专利名称：一种从克氏原螯虾虾壳中提取dna的方法
技术领域：
本发明属于水产动物分子生物学DNA样品制备技术领域，具体涉及一种从克氏原螯虾虾壳中提取DNA的方法。本发明制备的DNA可以用于克氏原螯虾种群遗传多样性分析及相关分子生物学应用。
背景技术：
克氏原螯虾(Procambarus clarkii)，隶属于甲壳纲，十足目，螯虾科，原螯虾属， 原产于墨西哥北部和美国南部，现已成为世界上著名的入侵物种之一。由于其个体较大，适应性强，能忍受长达4个月的枯水期，繁殖率高，可形成单优势种群，压制、排挤或破坏本地物种，危及到本地物种的生存安全，影响入侵地生物多样性。然而，由于其较高的经济价值， 克氏原螯虾已成为我国一个重要的淡水经济养殖品种。为防止该入侵物种借助人工养殖的作用继续扩散，应积极开展其种群调节和控制的各项研究，以最大化地消除其入侵的负面影响，提高其经济价值。近年来此类研究主要集中在克氏原螯虾在我国的种群遗传多样性、 种群遗传结构、与抗逆性相关基因以及分子标记等方面，而采集样本和提取样本DNA是这些相关研究的基础。目前，不仅克氏原螯虾，其它虾也多是采集尾肌作为样本DNA的来源，尚未见到以虾壳为样本DNA来源的报道。以虾尾肌为样本DNA来源具有如下缺点1.虾尾肌在采集和保存的过程中容易发生不同程度的腐败(肉离体后一般会经历肉的僵直、肉的成熟、肉的腐败三个连续变化过程，猪肉和鸡肉等畜禽肉一般经历前两阶段的时间较长，而虾鱼肉一般经历前两个阶段的过程很短，极易进入腐败过程)，其所含DNA也会随之发生一定程度的降解，夏季采样时此种现象尤为明显；2.取虾尾肌往往需要处死虾，因此对于有些种用虾或者还需要继续饲养以进行后续实验的虾来说，取尾肌则是行不通的；3.如果在采样过程中虾尾肌发生污染，则污染源无法剔除。若以虾壳为样本DNA来源则可克服以上缺点，具有较强的应用性。然而，由于虾壳坚硬，很难裂解，再加上虾壳中含有丰富的甲壳素在提取过程中很难洗涤干净，目前亦尚未见到从虾壳中成功提取DNA的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种从克氏原螯虾的虾壳中提取DNA的方法，该种方法操作方便，所用试剂毒性较小，其样本取样时对实验动物伤害小，样本易长期保存，且提取的DNA 降解程度比从肌肉中提取的DNA降解程度低，经过检测和检验能满足后续相关实验研究的需要。实现本发明的技术方案如下一种从克氏原螯虾的虾壳中提取DNA的方法，包括以下步骤1)取克氏原螯虾虾壳50mg，用滤纸吸干后置入2ml的离心管中，用剪刀将虾壳剪碎；2)向步骤1)的离心管中加入500 μ L的组织裂解液，0. 5Μ的EDTA60 μ L，IM的二硫苏糖醇40 μ L和20mg/mL的蛋白酶K 10 μ L，于65°C下水浴4_5h，期间每隔0. 5 Ih摇勻一次，得到样品1 ；3)将步骤2)的样品1取出置冰上冷却后，加入7. 5M的乙酸铵200 μ L，充分混勻， 冰上冷却5min，得到样品2 ；4)将步骤3)的样品2用冷冻离心机于4°C，12000rpm,离心IOmin后，吸取上清液
移入另一离心管中，重复步骤幻，得到样品3 ；5)用冷冻离心机将步骤4)中的样品3于4°C，12000rpm下离心IOmin后，取上清液移入另一离心管中，按体积比加入1 1. 5倍的异丙醇，轻轻摇动1 2min，得到样品4 ；6)采用冷冻离心机将步骤5)中的样品4于4°C，12000rpm下离心IOmin后，弃去上清，得DNA沉淀样品1 ；7)将步骤6)中的沉淀加入浓度为70%的乙醇ImL进行洗涤，用冷冻离心机于4°C 下12000rpm，离心IOmin后弃去上清，得到DNA沉淀样品2 ；8)将步骤7)中的沉淀加入无水乙醇ImL进行洗涤，用冷冻离心机于4°C下 12000rpm,离心IOmin后弃去上清，得到DNA沉淀样品3 ；9)将步骤8)的DNA沉淀样品3于室温置于敞开的离心管内直至可见的痕量的乙醇挥发殆尽(注意不要使样品长时间干燥，否则很难溶解)后，加入20-40 μ L灭菌双蒸水， 置于4°C冰箱12-24h直至DNA样品完全溶解，得到克氏原螯虾总DNA溶液。其中步骤2)所述的组织细胞裂解液组分如下100mM Tris-HCl, pH 8. 0 ；50mM EDTA, PH 8.0 十二烷基硫酸钠。本发明具有以下优点1.本发明中使用的试剂毒性比常规的酚氯仿法提取DNA所用试剂的毒性要小，且能从坚硬的外壳中提取出足够浓度和高质量的DNA以满足后续相关实验的需求。2.本发明中利用的虾壳属于虾体中的坚硬组织，因为坚硬的外层对于时间和外界环境因素有很强的抵抗力，可防止内层的DNA分子受到破坏，同时能够有效地防止外源性 DNA的污染。此外，外表坚硬的组织即便采取洗、刮、磨等手段，也不会破坏内层的DNA分子， 能更彻底地去除外源性DNA的污染。3.本发明中采用无水乙醇保存虾壳，经无水乙醇浸润过的虾壳取出吸干后用剪刀很容易剪碎，不需要粉碎或研磨，简单方便，易于操作。4.因虾壳DNA分子有坚硬的外层保护，其取材后样本保存时间会比肌肉取材样本要长得多，所以从其内提取的DNA的降解程度较低。从图1中可见琼脂糖检测虾壳DNA的拖带现象没有肌肉DNA的严重，可见从虾壳提取的DNA的降解程度比从虾尾肌中提取DNA 的降解程度低。5.克氏原螯虾的螯足具有再生功能，若以部分螯足作为DNA来源样本，可以在不处死克氏原螯虾的情况下获取DNA，同时可以继续饲养和观测其生长。
图1 琼脂糖检测不同个体虾尾肌和虾壳DNA的降解情况。图中M为marker (1Kb DNA ladder) ；1,3和5为肌肉组织DNA ；2、4和6为外壳DNA0
图2 对分别以虾壳DNA和虾尾肌DNA为模板的PCR产物检测。图中M为 marker (DL2000) ； 1为以虾尾肌DNA为模板的PCR产物；2为以虾壳DNA为模板的PCR产物。图3 以引物PCLG-09扩增的部分群体的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。图中M为 marker (pucl8DNA/MspI)；其余泳道为引物PCLG-09对群体中部分个体DNA的扩增结果。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步阐述本发明，但是实施例不会构成对本发明的限制。实施例1提取克氏原螯虾虾壳DNA从市场购买新鲜的克氏原螯虾，取其部分虾壳，置于无水乙醇中浸泡保存(保存时间为一个月)1)试剂配制A)组织细胞裂解液=IOOmM Tris-HCl, pH 8. 0 ；50mM EDTA, pH 8. 0 ；十二烷基硫酸钠(SDS)；B) 0. 5M EDTA :23. 3g 二水乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na · 2H20)溶于 IOOmL 双蒸水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，搅拌的同时加入NaOH调节pH值至8. 0，然后高压蒸汽灭菌 (121°C，灭菌20min)，常温保存(注二水乙二胺四乙酸二钠需加入NaOH将溶液的pH值调至8. 0时才会溶解)。C) IM 二硫苏糖醇(DTT)在二硫苏糖醇5g的原装瓶中加32. 4mL水，分成小份贮存于-20 °C ；D)20mg/mL蛋白酶K 在IOOmg蛋白酶K的原装瓶中加入5mL灭菌双蒸水，分成小份贮存于-20°C ；E)7. 5M乙酸铵50mL双蒸水中加入28. 9g乙酸铵，用0. 22um孔径的滤膜过滤除菌；F) 70%乙醇70mL的无水乙醇加上30mL的灭菌双蒸水配成100mL70%乙醇溶液，
4°C贮存。G)其它试剂如异丙醇等直接冷藏备用。2)按以下步骤提取DNA ①取约50mg外壳(经无水乙醇保存)，用滤纸吸干后置入2ml离心管，用剪刀将虾壳充分剪碎；②加入500 μ L的组织细胞裂解液、60 μ L的EDTA、 40 μ L的DTT和10μ L的蛋白酶K(20mg/mL)；③56°C水浴过夜或65°C 4_5h，期间每隔0. 5 Ih摇勻一次；④拿出冷却至室温或置冰上冷却，加入200 μ L的乙酸铵，充分混勻，冰上冷却5min或置4°C IOmin ；⑤4°C，12000rpm，lOmin，然后吸取上清液移入另一新的离心管， 加入200 μ L的乙酸铵，充分混勻，冰上冷却5min或4°C IOmin ；⑥4°C，12000rpm，IOmin ； 然后吸取上清液移入另一新的离心管，加入约1 1.5倍上清液体积的异丙醇，轻轻摇动 1 anin ；⑦4°C，12000rpm, IOmin,弃去上清，留沉淀；⑧加入70%乙醇Iml进行洗涤，4°C， 12000rpm, IOmin ；⑨弃去上清，加入无水乙醇Iml进行洗涤，4°C，12000rpm，IOmin ；⑩室温晾干，加入40 μ L的ddH20，-20°C贮存备用。实施例2按照实施例1的步骤，其中克氏原螯虾虾壳是用无水乙醇保存为3个月的材料。
实施例3按照实施例1的步骤，其中克氏原螯虾虾壳是用无水乙醇保存为6个月的材料。实施例4两种提取DNA方法的比较本实施例通过采用实施例1方法提取虾壳DNA，与常规的酚氯仿法(萨姆布鲁克， 黄培堂译，《分子克隆实验手册》第三版，科学出版社，200 提取虾尾肌DNA (组织部位不同，但是提取的DNA个体相同)的结果比较，验证了从虾壳中提取的DNA纯度和浓度同样可以满足后续相关实验的要求。克氏原螯虾群体30尾个体，雌雄各15尾，分别取虾壳和虾尾肌做样本，无水乙醇分装保存。取虾壳和虾尾肌用滤纸吸干后，按本发明方案从虾壳中提取DNA，并用常规酚氯仿法(萨姆布鲁克，黄培堂译，《分子克隆实验手册》第三版，科学出版社，200 从虾尾肌中提取DNA，提取的部分样本DNA用1. 0%琼脂糖凝胶检测结果见图1，提取的全部样本DNA均用仪器NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific)检测其纯度和浓度，结果见表1 :表1克氏原螯虾虾壳DNA和虾尾肌DNA样本的浓度和纯度检测结果
权利要求
1.一种从克氏原螯虾的虾壳中提取DNA的方法，其特征包括以下步骤1)取克氏原螯虾虾壳50mg，用滤纸吸干后置入2ml的离心管中，用剪刀将虾壳剪碎；2)向步骤1)的离心管中加入500μ L的组织裂解液，0. 5Μ的EDTA60 μ L，IM的二硫苏糖醇40 μ L和20mg/mL的蛋白酶K 10 μ L，于65°C下水浴4_5h，期间每隔0. 5 Ih摇勻一次，得到样品1 ；3)将步骤2)的样品1取出置冰上冷却后，加入7.5M的乙酸铵200 μ L，充分混勻，冰上冷却5min，得到样品2 ；4)将步骤3)的样品2用冷冻离心机于4°C，12000rpm,离心IOmin后，吸取上清液移入另一离心管中，重复步骤3)，得到样品3 ；5)用冷冻离心机将步骤4)中的样品3于4°C，12000rpm下离心IOmin后，取上清液移入另一离心管中，按体积比加入1 1. 5倍的异丙醇，轻轻摇动1 2min，得到样品4 ；6)采用冷冻离心机将步骤5)中的样品4于4°C，12000rpm下离心IOmin后，弃去上清， 得DNA沉淀样品1 ；7)将步骤6)中的沉淀加入浓度为70%的乙醇ImL进行洗涤，用冷冻离心机于4°C下 12000rpm,离心IOmin后弃去上清，得到DNA沉淀样品2 ；8)将步骤7)中的沉淀加入无水乙醇ImL进行洗涤，用冷冻离心机于4°C下12000rpm， 离心IOmin后弃去上清，得到DNA沉淀样品3 ；9)将步骤8)的DNA沉淀样品3于室温置于敞开的离心管内，待乙醇挥发干净后，加入 20-40 μ L灭菌双蒸水，置于4°C冰箱12-24h直至DNA样品完全溶解，得到克氏原螯虾总DNA 溶液。其中步骤2)所述的组织细胞裂解液组分如下100mM Tris-HCl, pH 8.0 ；50mM EDTA, pH 8.0 十二烷基硫酸钠。
2.权利要求1所述的方法在克氏原螯虾种群遗传多样性分析中的应用。
全文摘要
本发明属于水产动物分子生物学DNA样品制备技术领域，具体涉及一种从克氏原螯虾虾壳中提取DNA的方法。其步骤为将浸泡在乙醇溶液中的克氏原螯虾虾壳剪碎，向离心管中加入适量组织裂解液、EDTA、二硫苏糖醇和蛋白酶K等，经水浴裂解、乙酸铵抽提等步骤，得到克氏原螯虾总DNA。本发明具有操作简单、方便，所用试剂毒性较小，样本取样时对实验动物伤害小，样本易长期保存，且提取的DNA降解程度比从虾尾肌中提取的DNA降解程度低。本发明制备的DNA可以用于克氏原螯虾种群遗传多样性分析及相关分子生物学应用。
文档编号C12N15/10GK102477423SQ201010564558
公开日2012年5月30日 申请日期2010年11月24日 优先权日2010年11月24日
发明者刘肖莲, 张 杰, 李艳和, 王卫民, 罗伟 申请人:华中农业大学