一种半枝莲药材及其配方颗粒中野黄芩苷和野黄芩素的含量测定方法
【技术领域】
[0001] -种半枝莲药材及其配方颗粒中野黄芩苷和野黄芩素的含量测定方法。
【背景技术】
[0002] 半枝莲为唇形科植物Scutellaria barbata D. Don的干燥全草。是一种常用中 药，具清热解毒，化瘀利尿的功效。用于疔疮肿毒，咽喉肿痛，跌扑伤痛，水肿，黄疸，蛇虫 咬伤。主含黄酮类成分，如黄芩素、汉黄芩素、芹菜素、木犀草素、柚皮素、野黄芩苷、7-羟 基_5,8二甲氧基黄酮、7-羟基_5,8二甲氧基黄酮-7-0-β -D-葡萄糖苷、5、7、8、2_四羟 基黄酮-7-〇-i3-D-葡萄糖苷等，还含有一些二萜和三萜内酯类等。其质量标准在中国药 典2015年版一部半枝莲药材项下未收载薄层鉴别项目，收载了 2项含量测定，一项是以野 黄芩苷为指标，采用分光光度法，测定药材中的总黄酮含量；另一项是采用HPLC法，以甲 醇-水-醋酸（35 : 61 : 4)为流动相测定野黄芩苷的含量。查阅文献得知，目前半枝莲 药材及其制剂中都是以野黄芩苷为指标，采用药典的流动相，测定野黄芩苷含量的。也查阅 到同时测定野黄芩素、木樨草素和芹菜素的报道，但采用的是梯度洗脱，其相对含量都比较 低。目前还未查阅到采用等度洗脱，同时测定野黄芩苷与野黄芩素的报道。在上述背景情 况下，为简便、快捷、多指标控制半枝莲药材及其配方颗粒的质量，发明了采用普通色谱仪、 等度洗脱，同时测定半枝莲及其配方颗粒中的野黄芩苷和野黄芩素的含量。
[0003] 半枝莲药材配方颗粒的制备方法取半枝莲饮片13000-14000g，分别加水8倍量， 煎煮提取二次，每次1-2小时，滤过，滤液70°C减压浓缩，浓缩液喷雾干燥或70°C减压干燥， 加糊精适量，混匀，制粒成l〇〇〇g，分装，得半枝莲配方颗粒。
【发明内容】
[0004] 采用普通的等度洗脱，以体积比为12. 5 : 15-16. 2 : 71.3-72. 5的乙腈-甲 醇-0. 1%磷酸为流动相；柱温：30°C;在340±2nm处；同时测定了半枝莲药材及其配方颗粒 中野黄芩苷和野黄芩素的含量。方法简便、快捷，易于普及掌握；在三种不同的色谱柱上，各 波峰分离良好，基线平稳，在44分钟内出峰完毕。
[0005] 通过方法学考察，野黄芩苷的进样量在0. 0744~0. 744 μ g，与峰面积呈良好的 线性关系（见表1、图1)，回归方程为：Y = 44. 173X-0. 9457, r = 0. 9999 ;野黄芩素进样 量在0. 0516~0. 3612 μ g，与峰面积呈良好的线性关系（见表2、图2)，回归方程为：Y = 51. 554X-0. 184, r = 0.9999。采用加样回收实验，结果表明：野黄芩苷的平均回收率为 101. 18% (n = 9)，RSD为2. 67% (见表3);野黄芩素的平均回收率为101. 08% (η = 9)， RSD为1. 94% (见表4)。精密度（见表5)、稳定性（见表6)、重复性（见表7)、专属性（见 图3、4、5)与柱耐用性（见表8、图6、7、8)实验均符合方法学要求。适用于半枝莲药材及 其配方颗粒中野黄芩苷和野黄芩素的定量测定。
[0006] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：
[0007] (1)色谱条件与系统适用性试验以体积比为12. 5 : 15-16. 2 : 71. 3-72. 5的乙 腈-甲醇-〇. 1%磷酸为流动相；柱温：30°C;检测波长为340±2nm ;理论板数按野黄芩苷峰 计算应不低于3000 ;
[0008] (2)对照品溶液的制备分别取野黄芩苷和野黄芩素对照品适量，精密称定，置棕 色量瓶中，加 70 %甲醇制成每lml含野黄芩苷40 μ g，野黄芩素为12 μ g的溶液，作为对照 品溶液；
[0009] (3)供试品溶液的制备取半枝莲药材细粉0. 5g，精密称定；或半枝莲配方颗粒 0. lg，精密称定；分别置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25ml，密塞，称定重量，药材细粉 以功率250W，频率33kHz超声处理30分钟，配方颗粒以功率250W，频率33kHz超声处理10 分钟，放冷，再称定重量，用70 %甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取滤液用0.45 μ m的微 孔滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液；
[0010] (4)测定法分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各10 μ 1，注入液相色谱 仪，测定野黄芩苷和野黄芩素的含量。
[0010] 以岛津Wondasil C1S与迪马迪马Diamonsil C1S色谱柱，优选的半枝莲药材及其配 方颗粒的测定技术方案为：
[0012] (1)色谱条件与系统适用性试验以体积比为12.5 : 15 : 72.5的乙腈-甲 醇-0. 1 %磷酸为流动相；柱温：30°C;检测波长为340±2nm ;理论板数按野黄芩苷峰计算应 不低于3000 ;
[0013] (2)对照品溶液的制备分别取野黄芩苷和野黄芩素对照品适量，精密称定，置棕 色量瓶中，加 70 %甲醇制成每lml含野黄芩苷40 μ g，野黄芩素为12 μ g的溶液，作为对照 品溶液；
[0014] (3)供试品溶液的制备取半枝莲药材细粉0. 5g，精密称定；或半枝莲配方颗粒 0. lg，精密称定；分别置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25ml，密塞，称定重量，药材细粉 以功率250W，频率33kHz超声处理10分钟，配方颗粒以功率250W，频率33kHz超声处理30 分钟，放冷，再称定重量，用70 %甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取滤液用0.45 μ m的微 孔滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液；
[0015] (4)测定法分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各10 μ 1，注入液相色谱 仪，测定野黄芩苷和野黄芩素的含量。
[0016] 以安捷伦Agilent Eclipse Plus C1S色谱柱，优选的半枝莲药材及其配方颗粒的 测定技术方案为：
[0017] (1)色谱条件与系统适用性试验以体积比为12.5 : 16.2 : 71.3的乙腈-甲 醇-0. 1%磷酸为流动相；柱温：30°C ;检测波长为340±2nm ;理论板数按野黄芩苷峰计算 应不低于3000 ;
[0018] (2)对照品溶液的制备分别取野黄芩苷和野黄芩素对照品适量，精密称定，置棕色 量瓶中，加70%甲醇制成每lml含野黄芩苷40 μ g，野黄芩素为12 μ g的溶液，作为对照品 溶液；
[0019] (3)供试品溶液的制备取半枝莲药材细粉0. 5g，精密称定；或半枝莲配方颗粒 0. lg，精密称定；分别置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25ml，密塞，称定重量，药材细粉 以功率250W，频率33kHz超声处理30分钟，配方颗粒以功率250W，频率33kHz超声处理10 分钟，放冷，再称定重量，用70 %甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取滤液用0.45 μ m的微 孔滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液；
[0020] (4)测定法分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各10 μ 1，注入液相色谱 仪，测定野黄芩苷和野黄芩素的含量。
[0021] 本发明的原理如下：
[0022] 野黄芩苷及野黄芩素是苷与苷元的关系，都是黄酮类化合物，含多个多酚羟基，易 溶于含水醇，二者光谱吸收图一致，都在288 ± 2nm和340 ± 2nm有最大吸收（见图9、10)，但 340nm处灵敏度高，所以以340nm为检测波长，进行含量测定。直接以含水甲醇超声提取药 材或配方颗粒中的野黄芩苷及野黄芩素，滤过后，进样即可。无萃取、无蒸干、简便、快捷、实 用。通过调整乙腈、甲醇与0. 1%磷酸的体积比，使2种成分在3种不同的色谱柱上，44分 钟内出峰完毕。再依据该2种成分的进样量在一定范围内，与其峰面积呈现良好的线性关 系，而用于定量测定。
[0023] 本发明的创新点及有益效果如下：
[0024] (1)采用普通等度洗脱、反相色谱柱，以体积比为12-12. 5 : 15-16. 2 : 71. 3-72. 5 的乙腈-甲醇-0. 1%磷酸为流动相；同时测定了半枝莲药材及其配方颗粒中的野黄芩苷及 野黄芩素的含量。通过调整流动相的比例，使2种成分在三种不同的色谱柱上，44分钟出峰 完毕，各波峰分离良好。野黄芩苷和野黄芩素的同时定量测定尚属首次报道。实现了简便、 快捷、科学、规范、双指标控制药材与其配方颗粒质量的愿望。
[0025] (2)半枝莲药材因含多种性质近似的黄酮类，要得到分离度良好的多种黄酮成分 的色谱峰，必须通过色谱柱的多因素耐用性试验研究。本发明获得在三种不同的色谱柱上， 都分离良好的色谱条件（见图6、7、8)。克服了药典一部半枝莲药材项下收载的含量测定 条件，无法将野黄芩苷及野黄芩素波峰有效分离（见图11)，而导致无法准确定量测定的弊 端，确保了含量结果的准确性与重现性。
[0026] (3)本发明与中国药典2015年版一部半枝莲药材项下的样品前处理程序比较，药 典方法较繁琐、费时，仅样品提取就需要6-7小时，花费石油醚与甲醇225ml ;而本发明药材 提取花费0.5小时，70%甲醇25ml ;配方颗粒花费10分钟，70%甲醇25ml。以含水甲醇取 代石油醚和甲醇，不但减少了脂溶性成分提出，而且利于测定结束后，色谱柱的冲洗保护。 充分体现了本发明的进步与显著的实用效果。
[0027] (4)在野黄芩苷及野黄芩素的含量上，本