一种酱香型白酒中吡嗪类化合物的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种酱香型白酒中吡嗪类化合物的检测方法，属于白酒检测技术领 域。
【背景技术】
[0002] 近年来，人们对食品中含氮化合物的兴趣越来越浓厚。这主要是由于这类化合物， 尤其是吡嗪化合物，在构成食品风味方面有独特的作用，国内白酒界逐渐将这一类化合物 看成是构成白酒风味的重要成分之一，因为它们具有极低的风味阈值，还对其他香味物质 有明显的烘托叠加作用，可使白酒的香气更为丰满，对白酒的风味有重要贡献。
[0003] 对于中国白酒行业而言，在历经清香、浓香时代之后，酱香天下已然来临，越来越 多的消费者青睐酱香白酒。目前关于酱香型白酒中的香味成分研究成果较少，其主体香也 还没有定论，国内关于酱香型酒主体香味成分的说法主要有4种，其中吡嗪说愈来愈受到 界内人士的关注。吡嗪类化合物在其他香型白酒中也存在，但酱香型酒中吡嗪类化合物明 显高于其他香型，其大都具有焦香、糊香或类似"焙烤"、"酱油"的气味，是酱香型白酒中不 可缺少的重要香气组成。酱香型白酒中高温制曲、高温堆积工艺是生成吡嗪类化合物的重 要环节。若使用低温大曲作为糖化发酵剂或糟醅不经过高温堆积工序，所产出的酱香型白 酒的吡嗪类化合物含量则很低，酱香风格也很差。通过不同级别酱香调味酒的分析检测研 究表明，在多种微量成分中酸类、酯类、醇类、醛类、酮类无明显规律可循，只在合理范围内 波动。但吡嗪类物质却有规律地波动，横向对比，24批基础酒中的吡嗪类物质要比酱香调味 酒普级的低；纵向对比，酱香调味酒普级、优级、特级的吡嗪类物质呈上升趋势。从数据可以 看出吡嗪类化合物对酱香调味酒的感官特征有重要的影响。
[0004] 研究发现吡嗪不仅是白酒中特有的风味成分，也是白酒的重要功能因子，定性出 的白酒中有26种吡嗪类化合物。研究结果表明，酱香型和兼香型酒中吡嗪类化合物种类和 含量最高，在3000~6000 μ g/L ;浓香型次之；清香型白酒中吡嗪类化合物的含量及其种类 都是最少的。其中的四甲基吡嗪是从传统中药伞形科藻本属植物川芎中分离出来的一种活 性成分，已经被广泛用于心脏血管和脑血管疾病的治疗中。它能增加脑血管的血流量，减少 脑缺血性疾病的发作。国际上研究表明，四甲基吡嗪对中枢神经有影响，能改善学习的障 碍，还有防止由无水乙醇引起的胃黏膜损伤、由无水乙醇引起的肾中毒、由硫代乙酰胺引起 的急性肝中毒，并能降低脑萎缩的伤害。
[0005] 目前已有的关于白酒中吡嗪类化合物的检测方法主要是GC和GC-MS。两种方法 都是通过传统的液液萃取对酒样进行前处理，样品前处理步骤大概如下：取l〇〇〇mL酒样， 用12N浓盐酸将酒样酸度调pH至1，旋转蒸发浓缩至20mL，浓缩液用20mL重蒸乙醚在分 液漏斗中萃取三次，去掉醚层，水相用12N NaOH调pH至7,再用IN NaOH调pH至10,加入 NaCl饱和，再用20mL重蒸乙醚在分液漏斗中萃取三次，收集醚层，用5g无水硫酸钠干燥过 滤，滤液吹至0. 5mL，供GC或GC-MS分析。该法对于更深层次认识白酒中的吡嗪类化合物 有重要意义，但是定量具有一定的局限性，一是因为吡嗪类化合物已有标准品有限，大部分 发现的化合物没有标准品卖，只能做到半定量；二是整个前处理过程比较复杂，需要大量的 酒样，样品经过多次提取转移，影响定量的准确性。用该方法处理酒样，整个前处理时间将 近2天，步骤繁琐，用到大量的对人体有害的有机试剂，且将已有标样的吡嗪类物质进行加 标回收率试验，发现该前处理方法回收率不高，不适合作为常规的检测方法来使用。该类研 究主要通过酒样提取与质谱的NIST谱库进行比对，从而探索酒中含有的吡嗪化合物种类。 实验中发现，通过全扫描的方式在检测吡嗪类化合物的同时，也会受到酯类、醇类化合物的 干扰，使定量受到影响。
[0006] 2009年贵州茅台酒股份有限公司利用气相色谱-质谱-离子扫描联用法快速测 定白酒中4中吡嗪类化合物（中国酿造，2009, 204(3)，148~150)，该法酒样直接进样，测 定了茅台酒中含量较高是四种吡嗪化合物，即2-乙基-6-甲基吡嗪、2, 3, 5-三甲基吡嗪、 2, 3, 5, 6-四甲基吡嗪和2, 3-二甲基-5-乙基吡嗪，虽然缩短了样品的前处理时间，但是酒 样中含有的大量水分对质谱高真空系统来说有较大损伤，为了降低对仪器的损伤选择减小 进样量为0. 2 μ L，从而也降低了检测的灵敏度，四种化合物检出限为0. 2mg/L左右，所以该 法也只测定了茅台酒中含量相对较高的4种吡嗪化合物。
[0007] 用GC-NH)快速测定了白酒中吡嗪类化合物，酒样直接进样分析，定量了 7种吡嗪 化合物。但是从色谱图中可以看出，样品分析时基线漂移较大。根据我们的检测实践，这种 情况难以保证检测的精密度和准确度。
[0008] 随着样品提取技术的发展，顶空固相微萃取技术逐渐应用于酒类分析中。应用 HS-SPME和GC-MS分析了白酒大曲中微量挥发性成分，从大曲中定性23种吡嗪类化合物； 用HS-SPME与GC-FTD相结合，采用内标标准曲线法定量8种有标样的吡嗪类化合物：分别 为吡嗪、2-甲基吡嗪、2-乙基吡嗪、2, 5-二甲基吡嗪、2, 6-二甲基吡嗪、2, 3-二甲基吡嗪、 2, 3, 5-三甲基吡嗪和2, 3, 5, 6-四甲基吡嗪，8种吡嗪类化合物相对标准偏差在4. 09 %~ 11. 52%之间，其中对茅台酒和郎酒这两大酱香代表酒进行了定量，结果发现吡嗪和2-乙 基吡嗪在所测8种吡嗪中含量排在最后两位，而在酱香酒中含量较高的2-乙基-6-甲基 吡嗪和2, 3-二甲基-5-乙基吡嗪并没有在该研究中进行测定。该小组的专利中，酒样 需要重蒸水稀释到最终含酒精量为12% (v/v)，放入15ml的顶空瓶中，加入2gNaCl，插 入50 μπι/30 μπι的CAR/DVB/PDMS萃取头，置于50°C的恒温水浴中搅拌萃取40分钟，用 HS-SPME-GC-FTD内标法标准曲线法测定了九种吡嗪，他们是：吡嗪、2-甲基吡嗪、2-乙基 吡嗪、2, 5-二甲基吡嗪、2, 6-二甲基吡嗪、2, 3-二甲基吡嗪、2, 3-二乙基吡嗪、2, 3, 5-三甲 基吡嗪和2, 3, 5, 6-四甲基吡嗪。由其表一可以看出，该方法对这九种物质的测定中，对 于模拟酒样，相对标准偏差（RSD)值大于5%的有6个，对于郎酒和茅台酒，RSD值大于 5%的分别有6个和7个，说明该方法的重复性还有待提高。同样，在酱香酒中含量较高 的2-乙基-6-甲基吡嗪和2, 3-二甲基-5-乙基吡嗪在该专利中并没有涉及。另外，该小 组使用了火焰热离子检测器，该检测器适合对含氮磷化合物的检测，其通用性不佳。随后应 用了3?1^-6015-5頂联用检测白酒中含氮化合物，其中定量了2-甲基吡嗪、2,5-二甲基 吡嗪、2, 6-二甲基吡嗪、2, 3-二甲基吡嗪、2, 3, 5-三甲基吡嗪和2, 3, 5, 6-四甲基吡嗪六种 吡嗪类化合物，相对标准偏差在2. 3%~12. 2%之间，回收率在71. 76%~117. 98%之间。 HS-SPME-GC-FID检测可可麦汁中的三种吡嗪类化合物分别为2, 5-二甲基吡嗪、2, 3, 5-三 甲基吡嗪和2, 3, 5, 6-四甲基吡嗪，检测对象中没有涉及同分异构体，对色谱分离的要求不 高，从标样与样品的色谱图可以看出样品中峰比较多，很多峰是重叠在一起，对测定的干扰 较大。
[0009] 顶空固相微萃取（HS-SPME)是一种无需有机溶剂，集采样、萃取、浓缩、进样于一 体的前处理方法，相对早期的液液萃取方法要简便安全得多。但是该方法需要对萃取头进 行预处理或活化，同时还要对酒样进行稀释、盐析和调pH值等操作，需要较长的平衡和萃 取时间（1小时左右）。萃取温度、萃取时间以及酒样的离子强度这些都是影响萃取效果的 重要参数。另外，萃取纤维头的种类有限，选择性较差，受影响因素多，重复性也相对较差， 该方法对有些吡嗪检测的灵敏度、准确性和精密度还有待改进。
[0010] 因此建立一种操作简便，准确性和重复性能够得到保证的检测酱香型白酒中吡嗪 类化合物的方法，很有现实意义。
【发明内容】
[0011] 本发明的目的在于提供一种酱香型白酒中吡嗪类化合物的检测方法，本发明所 述的方法能同时测定酱香型白酒中的2-甲基吡嗪、2, 3-二甲基吡嗪、2, 5-二甲基吡嗪、 2, 6-二甲基吡嗪、2, 3, 5-三甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2, 3, 5, 6-四甲基吡嗪、2, 3-二 甲基-5-乙基吡嗪8种吡嗪类化合物。且本发明的方法对同分异构体的分离不需要使用手 性柱或手性添加剂，样品也不需要衍生化，前处理简单，方法灵敏度高，重复性好。
[0012] 为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案实现：
[0013] -种酱香型白酒中吡嗪类化合物的检测方法为：使用高效液相色谱-串联质谱的 检测方法对酱香型白酒中的吡嗪类化合物进行定性和定量分析。
[0014] 前述的酱香型白酒中吡嗪类化合物的检测方法，所述的吡嗪类化合物包括2-甲 基吡嗪、2, 3-二甲基吡嗪、2, 5-二甲基吡嗪、2, 6-二甲基吡嗪、2, 3, 5-三甲基吡嗪、2-乙 基-6-甲基吡嗪、2, 3, 5, 6-四甲基吡嗪和2, 3-二甲基-5-乙基吡嗪。
[0015] 前述的酱香型白酒中吡嗪类化合物的检测方法中，所述的高效液相色谱-串联质 谱的检测方法中样品前处理方法为：将酒样摇匀后，取2mL过0. 22 μ m滤膜，即得。
[0016] 前述的酱香型白酒中吡嗪类化合物的检测方法中，所述的高效液相色谱-串联 质谱的检测方法中高效液相色谱的检测条件为：色谱柱：苯基柱Gemini 5 μ C6 - Phenyl 110A 250mmX4.6mm;流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A :含0· 1%甲酸和0· 1% 三氟乙酸的水溶液；流动相B :甲醇；梯度洗脱流动相设置：按体积计算，Omin :含流动相A 95%，流动相B 5%;20min:流动相A 80%，流动相B 20%;25min:流动相A 55%，流动相B 45%;28min:流动相 A 95%，流动相 B 5%;35min:流动相 A 95%，流动 B 5%;流速：1.0mL/ min ;柱温：30°C ;进样量：10yL ;
[0017] 前述的酱香型白酒中吡嗪类化合物的检测方法中，所述的高效液相色谱-串联 质谱的检测方法中质谱的检测条件为：APCI离子源+参数：喷雾电压5500V，喷雾气、辅助 气、气帘气流量分别为60L/Hr、60L/Hr、35L/Hr，喷雾器温度为650°C ;MRM优化参数：2-甲 基吡嗪：检测离子对：95. 1/68. Γ，95. 1/54. 1，锥孔电压：65v，碰撞电压：25v，27v ;2,3_二 甲基吡嗪，2, 5-二甲基吡嗪，2, 6-二甲基吡嗪：检测离子对：109. 1/68. Γ，109. 1/82. 1， 锥孔电压：70v，碰撞电压：28v，27v ;2,3,5_三甲基吡嗪，2-乙基-6甲基吡嗪：检测离子 对：123. 1/82. 0' 123. 1/107. 0,锥孔电压：71v，碰撞电压：32v，35v ;2, 3, 5,6-四甲基吡 嗪，2, 3-二甲基-5-乙基吡嗪：检测离子对：137. 0/80. Γ，137. 0/121. 1，锥孔电压：65v，碰 撞电压：41v，38v。
[0018] 前述的酱香型白酒中吡嗪类化