专利名称：一株产黑色素的大肠杆菌工程菌9f2及其所产生的4hppd酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株转化了从深海宏基因组文库中克隆得到的4HPPD酶的大肠杆菌 9F2，该工程菌表达4HPPD酶，4-羟基苯丙酮酸在该酶的作用下生成尿黑酸，尿黑酸通过氧化和多聚化生成黑色素。
背景技术：
黑色素包括两大类，一大类是酪氨酸、多酚及它们相关化合物代谢最终产物；黑色素另外一大类属于花色昔类而显黑色色素，主要分布在植物中。第一类黑色素是复杂黑色高聚物，自然界中基本上可分为三类即真黑色素、棕黑素和异黑素。真黑色素含氮，不含硫原子，颜色为深棕色或黑色棕黑素含氮和硫原子，颜色为略带红色的棕色或黄色异黑素呈棕色或黑色，主要存在于植物中。按照碱解或氧化降解产物来看，可将黑色素分为吲哚构架和儿茶酚构架两种。黑色素能作为紫外线吸收剂、抗氧化剂和新型天然药物载体，用以治疗某些与黑色素缺乏有关神经系统疾病，如着色性干皮病、帕金森氏症、老年性痴呆症、亨廷氏舞蹈病等。黑色素有很大应用潜力，如在化妆品或染发剂装饰作用方面、清除自由基、生物杀虫剂光保护等，一些可溶性黑色素在体外对HIV病毒有显著抑制作用，抗流感病毒，诱导细胞凋亡。在很多霉菌、细菌、放线菌等能产生黑色素，如黑曲霉，它在生成抱子同时分泌黑色素。一般认为黑色素不是微生物生长、代谢、繁殖所必须，但黑色素能提高微生物抗重金属毒害，抗紫外及射线损害，抗氧化，从而增强其生存能力。由于黑色素产品的特性以及我国的特殊国情，我国黑色素市场具有不同于国外市场、不同其他色素产品市场的特征。我国黑色素企业数量较少，规模不大，因此总体规模不大。近年来，随着食品添加剂工业的迅速发展，国外市场对黑色素的需求量正逐年增加。近年来我国人们生活水平不断提高，对健康食品更加重视，尤其是天然黑色素在食品中的应用，必将促使黑色素的需求量大幅度增加，其市场前景十分看好。2009年国内工业形势好转，对黑色素的需求好转，全年黑色素行业市场规模达到了 21921万元。今后随着需求量的增加和产品价格的不断走高，其市场规模将进一步增大，预计到2015年黑色素市场规模将达到40880万元。目前，我国黑色素的产能规模已经超过了 2000吨。初步估计，2010年中国黑色素的生产能力将超过2100吨，达到2150吨。目前我国黑色素工业生产原料主要为黑豆和黑芝麻，原料供应容易受到气候、季节影响。而微生物生产黑色素具备不受地域、季节限制，易于工业化的特点，在未来黑色素产业开发中具有很高的价值。
发明内容
本发明目的在于提供一株大肠杆菌大肠杆菌工程菌DH5 α 9F2 (Esherichia coliDH5 α 9F2)，该工程菌表达4HPPD酶，4-羟基苯丙酮酸在该酶的作用下生成尿黑酸，尿黑酸通过氧化和多聚化生成黑色素。该大肠杆菌5C11菌种保藏号为CCTCC NO =M 2010Μ4，保藏日期为2010年9月21日，保藏地点为湖北省武汉市武汉大学，保藏机构为中国典型培养物保藏中心。我们从东太平洋深海沉积物样品进行富集，提取富集样品DNA建立R)simid文库， 质粒载体(Fosmid，插入片段40 451Λ)，宿主是大肠杆菌(Escherichia coli)，获得约 3000个克隆子。通过筛选，得到一个克隆子。该克隆在LB培养36小时后呈现棕红色。该克隆插入片段全长测序后经过分析发现，该序列和GENEBANK中的 Pseudomonasstutzeri A1501 (GenBank :CP000304. 1)上的 4HPPD 酶基因有着很高的相似性。根据序列设计引物，以全长序列作为模板，PCR扩增出一条约1. 5Kb的片段，基因序列如图2所示。将该基因克隆到T载体转化到Dffia感受态细胞，得到工程菌9F2。克隆的4HPPD酶基因，全长1083个碱基对，编码了 4HPPD酶(361个氨基酸)，分子量为40. 4Kda。经实验验证，培养基中的苯丙氨酸和酪氨酸可以在大肠杆菌宿主酪氨酸酶作用下生成4-羟基苯并酮酸p-hydroxyphenylpyruvate (PHPP)，PHPP在该酶的作用下生成尿黑酸，尿黑酸通过氧化和多聚化生成黑色素。
图1 所表示的是工程菌9F2用LB培养的生长状况，9F2在LB中培养M小时。图2 所表示是9F2培养液中HGA检测。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步的描述，但不构成对本发明的任何限制。实施例1本发明工程菌的获得本发明提供的工程菌是采用以下方法获得的1.深海沉积物样品的富集取出4°C保存的东太平洋深海沉积物样品10g，于人工海水放线菌富集500ml培养基中进行富集培养，培养条件为，200rpm，10天。2.深海沉积物富集样品DNA提取富集产物30ml，IOOOOg离心15分钟，去上清， 加入 13. 5ml DNA抽提缓冲液(IOOmM Tris-HCl，IOOmM EDTA-Na, IOOmM磷酸钠缓冲液，1. 5M Nacl, CTAB pH 8. 0)，混勻后，加溶菌酶(10mg/ml) ；37度水平振荡30分钟；加入1. 5ml 20% SDS，将其至于65度水浴涡中水浴2小时，同时每15-20分钟伴随着温柔的颠倒混勻； 将离心管6000g离心十分钟，去上清，沉淀重复洗两次(4. 5ml buffer+0. 5mlSDS，65度， lOmin，离心6000g，10min)此步可以省略；集中三次所得到的上清，加入等体积的酚氯仿， 15000g离心15min ；取水相溶液到另一离心管中，再加入0. 6倍体积的异丙醇，室温沉淀1 小时；16000g离心20min，得到DNA粗提物；用70%乙醇洗涤，离心之后放置于操作台吹干， 最后用去离子水溶解。3.深海沉积物富集样品宏基因组文库的构建A. DNA 剪切提取环境样品或所富集菌体的DNA，用琼脂糖凝胶电泳进行检测
B. DNA 选择1.切下片段大约40K至45K的DNA，，在70. C溶胶lOmin，按Img固体胶溶解后体积为 1 μ 1 计算，加入 GELase 50XBuffer,每 100 μ 1 胶加入 IU GELase Enzyme, 45. C 水浴 1 小时。2. 70. C 水浴 lOmin，灭活 GELase Enzyme3.离心去除未被降解的琼脂。4.加入1/10体积醋酸钠，温柔混勻。5.加入2. 5倍体积的无水乙醇，温柔混勻。6.室温沉淀 IOmin.7. 13000rpm/min 离心 20min，小心吸除上清8.将沉淀用预冷的70 %乙醇洗两次9.吹干后将 DNA 溶于 TE Buffer.C. DNA末端补平1.补平体系X μ 1 无菌水8 μ 1 IOX End-Repair Buffer8 μ 1 2. 5mM dNTP Mix8 μ 1 IOmM ATPUp to 20 μ g sheared insert DNA (约 0. 5 μ g/ μ 1)4μ 1 End-Repaie Enzyme Mix80 μ 1总反应体积2.室温放置 45min.3.加入酚-氯仿抽提4.取上清，加入1/10体积醋酸钠，温柔混勻。5.加入2. 5倍体积的无水乙醇，温柔混勻。6.-20. C 过夜沉淀。7. 13000rpm/min 离心 20min，小心吸除上清8.将沉淀用预冷的70 %乙醇洗两次9.吹干后将 DNA 溶于 TE Buffer.D.连接反应1.连接体系Χμ 1 无菌水1 μ 1 IOX Fast-Link Ligation Buffer1 μ 1 IOmM ATP1 μ 1 CopyControl pCClFOS VecterX μ 1 concertrated insert DNA1 μ 1 Fast-Link DNA Ligase10 μ 1总反应体积2.室温放置连接2个小时
3.反应体系置于70°C，10分钟，灭活DNA Ligase.E.克隆子制备1.将EPI300转入已添加IOmM MgS04的LB液体培养基中，培养至OD达到0. 8-1. 0， 4度保存菌液可保存72小时。2.置冰上融化一管包装蛋白，当融化时迅速吸出25 μ 1到一个新的离心管中。剩下的25 μ 1仍然置于-70. C接下去使用。3. 25 μ 1包装蛋白中加入10 μ 1连接反应产物。4. 30. C 水浴 90min.5.加入另外25μ1包装蛋白，30. C水浴90min.6.力口入 Phage dilution buffer 940 μ 1,使总体积达到 lml.F. Titering the Packaged CopyControl Fosmid Clones1.加入10 μ 1包装好的溶液与100 μ 1 EPI300-T1R宿主细胞混勻。2. 37. C 水浴 20min.3.涂于含有12. 5 μ g/ml氯霉素的LC平板上，过夜培养4.计算克隆子数目。G.克隆子确认.1.提取克隆子质粒，琼脂糖凝胶电泳检测片段大小。2.质粒酶切图谱分析最终构建成功约3000个克隆子的文库。4. 4HPPD基因克隆转化发现一个克隆在LB培养36小时后呈现棕红色，经全长测序后发现其含有4HPPD 基因，将该基因克隆到T载体转化到Dffia感受态细胞，感受态在37°C、120RPM下活化。 取50微升涂板，10小时后在含有氨苄青霉素的LB平板上得到工程菌9F2。24小时后，可见该工程菌在平板上产色素。工程菌9F2所产黑色素验证已有报道微生物或宏基因组文库中的4HPPD酶可以在大肠杆菌中表达并产黑色素。培养基中的苯丙氨酸和酪氨酸可以在大肠杆菌宿主酪氨酸酶作用下生成4-羟基苯并酮酸p-hydroxyphenylpyruvate (PHPP)，PHPP在4HPPD酶的作用下生成尿黑酸，尿黑酸通过氧化和多聚化生成黑色素。通过HPLC我们检测到工程菌9F2 LB培养基中的黑尿酸，见图
Io实施例2酶基因的克隆和测序通过对fosmid克隆子的全长序列分析以及在Gene Bank中的BLAST的结果分析， 该全长序列和I3Seudomonas stutzeri A1501 (GenBank :CP000304. 1)相似性最高，其中全长序列中一个片段和PseucIomonas stutzeri A1501的4HPPD基因同源性最高，为98%。根据序列和分析结果设计扩增4HPPD基因引物，引物为9F2-PF5' -TCAGGTCCATCCCATAGCAG-3‘ ；9F2-PR 5' -GTGATACCGCGTGATCTCAAT-3‘。PCR步骤如下95°C预变性5分钟；95°C变性1分钟，50°C复性45s，68°C延伸2分钟30个循环后68°C延伸10分钟，4°C保温。并将所得的片段克隆到T载体上，并进行测
6序。根据已测得序列，经DNA和蛋白对比显示所克隆得到的片段就是所需要的4HPPD 酶基因及其上下游200个碱基左右长度的序列。将所克隆的片段根据引物设定的识别位点进行相应的酶切处理，并与相同酶处理好的载体相连，最终转化到E. Coli EPI300感受态细胞中进行诱导表达。培养基为LB，转速 180rpm，37°C培养 M 小时。
权利要求
1.一株大肠杆菌工程菌 DH5a 9F2(Esherichia coli DH5 α 9F2)，保藏号为CCTCC NO: M2010244。
2.如权利要求1所述的一种大肠杆菌工程菌，其特征在于，该工程菌是由含4HPPD酶的基因转入大肠杆菌得到。
3.如权利要求1所述的大肠杆菌工程菌9F2^sherichia coli DH5a9F》，其特征在于能够合成一种黑色素。
4.如权利要求1所述的大肠杆菌工程菌9F2^sherichia coli DH5a9F》，其特征在于该工程菌能够表达4HPPD酶，培养基中的苯丙氨酸和酪氨酸可以在大肠杆菌宿主酪氨酸酶作用下生成4-羟基苯并酮酸p-hydroxyphenylpyruvate (PHPP)，PHPP在该酶的作用下生成尿黑酸，尿黑酸通过氧化和多聚化生成黑色素。
5.一种4HPPD酶基因，其特征在于，具有SEQ ID NO. 1所示的碱基序列及其功能等同物或变异体。
6.一种4HPPD酶，其特征在于，具有SEQ ID NO. 2所述的氨基酸序列。
7.—种生产黑色素的方法，其特征在于采用权利要求1所述的大肠杆菌9F2或其 4HPPD酶基因或4HPPD酶的氨基酸序列，获得4HPPD酶，用该酶转化4-羟基苯并酮酸生成尿黑酸，尿黑酸通过氧化和多聚化生成黑色素。
全文摘要
本发明公开了一株产黑色素的大肠杆菌工程菌9F2及其所产生的4HPPD酶。该工程菌能够产生一种黑色素。该工程菌在37℃培养条件下，生长状况良好。该菌含有4HPPD基因(全长1083个碱基对)，编码了4HPPD酶(361个氨基酸)，分子量为40.4Kda。
文档编号C12N1/21GK102477407SQ201010564108
公开日2012年5月30日 申请日期2010年11月29日 优先权日2010年11月29日
发明者易志伟, 汤熙翔, 王风平, 肖湘, 马群 申请人:国家海洋局第三海洋研究所