相同，若保留时间相同，则保留该样品的数据，否则，删除此样品的数据；将数据按照保留时间重新排序，形成正品特征指纹图谱库；c)将a步骤所生成的检品指纹图谱集与正品特征指纹图谱库中的数据进行峰匹配，形成检品指纹图谱库，计算检品与各正品之间的相似度，并计算相似度均值J样；d)计算正品特征指纹图谱库中各个样品的相似度及相似度均值J，以正品相似度均值最小值J为阈值，判断检品相似度均值J样与特征指纹库中的相似度均值J，若检品相似度均值J样大于正品特征指纹库中的相似度均值J，，则为合格产品，并将其数据加入到正品原始数据库中，以增加正品指纹图谱库的代表性，若检品相似度均值J样小于正品特征指纹库中的相似度均值J，则为不合格产品。
2、 根据权利要求l所述的中药数字化色谱指纹谱相似度评价系统，其特征 在于-所述的数据区配包括以下步骤在待处理正品数据库中，设定基准正品样品，设定标准窗口，标准窗口的 步长为W，判断待处理正品数据库中的其它数据的相对保留时间a样与a基准之差 的绝对值是否小于等于步长W，若该样品的相对保留时间a #与ot ，之差的绝对 值小于等于步长W，则该样品的相对峰面积S值添加于a 所在行的相应样品号 下，若该样品的相对保留时间a样与a基准之差的绝对值大于步长W，则在a基准所 在列中增加ctff，该样品的相对峰面积S值添加于ciff所在行的相应样品号下，将 数据库中所有正品按照相对保留时间的大小进行排序，形成了正品指纹图谱集；将待处理的检品数据库中的样品数据，与基准正品样品进行比较，以相同 的方法，形成了检品指纹图谱集。
3、 根据权利要求l所述的中药数字化色谱指纹谱相似度评价系统，其特征 在于-所述的峰匹配子程序包括以下步骤在待处理正品数据库中，选择正品特征指纹图谱集中的a值，设定标准窗口，标 准窗口的步长为W，判断待处理检品数据库中数据的相对保留时间a #与a之差 的绝对值是否小于等于步长W，若该样品的相对保留时间a #与a之差的绝对值 小于等于步长W，则该样品的相对峰面积S值添加于a所在行的相应样品号下， 若该样品的相对保留时间a #与a之差的绝对值大于步长W，则删除该样品数 据，将数据库中所有检品按照相对保留时间的大小进行排序，形成了检品指纹图谱库。
4、 根据权利要求l所述的中药数字化色谱指纹谱相似度评价系统，其特征 在于-d)步骤也可以为计算正品特征指纹图谱库中各个样品的差异率R,以正品 差异率最大值R为阈值，计算检品与正品的差异率为检品差异率Rff,判断检品 差异度均值R ft与特征指纹库中的差异度均值R，若检品差异率R ^小于正品特 征指纹库中的差异率R，，则为合格产品，并将其数据加入到正品原始数据库中， 以增加正品指纹图谱库的代表性，若检品差异率R^大于正品特征指纹库中的相 似度均值J，则为不合格产品。
5、 根据权利要求l所述的中药数字化色谱指纹谱相似度评价系统，其特征 在于所述的正品原始数据库的正品原始数据不小于IO个正品的数据。
全文摘要
本发明公开了中药数字化色谱指纹谱相似度评价系统，包括高效液相色谱仪对物质进行检测，将检测结果输入到存储程序的数字计算机，该存储程序的数字计算机执行如下步骤输入经高效液相色谱仪检测的正品及检品原始数据库，将正品、检品数据与标准数据进行匹配后，形成了正品指纹图谱集、正品特征指纹图谱库及检品指纹图谱集；将检品指纹图谱集与正品特征指纹图谱库中的数据进行峰匹配，形成检品指纹图谱库，计算各正品之间及检品与各正品之间的相似度，若检品相似度均值大于正品特征指纹库中的相似度均值J，则为合格产品，本发明与现有技术相比，提高了峰间可比性，做到了整体性与模糊性的科学处理，实现了图谱的数据化。
文档编号G06F17/00GK101256177SQ200710190089
公开日2008年9月3日 申请日期2007年11月21日 优先权日2007年11月21日
发明者邹纯才, 鄢海燕 申请人:皖南医学院