烯丙雌醇杂质的制备方法及其在烯丙雌醇质量分析中的应用
【专利摘要】本发明提供一种烯丙雌醇产生的杂质制备方法，该方法从原料和/或其制备过程中的反应液中，所制备的杂质标准品用于烯丙雌醇原料及其制剂分析检测。
【专利说明】
烯丙雌醇杂质的制备方法及其在烯丙雌醇质量分析中的应 用
技术领域
[0001] 本发明涉及分析化学领域，尤其涉及药物分析化学领域，特别涉及烯丙雌醇的杂 质制备和分析方法。
【背景技术】
[0002] 烯丙雌醇（Allylestrenol)化学名：（17 @ )-17_(2_丙烯）雌甾-4-烯-17-醇是 人工合成的孕激素，是合成的口服有效的孕酮类药物。烯丙雌醇作为合成孕激素早在1973 年开始运用于自然流产和早产的治疗，已在数十个国家上市。烯丙雌醇片由匈亚利吉瑞大 药厂（Gedeon Richter Ltd.)生产，于2000年在我国注册并进口上市，其商品名为：多力玛 (Turinal)。每片含烯丙雌醇5mg。本品在我国上市以来临床使用良好，受到欢迎，并已收入 我国基本医疗保险药品目录。
[0003] 烯丙雌留醇类化合物是一种留体化合物，该类化合物是环戊烷并多氢菲--甾核 衍生的一类化合物的总称，拥有多个手心中心及活性碳原子，环内双键位置易发生变化，同 时有加成、消除等反应发生，因此在化学反应过程中易发生很多副反应，产生许多与目标产 物相似的异构体。目前，国内几乎没有对此类杂质研究的报道，如何获得这些杂质在技术上 有较高的难度，这也是目前对此类杂质研究不多的重要原因。而杂质的研究是药品研发的 一项重要内容，它包括选择合适的分析方法，准确地分辨与测定杂质的含量并综合药学、毒 理及临床研究的结果确定杂质的合理限度。这一研究贯穿于药品研发的整个过程。由于药 品在临床使用中产生的不良反应除了与药品本身的药理活性有关外，有时与药品中存在的 杂质也有很大关系。所以规范地进行杂质的研究，并将其控制在一个安全、合理的限度范围 之内，将直接关系到上市药品的质量及安全性。对杂质研究的首要条件是得到杂质的样品， 因此制备或分离纯化杂质在杂质研究过程中显得十分重要，而对于未知杂质，纯化分离就 显得更为重要！
[0004] 烯丙雌醇最后的反应由雌烯酮和烯丙基溴通过格氏反应制得。反应式如下：
[0006] 国外有文献报道，在反应过程中会产生7种副反应产物，结构分别如下：
[0007]
【附图说明】
[0009] 图1 :粗纯化图谱
[0010] 图2 :二次纯化图谱
[0011] 图3 :杂质B样品检测图谱
[0012] 图4:烯丙雌醇检测图谱
[0013] 图5 :对照溶液图（0? 1% )
[0014] 图6 :烯丙雌醇及杂质分离度图谱
【发明内容】
[0015] 在制备烯丙雌醇样品过程中，经检测，发现除了有雌烯酮（杂质A)存在外 还有另一种未知杂质（杂质B)的存在，这种杂质会对烯丙雌醇原料药的质量产生 影响。通过LC/MS分析，确定了未知杂质的分子量为298,这与文献报道的化合物3， 6-Dehydro-allylestrenol 和 8 (14)-Dehydro-allylestrenol 分子量一致，因此，该杂质可 能是此两种化合物中的一种，也可能是其文献未报道的异构体。该未知杂质，是合成过程中 生成的副产物，而且结构未知，无法通过合成获得，最有效的而又快捷的方法是通过柱层析 分析纯化制得，而普通正向硅胶柱因柱压低，柱效差，无法有效分离杂质，因此，采用高压制 备液相系统纯化是最佳的选择。
[0016] 本发明的一个目的在于分离制备烯丙雌醇原料药中杂质B的标准品并且对杂质 进行结构鉴定。
[0017] 本发明的另一个目的在于将所制备的杂质B标准品用于该产品原料药及其制剂 的质量分析，同时也为工艺条件的选择提供参考，有利于生产过程中药品质量的控制。
[0018] 本发明的再一个目的在于提供烯丙雌醇原料的杂质B制备和分析方法，该方法用 于从制备烯丙雌醇原料药过程中分离制备所述杂质，并用于对烯丙雌醇及其制剂进行分 析。
[0019] 本
【申请人】对制备过程中处理的母液分别经制备液相纯化，制得该杂质的标准品， 并经结构确证,该杂质（杂质B)结构为：
[0020]
[0021] 中文通用名：A 3, 5-烯丙雌醇；3,6-二烯烯丙雌醇，简称"烯丙雌醇杂质B"
[0022] 中文化学名：（17 3)-17 a-(2-丙烯）雌甾-3, 5-二烯-17-醇
[0023] 英文通用名：A 3, 5_Dehydr〇-Allylestrenol ;3,6-Dehydr〇-allylestrenol
[0024] 英文化学名：（17 0 ) -17 a - (2-Propenyl) estr-3, 5-diene_17-〇l
[0025] 任何影响药物纯度的物质统称为杂质。杂质的研究是药品研发的一项重要内容。 它包括选择合适的分析方法，准确地分辨与测定杂质的含量并综合药学、毒理及临床研究 的结果确定杂质的合理限度。这一研究贯穿于药品研发的整个过程。药品中的杂质按其理 化性质一般分为三类：有机杂质、无机杂质及残留溶剂。按照其来源，杂质可以分为工艺杂 质（包括合成中未反应完全的反应物及试剂、中间体、副产物等）、降解产物、从反应物及试 剂中混入的杂质等。按照其毒性分类，杂质又可分为毒性杂质和普通杂质等。杂质还可按其 化学结构分类，如其它留体、其它生物碱、几何异构体、光学异构体和聚合物等。有机杂质包 括工艺中引入的杂质和降解产物等，可能是已知的或未知的、挥发性的或不挥发性的。由于 这类杂质的化学结构一般与活性成分类似或具渊源关系，故通常又可称之为有关物质。分 析方法的选择直接关系到杂质测定结果的专属性与准确性，因此，在进行杂质研究时首要 问题是选择合适的杂质分析方法。
[0026] 药物杂质检查分析方法应灵敏、专属。通过合适的分析技术将不同结构的杂质进 行分离、检测，从而达到对杂质的有效控制。随着分离、检测技术的发展与更新，高效、快速 的分离技术与灵敏、稳定、准确、适用的检测手段相结合，几乎所有的有机杂质均能在合适 的条件下得到很好的分离与检测。在质量标准中，目前普遍采用的杂质检测方法主要为 高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography ;HPLC)、薄层色谱法（Thin Layer Chromatography ;TLC)、气相色谱法（Gas Chromatography ;GC)和毛细管电泳法 (Capillary Electrophoresis ;CE)。近年来，质谱技术在药物杂质分析方面应用日益广泛， 气相色谱联用技术、液相色谱联用技术已经成为药物杂质分析的重要手段。
[0027] 本发明方法对原料药中的杂质进行分析、制备和结构确证，所制备的杂质标准品 可用于该产品原料药及其制剂的质量分析，同时也可以为工艺条件的选择提供参考，有利 于生产过程中药品质量的控制。
[0028] 本发明的杂质可通过以下方法制备得到。
[0029] 1、烯丙雌醇的制备过程
[0030] 将Mg(10g)、乙醚（50ml)、少许碘加入带回流冷凝管、搅拌的三口瓶内，搅拌下慢 慢滴加3-溴丙烯（33ml)乙醚（35ml)溶液（反应液很快回流，如不反应可加热引发），滴加 约1/3后，同时滴加原料雌烯酮（24g)乙醚（400)溶液，保持自然回流反应。继续加热回流 反应lh，冰水冷却下慢慢滴加浓HC1 (36ml)水（240ml)(反应剧烈，放出氢气），滴毕，搅拌 lh，分出乙醚层，水洗一次，无水Na2S0 4干燥，浓缩乙醚，加入60ml冰醋酸，加热溶解，冷却结 晶，过滤，抽干，得到白色固体（烯丙雌醇）。滤液浓缩干得固体，待用。
[0031] 2、杂质B的制备过程
[0032] 经HPLC分析，成品中包括2种杂质，一种为已知杂质（杂质A，反应原料），另一种 为未知杂质（杂质B)，该杂质的含量低于0. 1%，采用从成品中制备分离杂质的可行性不 强，但经对合成过程中的母液进行分析，该杂质的含量较高，含量为3%左右，故采用从合成 过程中处理过的母液中制备分离杂质。
[0033] 烯丙雌醇杂质的制备
[0034] 将上述步骤中滤液浓缩干后所得的固体经高压制备液相纯化、处理可得到高纯杂 质对照品，具体操作如下：
[0035] 纯化条件：
[0036]
[0037] 梯度洗脱比例：
[0038]
[0039] 具体操作步骤：
[0040] (1)粗纯化
[0041] 取2g浓缩至干得到的固体用42%流动相B超声溶解，注入纯化柱中，梯度洗脱，分 时段收集馏分，合并含杂质纯化液。经初步纯化，将多批次纯化得到的含杂质的组分合并， 得含杂质样品2g (杂质B粗品），纯度约65 %。
[0042] (2)二次纯化
[0043] 将所得杂质B粗品0. 5g用流动相溶解，注入纯化柱中，梯度洗脱。根据出峰时间， 分时段收集馏分（31_35min)。将多批次纯化得到的含杂质B的组分合并，浓缩至干，共得杂 质B 0? 6g，纯度约86%。（流动相：水：（乙腈：甲醇=8 : 2)体积比：10 : 90,）
[0044] (3)结晶
[0045] 将得到的杂质样品0. 6g用2ml乙腈加热至70-80°C溶解，0-KTC冷却结晶，过滤， 干燥得白色针状结晶130mg，纯度99. 17%。母液回收，浓缩结晶得固体100mg，纯度97%。 剩余二次母液蒸干后可继续纯化。
[0046] 上述纯化过程中的分析检测条件为：
[0047] 检测波长215nm
[0048] 柱温：30。。
[0049] 流动相：水：（乙腈：甲醇=8 : 2)体积比=10 : 90
[0050] 分析色谱柱：Phenomenex 250 X 4. 60mm Luna 5 u C 18
[0051] 所制得的杂质B样品，可作为杂质对照品用于烯丙雌醇原料及其制剂分析检测。
[0052] 3、烯丙雌醇的分析检测
[0053] 取本品约20mg，精密称定，置10ml量瓶中，加乙腈-水（8 : 2)溶解并稀释至刻度， 摇匀，作供试品溶液；精密量取供试品溶液适量，加乙腈-水（8 : 2)稀释制成每lml中约 含烯丙雌醇2JLS的溶液作为对照溶液（〇. 1);精密称取杂质A (雌烯酮）、杂质B ( A 3, 5-烯 丙雌醇）和烯丙雌醇适量，用乙腈溶解并稀释制成每lml中含A、B及烯丙雌醇各约15 y g 的混合溶液作为混合对照品溶液。照高效液相色谱法（中国药典_年版二部附录VD) 测定，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，加保护柱。流动相A为乙腈-甲醇（8 : 2);流 动相B为水；流速为每分钟1. 0ml ;检测波长为210nm。按下表进行线性梯度洗脱。理论板 数按烯丙雌醇峰计算不低于2000,杂质A、杂质B和烯丙雌醇的分离度应符合规定。精密量 取混合对照品溶液50 yl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使杂质峰的峰高为满量程的 10 % -20 %。再精密量取供试品溶液、对照溶液及混合对照品溶液各50 ill，注入液相色谱 仪，记录色谱图。
[0054] 限度要求：供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，其中杂质A和杂质B的量按外标法 以峰面积计算，分别不得过0. 15% ;其余单个杂质峰(梯度溶剂峰不计）的面积不得过对 照溶液主峰面积(〇 1% ),总杂质不得过1. 〇%。
实施例
[0056] 实施例1 :烯丙雌醇的制备过程
[0057] 将Mg(10g)、乙醚（50ml)、少许碘加入带回流冷凝管、搅拌的三口瓶内，搅拌下慢 慢滴加3-溴丙烯（33ml)乙醚（35ml)溶液（反应液很快回流，如不反应可加热引发），滴加 约1/3后，同时滴加原料雌烯酮（24g)乙醚（400ml)溶液，保持自然回流反应。继续加热回 流反应lh，冰水冷却下慢慢滴加浓HC1 (36ml)水（240ml)(反应剧烈，放出氢气），滴毕，搅 拌lh，分出乙醚层，水洗一次，无水Na2S0 4干燥，浓缩乙醚，加入60ml冰醋酸，加热溶解，冷 却结晶，过滤，抽干，得到白色固体（烯丙雌醇）。滤液浓缩干得固体，待用。
[0058] 实施例2、杂质B的制备过程
[0059] 将上述步骤中滤液浓缩干后所得固体经高压制备液相纯化、处理可得到高纯的的 杂质对照品，具体操作如下：
[0060] 纯化条件：
[0061]
[0062] 梯度洗脱比例：
[0063]
[0064] 具体操作步骤：
[0065] (1)粗纯化
[0066] 单次纯化取2g浓缩至干得到固体用42 %流动相B超声溶解，注入纯化柱中，梯度 洗脱，分时段收集馏分，合并含杂质B纯化液。
[0067] 经初步纯化，将5批次纯化得到的含杂质的组分合并，得含杂质样品2g (杂质B粗 品），纯化图谱如图1，经HPLC检测，纯度约65 %。
[0068] (2)二次纯化
[0069] 单次纯化将所得杂质B粗品0. 5g用流动相溶解，注入纯化柱中，梯度洗脱。根据 出峰时间，分时段收集馏分。
[0070] 将4批次纯化得到的含杂质B的组分合并，浓缩至干，共得杂质B 0. 6g，二次纯化 图谱如图2，经HPLC检测，纯度约86 %。
[0071] ⑶结晶
[0072] 将得到的杂质B样品0? 6g用2ml乙腈加热至70-80°C溶解，过滤，0-KTC冷却结 晶，过滤，干燥得白色针状结晶130mg，纯度99. 17%，HPLC检测图谱见图3。母液回收，浓缩 结晶得固体l〇〇mg，纯度97%。剩余二次母液蒸干后可按上述方法继续纯化。
[0073] 实施例3、杂质B用于烯丙雌醇的分析检测
[0074] 精密称定烯丙雌醇21. 52mg，，置10ml量瓶中，加乙腈-水（8 : 2)溶解并稀释至 刻度，摇匀，2. 152mg/ml，作供试品溶液；精密量取供试品溶液适量，加乙腈-水（8 : 2)稀 释制成每lml中含烯丙雌醇2. 152 ii g的溶液作为对照溶液（0. 1 % );精密称取杂质A (雌 烯酮）15. 84mg、杂质B ( A 3, 5-烯丙雌醇）16. 43mg和烯丙雌醇16. 67mg，用乙腈溶解并稀释 制成每lml中含A 15. 84 y g、B16. 43 y g、烯丙雌醇16. 67 y g的混合溶液作为混合对照品 溶液。照高效液相色谱法（中国药典2010年版二部附录VD)测定，用十八烷基硅烷键合 硅胶为填充剂，加保护柱。流动相A为乙腈-甲醇（8 : 2);流动相B为水；流速为每分钟 1.0ml ;检测波长为210nm。按下表进行线性梯度洗脱。理论板数按烯丙雌醇峰计算不低于 2000,杂质A、杂质B及烯丙雌醇的分离度应符合规定。精密量取混合对照品溶液50 ill注 入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使杂质峰的峰高为满量程的10% -20%。再精密量取供试 品溶液、对照溶液及混合对照品溶液各50 yl，注入液相色谱仪，记录色谱图，分别为图4、 图5、图6。
[0075] 供试品溶液的色谱图中含有杂质峰，其中杂质A和杂质B的量按外标法以峰面积 计算，杂质A为0. 08 %，杂质B为0. 06 %，其他最大单个杂质为0. 02 %，总杂质为0. 16 %。
[0076]
【主权项】
1. Λ 3, 5-烯丙雌醇和/或雌烯酮在烯丙雌醇产品质量检测中的用途。2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述检测使用HPLC方法进行。3. -种检测烯丙雌醇产品质量检测的方法，其特征在于，检测烯丙雌醇产品中Λ 3， 5-烯丙雌醇的含量。4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，用HPLC检测Λ 3, 5-烯丙雌醇的含量。5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述HPLC所采用的条件为： 流动相A为乙腈：甲醇=(7~9) : (3 : 1)，优选8 : 2 ; 流动相B为水； 流速为每分钟〇. 8~I. 2ml，优选1.0 ml ; 检测波长：200-230nm，优选210nm ; 梯度洗脱的时间如下：〇6. -种检测烯丙雌醇产品质量检测的方法，其特征在于，检测烯丙雌醇产品中雌烯酮 的含量。7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，用HPLC检测雌烯酮的含量。8. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述HPLC所采用的条件为： 流动相A为乙腈：甲醇=(7~9) : (3 : 1)，优选8 : 2; 流动相B为水； 流速为每分钟I. 〇ml，优选1.0 ml ; 检测波长：200-230nm，优选210nm ; 梯度洗脱的时间如下：O9. 一种检测烯丙雌醇产品质量检测的方法，其特征在于，检测烯丙雌醇产品中雌烯酮 和Λ 3, 5-烯丙雌醇的含量。10. 如权利要求9所述的方法，其特征在于，用HPLC检测雌烯酮和Λ 3, 5-烯丙雌醇的 含量。11. 如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述HPLC所采用的条件为： 流动相A为乙腈：甲醇=(7~9) : (3 : 1)，优选8 : 2; 流动相B为水； 流速为每分钟I. 〇ml，优选1.0 ml ; 检测波长：200-230nm，优选210nm ; 梯度洗脱的时间如下：〇12. -种烯丙雌醇的杂质的分析制备方法，其特征在于，对烯丙雌醇原料进行分析，并 从原料或制备原料过程中分离所述杂质，包括以下步骤： (a) 用HPLC/LC-MS法测定所述烯丙雌醇原料，根据被分析的相对保留时间和/或分子 量确定所述原料中的一种或多种杂质； (b) 根据步骤（a)所述的杂质相对保留时间所显示的色谱行为确定制备色谱法的条 件，用制备色谱法收集所述相对保留时间对应的杂质，采用反相硅胶柱层析法富集该相对 保留时间的杂质。 (C)根据步骤（b)所述的，富集的该相对保留时间的杂质，达到一定的纯度和收集量 后，采用结晶方法制得高纯度标准品。13. 根据权利要求12所述的方法，其特征在于，步骤（b)中所述的反相柱层析法富集采 用的固定相为十八烷基硅烷键合硅胶填料，流动相为乙腈、甲醇、水的组合。14. 根据权利要求12所述的方法，其特征在于步骤（b)包括： (1) 将样品溶解于一定比例的流动相后，湿法上柱； (2) 采用设定的梯度比例洗脱，接收含指定杂质的组分； (3) 合并含杂质B的组分备用。15. 根据权利要求12所述的方法，其特征在于步骤（b)所采用的制备色谱法所采用条 件包括：流动相：流动相A为水，流动相B为乙腈：甲醇=(60~90) : (40~10)，优选80 : 20 梯度洗脱比例： 柱温：10-4(TC，优选。Wi ; 检测波长：200-230nm，优选215nm ; 流速：20-60ml/分钟，优选40ml/分钟； 制备柱：Φ BOmm X (100 ~300mm)，C18,10 μ m。16. 根据权利要求12所述的方法，其特征在于步骤（b)所采用的分析方法为： 检测波长：200~230nm，优选215nm ; 柱温：10-40°C，优选 30°C ; 流速：〇. 8 ~I. 2mL/min (优选流速 1.0 mL/min); 分析色谱柱：Phenomenex 250 X 4. 60mm Luna 5 μ C18 流动相：水：（乙腈：甲醇=8 : 2)体积比：（0 : 100~20 : 80)，优先10 : 90。17. 根据权利要求12所述的方法，其特征在于步骤（c)包括： (1) 将所得杂质B用溶剂加热溶解； (2) 热滤，冷却结晶； (3) 过滤，干燥得到高纯度样品。18. 根据权利要求12所述的方法，其特征在于步骤（c)所采用的结晶条件为： (1) 采用的结晶溶剂为乙腈 (2) 乙腈用量为杂质B量的2-6倍，优选3-4倍； (3) 溶解温度为50-80°C，优选70-80°C ; (4) 结晶温度为-10-20°C，优选O-KTC。
【文档编号】G01N30/02GK105891342SQ201410619525
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年11月6日
【发明人】孙永强, 严益民, 屠永锐, 蒋伟, 钱明霞, 冯晓晖, 曹月华
【申请人】常州市第四制药厂有限公司