专利名称：rhBACE的表达纯化、活性测定方法及其在药物筛选中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及人重组蛋白rhBACE，构建的该蛋白的重组表达载体，由该载体转化的宿主细菌。
本发明涉及该重组蛋白的制备。包括其在大肠杆菌中的表达纯化、复性方法、激活方法、及活性测定方法。
本发明还涉及利用该蛋白和所述的活性测定方法进行药物筛选。
背景技术：
阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD，又称早老性痴呆症)是常发于老年人群中的一种中枢神经系统退变性疾病.表现为失忆、失语、智能衰退和推理判断能力丧失等症状[1]。
多数学者认为，Aβ的沉积是AD病理的始发因素和中心环节。因此纠正Aβ的反常代谢，对抗Aβ的形成、沉积及毒性作用是治疗AD的根本出路。决定Aβ代谢的关键酶成为治疗AD很有潜力的靶点，为药物治疗AD开辟了新的方向。Aβ是由β淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein，APP)水解产生的.正常的APP是一个膜结合蛋白.在病理状态下，APP在二个蛋白水解酶的作用下，切下一个约40个氨基酸残基的小肽，即Aβ.游离的Aβ在脑中堆积，形成神经元纤维缠结(Neurofibrillary Tangles)，使患者表现出阿尔茨海默病症状[1，2]。
直到近几年才确定了水解APP生成A-beta的酶的身份，即-beta-分泌酶(beta-secretase).1999年，四个不同的制药公司和一个学院实验室各自独立报道了β分泌酶的确立，在这些报道中，β分泌酶被分别称为β位点APP内切酶(β-site APP cleaving enzyme，BACE)，BACE 1，ASP2和memapsin2。β分泌酶为501个氨基酸组成的跨膜天冬氨酸蛋白酶，包括一个接近羧基端的跨膜区、信号序列以及氨基端的前体蛋白区域。D 93和D 289两个天冬氨酸是保持活性所必需的[5～9]。BACE的基因位于第11号染色体，但导致FAD的基因突变并没有发生在此基因上。BACE的mRNA在人类各种组织中均表达，在胰腺和大脑表达最高，神经元BACEmRNA的水平较神经胶质细胞高。BACE蛋白是N糖基化的，在胞膜可以检测到，但主要存在于内质网和高尔基体中，不具有自我激活的能力[5，7，9]。
众多研究结果表明，BACE对APP的酶切作用是Aβ形成的关键步骤.因此，BACE成为治疗阿尔茨海默病的首选靶标[8～10].筛选BACE的抑制剂对于了解阿尔茨海默病的发病的分子机理，以及相应的治疗方法具有重要意义。
目前，BACE的表达制备多在真核细胞，如CHO细胞等表达。真核细胞表达的缺点是产量低，不能满足研究需要。
对于抗早老性药物的开发，国外多个实验室在开展BACE抑制剂的寻找。通常的研究程序制备BACE蛋白晶体，对其活性中心进行X-衍射分析，然后根据结构互补原则设计BACE的活性中心抑制剂。这个研究程序费时费力，对技术设备和科研人员的投入都比较高。
截至目前为止，还没有rhBACE表达纯化、活性测定和抑制剂筛选等方面的研究报导。
发明内容
本发明的目的在于制备有活性的人重组beta分泌酶蛋白(rhBACE)。将pro-rhBACE基因克隆到pET28a中，并在大肠杆菌中Rosseta中表达，利用pET28a提供的融合his-tag进行亲和纯化。纯化后的pro-rhBACE经复性后在酸性条件下激发，变成有活性的rhBACE。本发明提供的rhBACE表达和纯化方法和目前任何已报道的方法均不相同。
本发明的另一目的在于提供人重组rhBACE基因的表达载体及该表达载体转化的宿主细菌。
本发明的又一个目的在于提供一个rhBACE活性测定方法，用于评价药物对rhBACE活性的抑制作用。
本发明的再一个目的，在于建立一个药物筛选平台，用于高通量筛选针对rhBACE活性抑制的药物，该筛选平台也可以用于其它药物的筛选。
本发明的技术解决方案一种重组人beta-分泌酶蛋白的表达纯化、活性测定方法，其特征在于a.克隆重组人beta-分泌酶蛋白基因，连接到质粒表达载体中，利用大肠杆菌进行表达，表达产物为beta-分泌酶蛋白；b.表达产物利用Ni-NTA亲和柱进行纯化；c.纯化产物经激活后用荧光底物进行活性测定。
本发明方法包括重组人beta-分泌酶蛋白的全部或部分核苷酸序列及氨基酸序列。
所述表达产物用Ni-NTA柱进行亲和纯化，纯化产物前重组人beta-分泌酶蛋白在pH4.5的酸性缓冲液中激活，形成有活性的重组人beta-分泌酶蛋白。
本发明方法包括重组人beta-分泌酶蛋白利用荧光多肽底物进行的活性测定方法，其中多肽底物序列为MCA-Ser-Glu-Val-Asn-Leu-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-Lys(DNP)-Arg-Arg-NH2。测量参数为激发波长和发射波长分别为320.4nm和392.0nm。
本发明方法抗早老性痴呆药物筛选系统包括对噬菌体抗体库的筛选，荧光多肽底物的使用，高通量荧光酶标仪的使用。
本发明制备有活性的人重组rhBACE蛋白，建立其活性测定方法，在此基础上建立药物筛选系统来筛选抗rhBACE的抑制药物。本发明在大肠杆菌Rossata中表达BACE蛋白，由于包涵体的形成而大大地提高了表达量(超过20mg/L)。同时，本发明建立了相应的激活方法，得到有活性的rhBACE。本发明利用噬菌体抗体库技术，筛选能与BACE结合的噬菌体抗体，从中选取能抑制BACE活性的噬菌体抗体克隆。这一方法充分利用了噬菌体库的高效筛选性能，大大加快了BACE抑制剂的获得。
图1为pro-rhBACE的核苷酸序列。
图2为BACE的全长蛋白序列、pro-rhBACE蛋白序列及rhBACE蛋白序列。图上示出了BACE的信号肽序列、pro-rhBACE的起点、rhBACE的激活位点以及BACE蛋白的其它结构特征。
图3为pro-rhBACE/pET28a的构建过程图。
图4为阳性克隆的酶切鉴定示意图。
其中，泳道1rh-proBACE cDNA基因；泳道2pET28a用Nde I和Bpu1102I双酶切大片段；泳道3pET28a-rh-proBACE用Nde I和Bpu1102 I的双酶切片段。
图5为菌体裂解物及纯化的rh-proBACE的SDS-PAGE示意图。
其中，泳道1非诱导；泳道23小时诱导后结果；泳道3Ni-Sepharose纯化结果。
图6为不同条件处理下的rh-proBACE激活情况示意图。
其中，泳道1在pH7.9条件下，pro-rhBACE部分激活；泳道2在pH4.5条件下，pro-rhBACE全部激活。
图7为rhBACE的活性测定示意图。
根据本发明所述，提供含有图1所述的DNA序列的人重组rhBACE基因。在本发明的一个实施例中，pro-rhBACE基因经酶切后连接到pET28a中。构建pro-rhBACE/pET28a表达载体。
根据本发明的一个方面，提供包含rhBACE基因序列的重组载体。其中载体可以以质粒、病毒颗粒以及噬菌体等形式。在本发明的一个实施例中，构建了质粒形式的载体。
可通过多种方法将目的DNA插入到载体中，一般而言，通过本领域技术人员已知的一些方法可以将本发明的DNA序列插入到一个适当的限制性酶内切位点上。表达载体中的DNA可操作地与一个适当的表达调控序列(启动子)连接以指导蛋白合成，表达载体同时含有用于筛选转化宿主细菌的表型性状基因。用于构建表达载体的质粒或病毒可通过商业途径获得。
本发明的一个实施例中，通过将人重组rhBACE基因插入到质粒pET28a的限制性内切酶Nde I和Bpu1102 I位点，构建成质粒表达载体pET28a/pro-rhBACE。表达的pro-rhBACE含有一个his-tag标记可用Ni-NTA sepharose柱亲和纯化。该载体可在大肠杆菌中大量表达出重组人pro-rhBACE蛋白。
根据本发明的又一方面，由本发明表达的载体转化的宿主，可以是原核或真核细胞，其中用于的原核细胞可以为各种细菌，在本发明的实验例中，以大肠杆菌作为本发明的载体的宿主细胞，更优选为大肠杆菌Rosseta。
根据本发明的再一方面，利用基因工程技术制备重组人rhBACE的方法，包括1)将编码重组人pro-rhBACE可操作在连接于表达调控序列，构建表达载体；2)用该表达载体的转化的大肠杆菌，形成宿主细胞；3)在适当的条件下培养本发明的宿主细菌；4)从包涵体中分离纯化pro-rhBACE蛋白；5)在本发明的条件下进行复性；6)在适当的条件下对pro-rhBACE激活，变成有活性的rhBACE蛋白。
在得到纯的rhBACE蛋白的基础上，利用多肽荧光底物测量rhBACE活性，rhBACE活性大小用荧光酶标仪读出。本发明的rhBACE活性测定方法具有快速灵敏的特点。
在本发明的活性测定方法基础之上，利用噬菌体单链抗体库筛选rhBACE的抑制剂，利用微孔板进行高能量筛选，一次筛选多达1536种药物。本发明的筛选方法结合了噬菌体抗体库快速筛选能力和荧光酶仪高通量特点。
本发明成功地制备有活性的rhBACE蛋白，并建立了其活性测定方法，在活性测定的基础上利用噬菌体抗体库技术和高通量筛选技术对rhBACE抑制剂进行筛选。本发明为BACE的致病机理及抗阿尔茨海默病药物的筛选奠定了基础。
本发明的材料1.菌株大肠杆菌ROSSETA由本实验室保存。
说明1大肠杆菌ROSSETA为基因工程中常用的表达菌(详见《生物化学与分子生物学实验常用数据手册》吴冠芸 等主编，科学出版社1998，p426)。
2.质粒pET11a和pET28a购于Novagen公司(产品代码69015-3)。
3.重组质粒pET11a/pro-rhBACE和pET28a/pro-rhBACE均为本实验室构建(南京大学学报(自然科学)40(2)104-109)。
4.酶和主要试剂T4DNA连接酶和限制性内切酶Nde I、Bpu1102 I购自TAKARA公司；Ni-Sepharose填料购自Qiagen公司(产品代码D2011A)。
BACE活性测定荧光底物(BAS-131)购自EPS(Enzyme Product System，代号ESP，Cat.BAS-131)。
5.培养基的配制LB(1％胰化蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠)，由申请人实验室配制。
具体实施例方式
以下通过实施例来进一步阐述本发明，实施例中末注明具体条件的的实验方法，基本上都按照Sambrook等人编著的＜分子克隆实验指南＞(New York cold springharbor laboratory press，1989)中所述的条件，或按照生产商所建议的条件。
实施例一pET28a/pro-rhBACE表达质粒的构建
1.酶切反应第一个酶切，Nde I酶切在eppendorf管中调制以下反应H Buffer2ulNde I 1ulPET28a 10ul水 7ul37度保温2小时后，用PCR产物纯化试剂盒纯化单酶切片段，再用Bpu1102 I进行第二个酶切，反应体系如下Bpu1102I Buffer2ulBpu1102I 1ul单酶切产物 10ul水 7ul2.连接反应Pro-rhBACE基因的双酶切片段 8ulPET28a质粒的双酶片段 2ul水 7ulT4 DNA ligase 1ulBuffer 2ulpET11a-pro-rhBACE中的目的基因序列为pro-rhBACE，与全长BACE(501个氨基酸)相比，该质粒中的目的基因切去了N端部分信号肽序列(13个氨基酸)及C端的胞质内序列(47个氨基酸)，pro-rhBACE全长为441个氨基酸，包含BACE活性所需的全部序列(图2)。PET28a-pro-rhBACE质粒构建流程如图3。
用Nde I和Bpu1102 I分别对pET11a-rh-proBACE和pET28a质粒进行双酶切.经1％琼脂糖电泳后，从pET11a-rh-proBACE的酶切产物中回收目的基因片段(rh-proBACE，1442bp)；从pET28a的酶切产物中回收载体片段(5211bp).用T4 DNA Ligase将目的基因片段与载体片段于16℃连接过夜.将连接产物(pET28a-rh-proBACE)转化DH5a感受态细胞，在含卡那霉素的LB平板上培养.挑取单菌落，用Nde I/Bpu1102I双酶切鉴定筛选阳性克隆.抽提阳性克隆的质粒DNA，目的基因经测序确证.用正确基因序列的pET28a-rh-proBACE质粒转化Rosetta表达菌。
pET11a-rh-proBACE重组质粒的构建过程如图3所述。构建结果用电泳鉴定，如图4所示。
Lane 1为从pET11a-rh-proBACE中切出的目的基因片段；Lane 2为从pET28a中切出的载体片段。将上述两片段回收，连接，得到pET28a-rh-proBACE。pET28a-rh-proBACE经Nde I/Bpu1102 I双酶切后得到两条片段(图1，Lane 3)。其中小片段约1.4kb，与目的基因大小一致；大片段约5kb，与pET28a大小一致.对pET28a-rh-proBACE进行序列测定，测序结果表明克隆到表达载体中的rh-proBACE碱基序列正确。
实施例二pro-rhBACE融合蛋白的表达及纯化rh-proBACE的表达及Ni-Sepharose亲和纯化挑取表达菌单个菌落于LB培养基(卡那抗性)中，37℃振荡培养过夜。将培养过夜的菌液按1∶50接种于LB培养基，37℃培养至A600为0.8左右.加入IPTG(终浓度0.5mmol/L)诱导3h，离心(6000r/min，15min)收集菌体。每克湿菌加入5ml裂解液(20mmol/L Tris-HCl，5mmol/L咪唑，0.5mol/L NaCl，6mol/L盐酸胍，10mmol/L β-巯基乙醇及1mmol/L PMSF，pH7.9).超声破菌，离心(12000r/min，30min)，上清液过Ni-Sepharose亲和柱.用15个床体积的洗涤缓冲液(25mmol/L Tris-HCl，10mmol/L咪唑，10mmol/L β-巯基乙醇，8mol/L尿素，pH7.9)洗去杂蛋白，再用10个床体积的洗脱缓冲液(25mmol/L Tris-HCl，200mmol/L咪唑，10mmol/L β-巯基乙醇，8mol/L尿素，pH7.9)洗脱目的蛋白rh-proBACE。
将重组质粒pET28a-rh-proBACE转化到E.coli Rosseta中进行表达，表达产物经Ni-Sepharose纯化后用SDS-PAGE鉴定。结果如图5。
从图5中可以看到，表达菌株经IPTG诱导后可产生一分子量约为50kD的蛋白(图5，Lane 2箭头所指处)，该蛋白分子量与目的蛋白分子量一致。表达产物经Ni-Sepharose柱亲和层析后，纯度达95％以上(图5，Lane 3)。从Ni-Sepharose柱洗脱的蛋白经透析得到复性，用Q-Sepharose柱对复性后的样品进行浓缩纯化。
实施例三rh-proBACE的复性及浓缩纯化将100倍体积的复性液(25mmol/L Tris-HCl，0.5mol/L盐酸胍，4mmol/L GSH，1mmol/L GSSH，pH8.0)逐滴滴入到样品蛋白溶液中，4℃静置过夜.然后对25mmol/L Tis-HCl(pH7.9)透析24h。透析后的样品上样到Q-Sepharose柱，高盐缓冲液(25mmol/L Tis-HCl，0.5mol/L NaCl，pH7.9)洗脱。
实施例四rh-proBACE的激活将从Q-Sepharose上洗脱下来的rh-proBACE蛋白溶液对0.1mol/L NaAc(pH4.5)透析24h，然后于22℃保温16h，使rh-proBACE自身激活，切去N端28个氨基酸，获得rhBACE[11，12]。
rh-proBACE的N端部份氨基酸残基与该酶的活性中心结合，抑制了酶活性。在一定的条件下，rh-proBACE能自发切去N端28个氨基酸，生成高活性的rhBACE[11～13]。本实验将rh-proBACE分别溶于25mmol/L Tris-HCl(pH7.9)和100mmol/L NaAc(pH4.5)中，前者于4℃放置72h，后者于22℃放置16h后，12％SDS-PAGE鉴定rh-proBACE的激活程度。结果如图6所示。
rh-proBACE在pH7.9的条件下被部分激活，电泳分离出两条带——rh-proBACE和rhBACE。rhBACE迁移略快于rh-proBACE(图6，Lane 1)；在pH4.5的条件下，rh-proBACE则被完全激活，只有rhBACE一条条带(图6，Lane2)。
实施例五rhBACE活性的测定rhBACE的底物(BAS-131)序列为MCA-Ser-Glu-Val-Asn-Leu-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-Lys(DNP)-Arg-Arg-NH2。rhBACE酶切底物后，生成的产物可发出荧光。荧光测定的激发波长和发射波长分别为320.4nm和392.0nm。反应介质为0.1mol/L NaAc，5％DMSO，pH4.5。
以荧光标记物BAS-131为底物，测定了rhBACE的体外活性，其活性曲线呈现出典型的米氏曲线特征(图7)。
实施例六抗rhBACE的药物筛选系统将激活后的rhBACE固定在免疫管上，对噬菌体展示的抗体库进行筛选。
1.抗rhBACE单链噬菌体抗体的筛选将rhBACE用50mM NaHCO3(pH 9.6)稀释至40μg/ml，取4ml包被免疫管(immunotuber，Nunc公司)，4℃过夜。次日以2％ BSA于37℃封闭2小时，加入1ml噬菌体抗体库(1×1013cfu/ml)，室温孵育1.5小时。用PBS-0.1％ Tween20(PBST)和PBS分别洗涤10次(第一轮各10次，以后每轮各20次)。结合的噬菌体用1ml 100mmol/L TEA(三乙胺)洗脱，然后加入0.5ml 1mol/L Tris(pH7.4)中和。取0.75ml洗脱液加入到10ml新鲜制备的宿主菌TG1中，37℃静置感染30分钟。取少许涂布平板YTE-AG平板(含1％ Glucose和100μg/ml ampicilin)，计算滴度。其余菌液用于扩增制备次级抗体库，投入下一轮筛选。如此筛选共重复四次。
2.单克隆噬菌体抗体克隆的制备从滴度测定平板上挑克隆，接种到含200μl 2YT-AG(含有100μg/ml ampicilin和1％ Glucose)的96孔培养板中，37℃中培养过夜。吸取10μl过夜菌液转接到另一块96孔板中(含100μl 2YT-AG)，37℃培养1h后加入5μl VCS-M13(5×108pfu)进行超感染，1800×g 10离心10分钟，沉淀重悬于200μl 2YT-AK(含100μg/mlampicilin和25μg/ml kanamycin)，30℃培养过夜，离心收集上清，即得到噬菌体抗体。
3.ELISA检测噬菌体抗体与rhBACE的结合将待测的多克隆(抗体库)或单克隆噬菌体抗体加入到rhBACE包被的酶标板中，室温孵育90分钟，用PBST和PBS分别洗涤5次。然后与anti-M13/HRP室温孵育90分钟，同上洗涤后加入100μl TMB显色30分钟，加入100μl 1mol/L磷酸终止反应，在酶标仪上读OD450nm.以BSA作为阴性对照。
4.rhBACE活性抑制实验将rhBACE与噬菌体抗体室温孵育30分钟后，利用实施例中方法五的活性测定方法检测抗体对rhBACE活性抑制作用。以PBS代替噬菌体抗体液作为对照。
5.基于活性测定方法的抗rhBACE抑制剂筛选系统将不同克隆的噬菌体抗体加入到rhBACE活性测定体系中。此实验在384孔中进行，利用荧光底物和高通量荧光仪BIO-TEK Hynergy HT进行筛选。它具有样品量大(384孔/板)；筛选速度快(384个/30秒)；操作简便、无需进行放射性标记等特点。待测样品与荧光分析试剂混合后直接分析荧光强度，对每一样品孔进行准确的定量检测，测量数据用联机电脑自动采集。
说明1 双链DNA(是由两条核苷酸链依靠彼此碱基之间形成的氢键相联系而连接在一起形成的双链双螺旋结构。详见《生物化学》第三版 上册 王镜岩 朱圣庚 徐长法 主编，高等教育出版社2002，p486-487)。
说明2 信号肽信号肽控制蛋白加工后转运的一段蛋白序列，肽链长度为13到26个氨基酸，氨基端至少含有一个带正电的荷的氨基酸，在中部有一段长度为10到15个氨基酸的的由高度疏水的氨基酸组成的肽链。在信号肽的C端有一个可被信号肽酶识别的位点，此位点上游常有一段疏水区较强的5肽。
说明3 酶切是指利用限制性核苷酸内切酶对双链DNA分子在特定的位点进行切断。
说明4 质粒(质粒是染色体外的DNA分子，其大小范围在1Kb至200Kb以上不等。大多数来自细菌细胞的质粒是双链、共价闭合的环状分子，以超螺旋形式存在。详见《分子克隆实验指南》第三版 上册 J.萨姆布鲁克 D.W.拉塞尔 著，科学出版社2002，p2-3)。
说明5 连接(连接是指在一定条件下，由DNA连接酶催化两个双链DNA片段相邻的5‘端磷酸与3’端羟基之间形成磷酸二酯键的过程。详见《现代医学分子生物学》谷志远 著，人民军医出版社1998，p198)。
说明6 转化(转化是指重组DNA分子导入受体细胞的过程。详见《现代医学分子生物学》谷志远 著，人民军医出版社1998，p204-206)。
说明7 感受态细胞(感受态细胞是指处于容易接受外源DNA状态的细菌细胞。详见《现代医学分子生物学》谷志远 著，人民军医出版社1998，p204)。
说明8 质粒序列测定(质粒序列测定是指将基因和基因组转化为具有明确结构的化学物质的过程。详见《分子克隆实验指南》第三版 下册 J.萨姆布鲁克 D.W.拉塞尔 著，科学出版社2002，p981)。
说明9 LB培养基(1升LB培养基其成分为胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g，详见《分子克隆实验指南》第二版 金冬雁 校p908)。
说明10 IPTG(IPTG是异丙基硫代半乳糖苷。详见《现代医学分子生物学》谷志远 著，人民军医出版社1998，p130)。
说明11 SDS-PAGE(SDS-PAGE为十二烷基磺酸钠-聚病烯酰胺凝胶电泳。《精编分子生物学实验指南》奥斯伯 等著，金冬雁 校 科学出版社1998，p336-337)。
说明12 噬菌体抗体库利用噬菌体展示技术，将人源性抗体的scFv片段展示到噬菌体颗粒的头部，并有抗原结合活性。见《分子文库》沈倍奋主编，科学出版社，2001，P24-P94。
说明13 pET28a表达载体的选择国内外近年来报道的rhBACE表达系统多以pET11a为载体。该表达载体得到的表达产物分离纯化比较困难，且得率较低。本实验将rhBACE基因亚克隆到pET28a载体中，经表达得到N端具有(His)6的融合蛋白，利用Ni-Sepharose柱对表达产物进行纯化，简化了操作，只经一步亲和层析就得到了较高纯度的目的蛋白。
见参考文献3，4，11，12，13，15。
说明14 选择Rosseta表达菌株BACE基因是基因，rh-proBACE在Rosetta中的表达量要高于BL21，因此选用Rosetta进行表达而不用BL21。
说明15 本发明发现在酸性pro-rhBACE的激活除了能在酸性条件下(pH4.5)进行，也可以在微碱性条件下(pH7.9)进行(图6，Lane 1)。
见参考文献11，12，13。
说明16本发明利用Ni-NTA对rhBACE进行亲和纯化，比离子交换和凝胶过虑等方法更高效。
说明17 对BACE的活性测定，目前主要采用HPLC和MS联用的方法对酶切产物进行定量、鉴定。这种方法样品耗费大、操作繁琐，设备要求高。本发明采用荧光底物，用荧光分光光度计测定酶切产物，灵敏度高，操作简便。
参考文献3，4，5，6。
说明18 在制备纯的有活性的人重组rhBACE的基础上，建立了高通量药物筛选系统。在本发明中，此药物筛选系统结合了噬菌体抗体库技术和高通量筛选技术(多孔板)，并且利用了荧光测量高灵敏度的优点。此筛选系统将不仅可用于对rhBACE抑制剂的筛选上，并可作为一个平台用于其它药物的筛选。
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权利要求
1.一种重组人beta-分泌酶蛋白的表达纯化、活性测定方法，其特征在于a.克隆重组人beta-分泌酶蛋白基因，连接到质粒表达载体中，利用大肠杆菌进行表达，表达产物为beta-分泌酶蛋白；b.表达产物利用Ni-NTA亲和柱进行纯化；c.纯化产物经激活后用荧光底物进行活性测定。
2.根据权利要求1所述的一种重组人beta-分泌酶蛋白的表达纯化、活性测定及其在药物筛选中的应用，其特征在于，包括重组人beta-分泌酶蛋白的全部或部分核苷酸序列及氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的一种重组人beta-分泌酶蛋白的表达纯化、活性测定及其在药物筛选中的应用，其特征在于，表达产物用Ni-NTA柱进行亲和纯化，纯化产物前重组人beta-分泌酶蛋白在pH4.5的酸性缓冲液中激活，形成有活性的重组人beta-分泌酶蛋白。
4.根据权利要求1所述的一种重组人beta-分泌酶蛋白的表达纯化、活性测定及其在药物筛选中的应用，其特征在于，包括重组人beta-分泌酶蛋白利用荧光多肽底物进行的活性测定方法，其中多肽底物序列为MCA-Ser-Glu-Val-Asn-Leu-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-Lys(DNP)-Arg-Arg-NH2；测量参数为激发波长和发射波长分别为320.4nm和392.0nm。
5.根据权利要求1所述的一种重组人beta-分泌酶蛋白的表达纯化、活性测定及其在药物筛选中的应用，其特征在于，抗早老性痴呆药物筛选系统包括对噬菌体抗体库的筛选，荧光多肽底物的使用，高通量荧光酶标仪的使用。
全文摘要
本发明涉及重组人beta－分泌酶(简称rhBACE)的制备及活性测定方法，由此建立了rhBACE抑制剂筛选系统。本发明将pro－rhBACE克隆到大肠杆菌表达质粒pET28a载体中，构建pro－rhBACE－pET28a重组表达质粒并在E.Coli Rosseta中表达。包涵体中的表达产物溶于6mol/L盐酸胍，经Ni－Sepharose亲和层析纯化后，得到高纯度的pro－rhBACE蛋白。此蛋白在复性液中重新折叠后，于酸性条件(pH4.5)下激活，切去酶原序列，产生有活性的rhBACE蛋白。本发明利用人工合成的荧光17肽底物测定rhBACE活性。本方法制备的rhBACE可用于开展对阿尔茨海默病发生机理的研究及抗阿尔茨海默病药物的筛选。
文档编号C12N15/12GK1706945SQ200410055549
公开日2005年12月14日 申请日期2004年8月4日 优先权日2004年6月4日
发明者刘建宁, 王石泉, 郭志刚 申请人:南京大学