专利名称：一种中药组合物标准指纹图谱及其测定方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于中药分析领域，涉及一种中药组合物制剂的标准指纹图谱，本发明还涉及该标准指纹图谱的测定方法和该标准指纹图谱在本组合物质量控制中的应用。
背景技术：
本发明涉及的中药组合物是由川芎、天麻两味药按照一定比例组合后，采用水提取与醇提取相结合的工艺制备成的中药制剂，具有活血平肝、通络止痛的功效，瘀血阻络或肝阳上亢所致的头痛日久、痛有定处，或兼有头晕胁痛、失眠烦躁、舌质暗或有瘀斑；血管神经性头痛。为了更全面、有效的控制本中药组合物的质量控制水平，和国际接轨，让临床用药安全及疗效更加有所保证，需要对本中药组合物采用更为先进的质量控制手段。
由于中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法，但现行的显微鉴别、理化鉴别和含量测定等方法都不足以解决这一问题。中药指纹图谱是指某些中药材或中药制剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。所以，中药指纹图谱已经成为目前国际上较为先进的中药质量控制手段。本中药组合物还没有作为质量控制标准的指纹图谱公开报道。
美国食品药品管理局(FDA)植物药产品工业指南、WHO草药评价指南中均指出，如果草药制剂的活性成分不能鉴别，可以通过指纹图谱(fingerprint spectrum)证明产品质量的一致。欧共体在草药质量指南注释中也指出，草药及其制剂是以整体作为有效物质，因此，草药的质量稳定性仅靠测定已知的有效成分是不够的，应该通过指纹图谱显示其所含的各种成分。印度草药典、英国草药典、德国药用植物协会、加拿大药用及芳香植物协会等，也接受用指纹图谱来保证有效成分未明的草药产品质量的一致性。目前国家药品监督管理局对中药注射剂已要求具有相关的指纹图谱，对提高中药注射剂的质量起到了关键作用，但对其他剂型的中药尚没有强制性要求。
中药指纹图谱包括中药化学指纹图谱、蛋白指纹图谱、DNA指纹图谱及生物效应指纹图谱等。通常说的指纹图谱是指化学指纹图谱，是中药材、中药提取物或中成药经适当处理后，采用一定分析手段，得到的能够标示该中药主要化学成分特性的色谱或光谱。
中药化学指纹图谱可以分为中药光谱指纹图谱，如红外光谱(IR)、紫外光谱(UV)、X射线衍射图谱等；色谱指纹图谱，如薄层色谱(TLC)、气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、毛细管电泳图谱(CE)等；波谱指纹图谱，如质谱(MS)、核磁共振波谱(NMR)等；DNA指纹图谱；以及采用多种现代分析仪器联用得到的多维多息特征谱(characteristic fingerprint of muhrdimension andmuhrdata)，如HPLC/MS、HPLC/Ms/MS、GC/MS、CE/MS等。
中药指纹图谱研究方法虽然较多，但色谱学方法应是主流方法，尤其是TLC，HPLC和GC色谱技术，已经成为大家所公认的三种常规的分析手段，是目前研究中药指纹图谱应优先考虑的方法。
中药指纹图谱有两个作用一是通过指纹图谱的特征性，能有效鉴别中药材的真伪或产地二是通过指纹图谱主要特征峰的面积或比例的制定，能有效控制产品的质量，确保产品质量的相对一致。
中药指纹图谱的制作和应用通常包括(1)采集具有代表性的中药样品，采取适当的方法制备供试品溶液，并选用适当的标准标准品(参照物)，进行分析方法的优选；(2)根据确定的分析方法，对一定批次的中药样品进行分离分析，将所得的多批次数据进行处理，得到标准指纹图谱；(3)将样品按照与标准指纹图谱制作相同的方法进行样品处理、分离分析后，将所得的指纹图谱图谱与标准指纹图谱进行相似度比较，一般相似度达到80％以上即可视为该样品为合格。相似度的计算和评价方法通常采用相关系数与相合系数或夹角余弦法。我国中南大学、浙江大学等单位根据以上方法，编制了相应的计算机软件用于完成相似度评价，其中以国家药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”应用较多。
发明内容
本发明的目的是提供作为质量控制标准的一种中药组合物的标准指纹图谱。
本发明的另一个目的是提供本中药组合物标准指纹图谱的测定方法。
本发明还有一个目的是提供本中药组合物标准指纹图谱在中药制剂质量控制中的应用。
本发明的目的是通过下列措施实现的 本发明涉及的中药组合物标准指纹图谱，该指纹图谱为高效液相指纹图谱，共有2张图谱，指纹图谱1包括11个共有峰，各峰号的相对保留时间分别为(1)0.185±30％、(2)0.212±30％、(3)0.225±30％、(4)0.261±30％、(5)0.676±30％、(S)1、(6)1.195±30％、(7)1.244±30％、(8)1.625±30％、(9)1.771±30％、(10)1.798±30％；指纹图谱2包括14个共有峰，各峰号的相对保留时间分别为(1)0.117±30％、(2)0.160±30％、(3)0.256±30％、(4)0.599±30％、(5)0.678±30％、(6)0.751±30％、(7)0.801±30％、(8)0.857±30％、(9)0.925±30％、(S)1、(10)1.069±30％、(11)1.447±30％、(12)1.598±30％(13)1.628±30％。
S峰是参照物的色谱峰，其参照物为阿魏酸。
上述的标准指纹图谱，其特征在于所述中药组合物是通过下列方法制备得到的取川芎784g，天麻196g，粉碎，混合，用90％乙醇回流提取二次，每次2小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇并浓缩成相对密度为1.27～1.28的清膏I；药渣加水煎煮二次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成相对密度为1.27～1.28的清膏II，合并上述清膏I与清膏II，加入适量辅料，制成所需中药制剂。本中药制剂包括但不仅限于胶囊、软胶囊、片剂、丸剂、滴丸、颗粒剂的固体制剂和口服液、注射液的液体制剂。
所述的中药组合物产品标准指纹图谱的测定方法，该方法采用高效液相色谱法，其色谱条件为 色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱； 流动相为0.1％磷酸-甲醇水溶液系统，采用梯度洗脱； 流速为1mL/min； 柱温为20～40℃； 检测器采用紫外检测器，指纹图谱1的检测波长为270～280nm，指纹图谱2的检测波长为210～230nm； 理论板数按参照物阿魏酸峰计算，应不低于6000。
所述的中药组合物标准指纹图谱的测定方法，其中用于高效液相色谱测定的溶液采用浓度为25～100％的甲醇作溶剂。
所述的中药组合物标准指纹图谱的测定方法，其中用于高效液相色谱测定的供试品溶液采用50％甲醇作溶剂，参照物溶液采用甲醇作溶剂。
所述的中药组合物标准指纹图谱的测定方法，其中参照物溶液的制备是取阿魏酸适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含5μg的溶液，即得。
所述的标准指纹图谱的测定方法，供试品溶液的制备过程如下 本中药组合物胶囊剂、片剂、丸剂、滴丸、颗粒剂取本中药组合物内容物，混匀，研细，取约1g，置锥形瓶中，精密加入50％甲醇25mL，超声30min，过滤，取续滤液做为供试品溶液，即得 本中药组合物软胶囊取本中药组合物内容物，混匀，取约1g，置锥形瓶中，精密加入75％甲醇30mL，超声30min，滤过，取续滤液做为供试品溶液，即得； 本中药组合物口服液取本中药组合物，混匀，取约10mL，至烧瓶中，精密加入95％甲醇50mL，回流提取30min，滤过，取续滤液做为供试品溶液，即得。
本中药组合物注射液取注射液约10mL，至烧瓶中，加入95％甲醇50mL，充分搅拌，滤过，取续滤液做为供试品溶液，即得。
所述的标准指纹图谱的测定方法，其中梯度洗脱顺序为 时间(min) A％(0.1％磷酸) B％(甲醇) 0 85 15 5 85 15 55 5 95 60 5 95 所述的标准指纹图谱的测定方法，其中液相色谱仪采用高效液相色谱仪，采用紫外检测器，指纹图谱1的检测波长为276nm，指纹图谱2的检测波长为221nm，色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶。
所述的标准指纹图谱的测定方法，其中进样量为2μL～50μL。
所述的标准指纹图谱在以川芎和天麻为原料药材的中药组合物质量控制中的应用。
采用上述指纹图谱对样品检测，合格产品的标准为合格中药组合物的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度不低于0.80。比较样品指纹图谱与标准指纹图谱相似性的方法是采用夹角余弦法或相关系数法，其采用相应的计算机软件为国家药典委员会规定的中药色谱指纹图谱相似度评价系统。
本发明的有益效果 1、建立了2个波长下的指纹图谱，全面反映出本组合物的质量信息，从而能够达到更加全面、有效地控制本组合物制剂产品质量的目的。
2、对所测指纹图谱的辨认，采用国家药典委员会提供的中药色谱指纹图谱相似度评价系统，操作方便、快捷；而且，以此得出的相似度结果对制剂指纹图谱进行评价，结论较为客观、准确。
本发明参照中药注射剂指纹图谱的要求，对本发明涉及的中药组合物指纹图谱进行了研究，经过对供试品制备方法的考察及测定指纹图谱的仪器，色谱柱、流动相、检测波长等条件进行系统的优选，建立了指纹图谱测定条件并进行了方法学考察，在对多批本中药组合物指纹图谱检测结果的基础上，逐渐积累数据，提出了标准指纹图谱，作为本品指纹图谱标准，从而达到能够更全面、有效地控制制剂质量的目的。
对所测得的指纹图谱的辨认，本发明采用国家药典委员会提供中药色谱指纹图谱相似度评价系统做为本中药组合物指纹图谱相似度计算软件，经多次试验研究，且通过与计算相对保留时间及相对峰面积的方法相比较，所得出的评价结论基本一致，使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统评价指纹图谱的相似度，操作方便、快捷，以其得出的相似度结果，对制剂指纹图谱进行评价，结论较为客观、准确。
对本发明指纹图谱测定方法的研究与说明 1.参照物溶液的选择 选择阿魏酸作为参照物。
2.供试品溶液的制备 经实验筛选比较分析，确定本中药组合物指纹图谱测定供试品制备方法为 本中药组合物胶囊剂、片剂、丸剂、滴丸、颗粒剂取装量差异项下本中药组合物内容物，混匀，研细，取约1g，置锥形瓶中，精密加入50％甲醇25mL，超声30min，过滤，取续滤液做为供试品溶液，即得； 本中药组合物软胶囊取本中药组合物内容物，混匀，取约1g，置锥形瓶中，精密加入75％甲醇30mL，超声30min，滤过，取续滤液做为供试品溶液，即得； 本中药组合物口服液取本中药组合物，混匀，取约10mL，至烧瓶中，精密加入95％甲醇50mL，回流提取30min，滤过，取续滤液做为供试品溶液，即得。
本中药组合物注射液取注射液约10mL，至烧瓶中，加入95％甲醇50mL，充分搅拌，滤过，取续滤液做为供试品溶液，即得。
3.检测方法 仪器和试剂 仪器Agilent 1100液相色谱；MWD多波长紫外-可见检测器，G1313A全自动进样器，Agilent LC色谱工作站。色谱柱C18，4.6×250mm，5μm；流动相为0.1％磷酸和甲醇梯度洗脱； 洗脱顺序为 时间(min) A％(0.1％磷酸) B％(甲醇) 0 85 15 5 85 15 55 5 95 60 5 95 流速为1mL/min；检测波长为(1)276nm、(2)221nm。理论板数按参照物(阿魏酸)峰计算，应不低于6000。
试剂甲醇为色谱纯(Tedia company)，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
测定波长为了能更全面的反映制剂中的成分，经采用多个波长测定指纹图谱进行比较分析，确定276nm和221nm为制剂指纹图谱的检测波长，在该波长下的制剂指纹图谱中，其它成分指纹峰也能被较好地体现，且各峰分离度好，基线较平稳、重复性好。见图1、图2。
4.稳定性试验 取本中药组合物胶囊成品，按实施例1中供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，每隔一段时间测定一次其指纹图谱，结果见表1，表明供试品溶液成分稳定。
表1批号为040925的中药组合物胶囊成品稳定性相似度(波长276nm) 取本中药组合物胶囊成品，按实施例1中供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，每隔一段时间测定一次其指纹图谱，结果见表2，表明供试品溶液成分稳定。
表2 批号为061101的中药组合物胶囊成品稳定性相似度(波长221nm) 5.精密度试验 取本中药组合物胶囊成品，按实施例1中供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，连续进样进行测定。测定结果见表3。又以第1次进样所得指纹图谱做为对照计算后5次进样所得指纹图谱的相似度，测定结果见表4，表明该方法精密度良好。
表3 批号为040925的中药组合物胶囊成品指纹图谱精密度考察结果(波长276nm) (占总峰面积5％以上主要峰的保留时间)
表4 批号为040925的中药组合物胶囊成品精密度相似度(波长276nm) 取中药组合物胶囊成品，按实施例1中供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，连续进样进行测定。测定结果见表5。又以第1次进样所得指纹图谱做为对照计算后5次进样所得指纹图谱的相似度，测定结果见表6，表明该方法精密度良好。
表5 批号为061101的中药组合物胶囊成品指纹图谱精密度考察结果(波长221nm) (占总峰面积5％以上的主要峰的峰面积)
表6 批号为061101的中药组合物胶囊成品精密度相似度(波长221nm) 6.重复性试验 取批号本中药组合物，按实施例1中供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，同法制备供试品溶液，依法测定，测定结果见表7和表8，结果计算相似度，符合指纹图谱的技术要求。
表7 批号为040925的中药组合物胶囊成品重复性相似度(波长276nm) 表8 批号为061101的中药组合物胶囊成品重复性相似度(波长221nm) 根据以上方法学考察结果，表明该方法测定本中药组合物的指纹图谱，精密度、重复性、稳定性均较好，能够准确测定本组合物的指纹图谱。
7.大生产成品指纹图谱的测定 分别取本中药组合物胶囊成品，按照上述本发明提供的指纹图谱检测方法进行测定，测定结果见表9与表10，所得成品指纹图谱分别与标准指纹图谱1和2用相似度软件进行计算，结果相似度符合本中药组合物成品指纹图谱的规定。分析结果表明，不同批次间有较好的一致性。
表9 10批本发明组合物胶囊成品相似度(波长276nm) 表10 10批本发明组合物胶囊成品相似度(波长221nm)
图1中药组合物液相指纹图谱测定波长的选择。
图2中药组合物的指纹图谱HPLC-UV 3D图。
图3中药组合物标准指纹图谱(检测波长为276nm)。
图4中药组合物标准指纹图谱(检测波长为221nm)。
具体实施例方式 以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
实施例1指纹图谱测定 胶囊剂的制备方法如下 处方川芎784g 天麻196g 制法以上二味，粉碎，混合，用90％乙醇回流提取二次，每次2小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇并浓缩成相对密度为1.27～1.28的清膏I；药渣加水煎煮二次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成相对密度为1.27～1.28的清膏II，合并上述清膏I与清膏II，加入适量二氧化硅，真空干燥，粉碎，过筛，装入胶囊，制1000粒，即得。规格每粒装0.34g (1)指纹图谱1的检测 参照高效液相色谱法(中国药典2000版一部附录VI D)，结合指纹图谱的要求进行测定。
仪器Agilent 1100液相色谱；MWD多波长紫外-可见检测器； 色谱柱C18，4.6×250mm，5μm 流动相为0.1％磷酸和甲醇，梯度洗脱； 洗脱顺序为 时间(min) A％(0.1％磷酸) B％(甲醇) 0 85 15 5 85 15 55 5 95 60 5 95 流速为1mL/min；检测波长为276nm，柱温为30℃，理论板数按参照物(阿魏酸)峰计算，应不低于6000。
试剂甲醇为色谱纯(Tedia company)，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
参照物溶液的制备取阿魏酸标准品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含50μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备取本中药组合物胶囊剂内容物，混匀，研细，取约1g，置锥形瓶中，精密加入50％甲醇25mL，超声30min，过滤，取续滤液做为供试品溶液，即得。
测定法精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μL，分别注入液相色谱仪，测定。得到供试品指纹图谱，结果如下指纹图谱包括11个共有峰(峰号)相对保留时间分别为(1)0.188、(2)0.222、(3)0.221、(4)0.268、(5)0.682、(S)1、(6)1.188、(7)1.251、(8)1.618、(9)1.768、(10)1.789。
相似度计算软件为国家药典委员会规定的中药色谱指纹图谱相似度评价系统，经测定，与标准指纹图谱的相似度为0.90。
(2)指纹图谱2的检测 参照高效液相色谱法(中国药典2000版一部附录VI D)，结合指纹图谱的要求进行测定。
仪器Agilent 1100液相色谱；MWD多波长紫外-可见检测器； 色谱柱C18，4.6×250mm，5μm 流动相为0.1％磷酸和甲醇，梯度洗脱； 洗脱顺序为 时间(min) A％(0.1％磷酸) B％(甲醇) 0 8515 5 8515 555 95 605 95 流速为1mL/min；检测波长为221nm，柱温为30℃，理论板数按参照物(阿魏酸)峰计算，应不低于6000。
试剂甲醇为色谱纯(Tedia company)，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
参照物溶液的制备取阿魏酸标准品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含50μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备取本中药组合物胶囊剂内容物，混匀，研细，取约1g，置锥形瓶中，精密加入50％甲醇25mL，超声30min，过滤，取续滤液做为供试品溶液，即得。
测定法精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μL，分别注入液相色谱仪，测定。得到供试品指纹图谱，结果如下指纹图谱包括14个共有峰(峰号)相对保留时间分别为(1)0.115、(2)0.164、(3)0.259、(4)0.601、(5)0.675、(6)0.758、(7)0.810、(8)0.851、(9)0.928、(S)1、(10)1.701、(11)1.442、(12)1.602、(13)1.631。
相似度计算软件为国家药典委员会规定的中药色谱指纹图谱相似度评价系统，经测定，与标准指纹图谱的相似度为0.90。
实施例2标准指纹图谱1的获得。
10批本中药组合物胶囊成品，按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，依实施例1方法测定(检测波长为276nm)，结果计算相似度，结果见表11，用相似度软件中以这十七批供试品指纹图谱为基础获得“共有模式”作为标准指纹图谱，结果见图3。
表11本组合物胶囊成品十七批相似度(波长276nm) 实施例3标准指纹图谱2的获得。
10批本中药组合物胶囊成品，按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，依实施例1方法测定(检测波长为221nm)，结果计算相似度，结果见表12，用相似度软件中以这十批供试品指纹图谱为基础获得“共有模式”作为标准指纹图谱，结果见图4。
表12本组合物胶囊成品十批相似度(波长221nm) 实施例4产品质量控制标准的确定 采用国家药典委员会规定的中药色谱指纹图谱相似度评价系统，版本为2004版。
对实施例2所述10批成品指纹图谱与标准指纹图谱及实施例3所述十批成品指纹图谱与标准指纹图谱计算相似度，规定本中药组合物产品的指纹图谱与标准指纹图谱经相似度软件计算，相似度不低于0.80。
本品指纹图谱1的主要特征包括11个共有峰 (峰号)相对保留时间(1)0.185±30％、(2)0.212±30％、(3)0.225±30％、(4)0.261±30％、(5)0.676±30％、(S)1、(6)1.195±30％、(7)1.244±30％、(8)1.625±30％、(9)1.771±30％、(10)1.798±30％。
指纹图谱2包括14个共有峰，各峰号的相对保留时间分别为(1)0.117±30％、(2)0.160±30％、(3)0.256±30％、(4)0.599±30％、(5)0.678±30％、(6)0.751±30％、(7)0.801±30％、(8)0.857±30％、(9)0.925±30％、(S)1、(10)1.069±30％、(11)1.447±30％、(12)1.598±30％、(13)1.628±30％。
实施例5不同辅料及不同剂型对产品指纹图谱的影响。
1、咀嚼片 处方川芎784g 天麻196g 制法以上二味，粉碎，混合，用90％乙醇回流提取二次，每次2小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇并浓缩成相对密度为1.27～1.28的清膏I；药渣加水煎煮二次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成相对密度为1.27～1.28的清膏II，合并上述清膏I与清膏II，加入适量辅料(如二氧化硅、糊精、淀粉、磷酸盐、碳酸盐、甘露醇、山梨醇、山梨酸或钾盐、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖或甘露糖醇等稀释辅料中的一种或多种)混合，干燥，粉碎，得到细粉与适量的粘合剂(固体粘合剂如PEG200、PEG300、PEG400、PEG600、PEG800、PEG1000、PEG1500、高分子材料聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、低取代羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠等等或液体粘合剂如乙醇、淀粉浆、糊精浆等一种或多种)混合制颗粒，加入适量矫味剂(如甘露醇、蔗糖、木糖醇、甜菊糖、麦芽糖醇、薄荷脑、四丁醇、橙皮油、桂皮油、各种香精等一种或多种)、润滑剂(如硬脂酸镁、滑石粉、硬脂富马酸钠、月桂醇硫酸镁等一种或多种)、崩解剂(如羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙基纤维素、预胶化淀粉、微晶纤维素、大豆多糖、海藻酸、处理琼脂等一种或多种)整粒，总混，压制成1000片，即得。
参照实施例1的检测方法与供试品溶液的制备方法对上述制剂进行检测，其指纹图谱测定结果如下 指纹图谱1指纹图谱包括11个共有峰(峰号)相对保留时间分别为(1)0.147、(2)0.194、(3)0.209、(4)0.245、(5)0.57、(S)1、(6)1.084、(7)1.239、(8)1.323、(9)1.571、(10)1.591。与标准指纹图谱的相似度为0.90。
指纹图谱2指纹图谱包括14个共有峰(峰号)相对保留时间分别为(1)0.112、(2)0.167、(3)0.262、(4)0.611、(5)0.676、(6)0.754、(7)0.811、(8)0.852、(9)0.924、(S)1、(10)1.768、(11)1.441、(12)1.601、(13)1.634。与标准指纹图谱的相似度为0.90。
2、含片 处方川芎784g 天麻196g 制法以上二味，粉碎，混合，用90％乙醇回流提取二次，每次2小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇并浓缩成相对密度为1.27～1.28的清膏I；药渣加水煎煮二次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成相对密度为1.27～1.28的清膏II，合并上述清膏I与清膏II，加入适量辅料(如二氧化硅、糊精、淀粉、磷酸盐、碳酸盐、甘露醇、山梨醇、山梨酸或钾盐、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇及其他药剂学常用的稀释辅料等一种或多种)混合，干燥，粉碎，得到细粉与适量矫味剂(如甘露糖醇、蔗糖、木糖醇、甜菊糖、麦芽糖醇、薄荷脑、四丁醇、橙皮油、桂皮油、各种香精等一种或多种)混合，加入适量的粘合剂(固体粘合剂如PEG200、PEG300、PEG400、PEG600、PEG800、PEG1000、PEG1500、高分子材料聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、低取代羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠等等或液体粘合剂如乙醇、明胶浆、淀粉浆等一种或多种)制颗粒，加入润滑剂(如硬脂酸镁、滑石粉、硬脂富马酸钠等一种或多种)整粒，总混，压制成1000片，即得。
参照实施例1的检测方法与供试品溶液的制备方法对上述制剂进行检测，其指纹图谱测定结果如下 指纹图谱1指纹图谱包括11个共有峰(峰号)相对保留时间分别为(1)0.135、(2)0.192、(3)0.208、(4)0.224、(5)0.58、(S)1、(6)1.083、(7)1.151、(8)1.224、(9)1.468、(10)1.677。与标准指纹图谱的相似度为0.90。
指纹图谱2指纹图谱包括14个共有峰(峰号)相对保留时间分别为(1)0.113、(2)0.164、(3)0.264、(4)0.614、(5)0.674、(6)0.744、(7)0.841、(8)0.854、(9)0.924、(S)1、(10)1.748、(11)1.444、(12)1.604、(13)1.644。与标准指纹图谱的相似度为0.90。
3、口崩片 处方川芎784g 天麻196g 制法以上二味，粉碎，混合，用90％乙醇回流提取二次，每次2小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇并浓缩成相对密度为1.27～1.28的清膏I；药渣加水煎煮二次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成相对密度为1.27～1.28的清膏II，合并上述清膏I与清膏II，加入适量辅料(如二氧化硅、糊精、淀粉、磷酸盐、碳酸盐、甘露醇、山梨醇、山梨酸或钾盐、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇及其他药剂学常用的稀释辅料等一种或多种)混合，干燥，粉碎，得到细粉加入适量矫味剂(如甘露糖醇、蔗糖、木糖醇、甜菊糖、麦芽糖醇、薄荷脑、四丁醇、橙皮油、桂皮油、各种香精等一种或多种)、润滑剂(如硬脂酸镁、滑石粉、硬脂富马酸钠、月桂醇硫酸镁等一种或多种)、崩解剂(如羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙基纤维素、微晶纤维素、处理琼脂等一种或多种)直接压制成1000片，即得。
参照实施例1的检测方法与供试品溶液的制备方法对上述制剂进行检测，其指纹图谱测定结果如下 指纹图谱1指纹图谱包括11个共有峰(峰号)相对保留时间分别为(1)0.195、(2)0.245、(3)0.254、(4)0.295、(5)0.67、(S)1、(6)1.285、(7)1.459、(8)1.825、(9)1.975、(10)2.193。与标准指纹图谱的相似度为0.90。
指纹图谱2指纹图谱包括14个共有峰(峰号)相对保留时间分别为(1)0.116、(2)0.177、(3)0.266、(4)0.616、(5)0.666、(6)0.764、(7)0.817、(8)0.857、(9)0.926、(S)1、(10)1.766、(11)1.446、(12)1.606、(13)1.637。与标准指纹图谱的相似度为0.90。
4、口服液 处方川芎784g 天麻196g 制法以上二味，混合，用90％乙醇回流提取二次，每次2小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇并浓缩成相对密度为1.27(55～60℃)的清膏；药渣加水煎煮二次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液深缩成相对密度为1.27(55～60℃)的清膏，与上述清膏合并，加入到沸水里，热处理适当时间，冷藏，滤过，加入辅料娇味剂的如蔗糖、蜂蜜、木糖醇、甜菊糖、麦芽糖醇等一种或多种；防腐剂如山梨酸或钾盐、苯甲酸和丙酸等一种或多种；增溶剂如吐温系列等，抗氧化剂如亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠等等一种或多种)，滤过，灌封，制成1000mL，灭菌，即得。
参照实施例1的检测方法与供试品溶液的制备方法对上述制剂进行检测，其指纹图谱测定结果如下 指纹图谱1指纹图谱包括11个共有峰(峰号)相对保留时间分别为(1)0.218、(2)0.248、(3)0.278、(4)0.308、(5)0.84、(S)1、(6)1.389、(7)1.458、(8)1.829、(9)2.178、(10)2.299。与标准指纹图谱的相似度为0.90。
指纹图谱2指纹图谱包括14个共有峰(峰号)相对保留时间分别为(1)0.112、(2)0.172、(3)0.262、(4)0.611、(5)0.661、(6)0.761、(7)0.821、(8)0.852、(9)0.921、(S)1、(10)1.761、(11)1.442、(12)1.602、(13)1.632。与标准指纹图谱的相似度为0.90。
5、颗粒剂 处方川芎784g 天麻196g 制法以上二味，粉碎，混合，用90％乙醇回流提取二次，每次2小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇并浓缩成相对密度为1.27～1.28的清膏I；药渣加水煎煮二次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成相对密度为1.27～1.28的清膏II，合并上述清膏I与清膏II，加入适量辅料(如二氧化硅、糊精、淀粉、磷酸盐、碳酸盐、甘露醇、山梨醇、山梨酸或钾盐、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇等稀释辅料中的一种或多种)，干燥，粉碎，加入合适的粘合剂(固体粘合剂如PEG200、PEG300、PEG400、PEG600、PEG800、PEG1000、PEG1500、微晶纤维素等或液体粘合剂如乙醇、明胶浆、淀粉浆、糖浆等一种或多种)，制粒，整粒制成1000g，即得。
参照实施例1的检测方法与供试品溶液的制备方法对上述制剂进行检测，其指纹图谱测定结果如下 指纹图谱1指纹图谱包括11个共有峰(峰号)相对保留时间分别为(1)0.215、(2)0.245、(3)0.275、(4)0.293、(5)0.75、(S)1、(6)1.383、(7)1.553、(8)1.925、(9)2.173、(10)2.295。与标准指纹图谱的相似度为0.90。
指纹图谱2指纹图谱包括14个共有峰(峰号)相对保留时间分别为(1)0.115、(2)0.173、(3)0.263、(4)0.613、(5)0.665、(6)0.763、(7)0.825、(8)0.855、(9)0.923、(S)1、(10)1.763、(11)1.445、(12)1.605、(13)1.633。与标准指纹图谱的相似度为0.90。
6、软胶囊 处方川芎784g 天麻196g 制法以上二味，粉碎，混合，用90％乙醇回流提取二次，每次2小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇并浓缩成相对密度为1.27～1.28的清膏I；药渣加水煎煮二次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成相对密度为1.27～1.28的清膏II，合并上述清膏I与清膏II，加入适量辅料(如二氧化硅、糊精、淀粉、磷酸盐、碳酸盐、甘露醇、山梨醇、山梨酸或钾盐、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇等稀释辅料中的一种或多种)，干燥，粉碎，与合适的辅料(如PEG200、PEG300、PEG400、PEG600、PEG800、PEG1000、PEG1500、及植物油系列等；防腐剂如山梨酸或钾盐、苯甲酸和丙酸等；增溶剂如吐温系列等一种或多种，抗氧化剂如亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠等一种或多种)以任何方式混匀后，装入胶囊中，制成1000粒软胶囊，即得。
参照实施例1的检测方法与供试品溶液的制备方法对上述制剂进行检测，其指纹图谱测定结果如下 指纹图谱1指纹图谱包括11个共有峰(峰号)相对保留时间分别为(1)0.184、(2)0.223、(3)0.214、(4)0.255、(5)0.57、(S)1、(6)1.185、(7)1.257、(8)1.627、(9)1.775、(10)1.797。与标准指纹图谱的相似度为0.90。
指纹图谱2指纹图谱包括14个共有峰(峰号)相对保留时间分别为(1)0.097、(2)0.137、(3)0.215、(4)0.515、(5)0.567、(6)0.667、(7)0.727、(8)0.857、(9)0.915、(S)1、(10)1.365、(11)1.247、(12)1.407、(13)1.535。与标准指纹图谱的相似度为0.90。
7、注射液 处方川芎784g 天麻196g 制法以上二味，粉碎，混合，用90％乙醇回流提取二次，每次2小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇并浓缩成相对密度为1.27～1.28的清膏I；药渣加水煎煮二次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成相对密度为1.27～1.28的清膏II，合并清膏，混匀，干燥，得到中间体。取注射用水1000ml，煮沸，加入中间体，冷藏48小时，滤过，取滤液，煮沸45分钟，冷藏48小时，滤过，取滤液，加入0.5％的活性炭，煮沸3分钟，滤过，冷藏，取滤液，超滤(分子量30000)，取滤液，加注射用水补足到1000ml，灌封，灭菌，即得。
参照实施例1的检测方法与供试品溶液的制备方法对上述制剂进行检测，其指纹图谱测定结果如下 指纹图谱1指纹图谱包括11个共有峰(峰号)相对保留时间分别为(1)0.186、(2)0.224、(3)0.216、(4)0.254、(5)0.54、(S)1、(6)1.186、(7)1.254、(8)1.626、(9)1.774、(10)1.796。与标准指纹图谱的相似度为0.90。
指纹图谱2指纹图谱包括14个共有峰(峰号)相对保留时间分别为(1)0.134、(2)0.196、(3)0.299、(4)0.716、(5)0.764、(6)0.864、(7)0.924、(8)0.956、(9)0.986、(S)1、(10)1.564、(11)1.646、(12)1.886、(13)1.934。与标准指纹图谱的相似度为0.90。
8、滴丸 处方川芎784g 天麻196g 制法以上二味，粉碎，混合，用60％乙醇回流提取二次，第一次1.5小时，6倍量乙醇，第二次1小时，4倍量乙醇，合并提取液，减压干燥浓缩至无醇味，用水饱和正丁醇萃取，萃取液减压回收至相对密度1.30～1.35，减压干燥至无正丁醇味，用20倍量水混悬，用大孔吸附树脂吸附，然后用水洗脱树脂柱，再以30％乙醇对吸附树脂洗脱，收集洗脱液，浓缩，减压干燥，得浸膏粉。将聚乙二醇-4000与浸膏粉以3～6∶1～4的比例熔融混合，甲基硅油作冷却剂，滴制成滴丸，即得。
参照实施例1的检测方法与供试品溶液的制备方法对上述制剂进行检测，其指纹图谱测定结果如下 指纹图谱1指纹图谱包括11个共有峰(峰号)相对保留时间分别为(1)0.185、(2)0.228、(3)0.213、(4)0.259、(5)0.51、(S)1、(6)1.191、(7)1.259、(8)1.629、(9)1.771、(10)1.782。与标准指纹图谱的相似度为0.90。
指纹图谱2指纹图谱包括14个共有峰(峰号)相对保留时间分别为(1)0.112、(2)0.175、(3)0.264、(4)0.618、(5)0.663、(6)0.768、(7)0.821、(8)0.853、(9)0.929、(S)1、(10)1.760、(11)1.450、(12)1.611、(13)1.638。与标准指纹图谱的相似度为0.90。
取以上采用不同剂型及不同辅料的本中药组合物，参照实施例1的方法(检测波长分别为276nm及221nm)进行检测，其指纹图谱测定结果均符合指纹图谱1(检测波长为276nm)和指纹图谱2(检测波长为221nm)的要求，说明不同剂型及不同辅料对本中药组合物的指纹图谱没有影响，指纹图谱1和2可作为本中药组合物的标准指纹图谱。采用国家药典委员会规定的中药色谱指纹图谱相似度评价系统对上述不同辅料不同剂型的本中药组合物产品的指纹图谱与本中药组合物标准指纹图谱计算相似度，其结果均大于0.80。
权利要求
1、一种中药组合物的标准指纹图谱，其特征在于该指纹图谱为2个高效液相色谱图谱，各图谱中共有峰的特征为
指纹图谱1包括11个共有峰，各峰号的相对保留时间分别为(1)0.185±30％、(2)0.212±30％、(3)0.225±30％、(4)0.261±30％、(5)0.676±30％、(S)1、(6)1.195±30％、(7)1.244±30％、(8)1.625±30％、(9)1.771±30％、(10)1.798±30％；
指纹图谱2包括14个共有峰，各峰号的相对保留时间分别为(1)0.117±30％、(2)0.160±30％、(3)0.256±30％、(4)0.599±30％、(5)0.678±30％、(6)0.751±30％、(7)0.801±30％、(8)0.857±30％、(9)0.925±30％、(S)1、(10)1.069±30％、(11)1.447±30％、(12)1.598±30％、(13)1.628±30％；
S峰是参照物的色谱峰。
2、根据权利要求1所述的标准指纹图谱，其特征在于所述中药组合物是通过下列方法制备得到的取川芎784g，天麻196g，粉碎，混合，用90％乙醇回流提取二次，每次2小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇并浓缩成相对密度为1.27～1.28的清膏I；药渣加水煎煮二次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成相对密度为1.27～1.28的清膏II，合并上述清膏I与清膏II，加入适量辅料，制成所需中药制剂。
3、根据权利要求2所述的标准指纹图谱，其特征在于所述中药组合物的剂型为胶囊、软胶囊、片剂、丸剂、颗粒剂、滴丸、口服液、注射剂。
4、根据权利要求1所述的标准指纹图谱，其特征在于参照物为阿魏酸。
5、根据权利要求1所述的标准指纹图谱的测定方法，其特征在于该方法采用高效液相色谱法，色谱条件为
色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
流动相为0.1％磷酸-甲醇水溶液系统，采用梯度洗脱；
流速为1mL/min；
柱温为20～40℃；
检测器采用紫外检测器，指纹图谱1的检测波长为270～280nm，指纹图谱2的检测波长为210～230nm；
理论板数按参照物阿魏酸峰计算，应不低于6000。
6、根据权利要求5所述的标准指纹图谱的测定方法，其特征在于用于高效液相色谱测定的溶液采用浓度为25～100％的甲醇作溶剂。
7、根据权利要求6所述的标准指纹图谱的测定方法，其特征在于用于高效液相色谱测定的供试品溶液采用50％甲醇作溶剂，参照物溶液采用甲醇作溶剂。
8、根据权利要求7所述的标准指纹图谱的测定方法，其特征在于参照物溶液的制备是取阿魏酸适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含阿魏酸5μg的溶液，即得。
9、根据权利要求7所述的标准指纹图谱的测定方法，其特征在于供试品溶液的制备过程如下
本中药组合物胶囊剂、片剂、丸剂、滴丸、颗粒剂取本中药组合物内容物，混匀，研细，取约1g，置锥形瓶中，精密加入50％甲醇25mL，超声30min，过滤，取续滤液做为供试品溶液，即得；
本中药组合物软胶囊取本中药组合物内容物，混匀，取约1g，置锥形瓶中，加入75％甲醇30mL，超声30min，滤过，取续滤液做为供试品溶液，即得；
本中药组合物口服液取本中药组合物，混匀，取约10mL，至烧瓶中，加入95％甲醇50mL，充分搅拌，滤过，取续滤液做为供试品溶液，即得；
本中药组合物注射液取注射液约10mL，至烧瓶中，加入95％甲醇50mL，充分搅拌，滤过，取续滤液做为供试品溶液，即得。
10、根据权利要求5所述的本中药组合物标准指纹图谱的测定方法，其特征在于梯度洗脱顺序为
时间(min)A％(0.1％磷酸)B％(甲醇)
08515
58515
55 5 95
60 5 95
11、根据权利要求5所述的标准指纹图谱的测定方法，其特征在于采用高效液相色谱仪，采用紫外检测器，指纹图谱1的检测波长为276nm，指纹图谱2的检测波长为221nm，色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶。
12、根据权利要求5所述的标准指纹图谱的测定方法，其特征在于进样量为2μL～50μL。
13、权利要求1所述的标准指纹图谱在以川芎和天麻为原料药材的中药组合物质量控制中的应用。
14、根据权利要求13所述的应用，其特征在于合格中药组合物的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度不低于0.80。
15、根据权利要求14所述的应用，其特征在于用于比较中药组合物指纹图谱与标准指纹图谱相似性的方法是采用夹角余弦法或相关系数法。
16、根据权利要求15所述的应用，其特征在于用于比较产品指纹图谱与标准指纹图谱相似性的方法是采用国家药典委员会规定的中药色谱指纹图谱相似度评价系统。
全文摘要
本发明属于中药分析领域，公开了一种中药组合物标准指纹图谱及其测定方法和应用。该标准指纹图谱为2个高效液相色谱图谱，指纹图谱1如图3所示，指纹图谱2如图4所示。该标准指纹图谱可用于在以川芎和天麻为原料药材的中药组合物的质量控制，合格中药组合物的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度不低于0.80。该标准指纹图谱能全面反映出产品的质量信息，从而能够全面、有效地控制产品质量。对所测指纹图谱的辨认，采用国家药典委员会提供的中药色谱指纹图谱相似度评价系统，操作方便、快捷；而且，以此得出的相似度结果对制剂指纹图谱进行评价，结论较为客观、准确。
文档编号G01N30/86GK101639470SQ200810023159
公开日2010年2月3日 申请日期2008年7月29日 优先权日2008年7月29日
发明者伟 肖, 戴翔翎, 娅 凌, 王振中, 毕宇安, 秦建平, 章晨峰, 陈凤龙 申请人:江苏康缘药业股份有限公司