专利名称：红豆杉细胞培养中筛选紫杉醇高产细胞株的方法
技术领域：
本发明涉及植物细胞工程，特别是一种从红豆杉愈伤组织中筛选紫杉醇高含量细胞株的方法。
紫杉醇(Taxol)是从红豆杉属植物中分离得到的一种抗癌药物，已被证明对治疗卵巢癌、乳腺癌及肺癌等有效。目前，紫杉醇的提取都以红豆杉属植物树皮为原料，不仅破坏环境、危及红豆杉资源，且因红豆杉属植物生长缓慢、紫杉醇含量低，所以药源奇缺、价格昂贵。另外，全化学人工合成法虽已成功，但因其代价极其昂贵而不能用于实际生产。因此，必须寻找可替代的生产途径，利用红豆杉植物组织、细胞培养法生产紫杉醇被认为是解决的途径之一。
要进行工业化生产，目前培养物的紫杉醇含量低仍是制约因素，解决的途径之一是进行高产细胞株的筛选和培养。由外植体诱导获得的愈伤组织紫杉醇含量普遍比较低(约占细胞干重的0.0001～0.001％)，远低于原植物紫杉醇含量(约占干重的0.001～0.01％)，因此，有必要对愈伤组织进行筛选。应用植物细胞筛选方法从中选出紫杉醇含量高的个体，进一步培养成具有优良性状的细胞株。
现有技术中昆明植物研究所的郑光植等人作了关于植物细胞优株筛选的叙述，但各种植物细胞的生理特性不同，所需的培养条件、细胞密度、培养方法等都有较大区别。另外，传统的植物细胞优株筛选方法因工作量大，选种周期长，难于满足生产的需要，应根据具体情况选择简单、快速的方法。华中理工大学的李家儒、中国林业科学院研究所的邱德有等报道的红豆杉细胞优株筛选方法仅限于细胞生长方面，未见紫杉醇高产细胞株筛选的报道。
本发明的目的就是提供一种简便、快捷选取紫杉醇高产细胞株的方法，利用本方法能够获得生长快、紫杉醇含量高的细胞株。
根据愈伤组织的异质性及变异性，发明人在实验中发现红豆杉细胞的外观特征与细胞中紫杉醇含量有一定的关系凡块状或颗粒较明显的细胞团，其紫杉醇含量较高，请阅表1。
表1、中国红豆杉细胞的外观特征与细胞中紫杉醇含量的关系克隆细胞编号 干细胞中紫杉醇含量(％) 含量排序 细胞的主要特征1 0.00027 10 暗黄色棉絮状细胞团，含水量大。
2 0.00045 9浅红色疏松细胞团，含水量大。
3 0.00108黄色颗粒状疏松细胞团，含水多。
4 0.00177色颗粒状疏松细胞团，含水多。
5 0.00466浅黄色疏松细胞团。
6 0.00515浅黄色疏松细胞团。
7 0.00874浅黄色疏松细胞团，颗粒不明显。
8 0.01083黄色大颗粒细胞团，颗粒不易碎。
9 0.01672浅黄色沙粒状细胞团，颗粒明显、疏松、含水少。
100.017 1浅黄色块状细胞团，表面有白色颗粒，含水少。
本发明可由如下方式来实现(1)红豆杉外植体用自来水洗净后，分别用酒精和次氯酸钠消毒，然后用蒸馏水清洗并截短至1～2厘米，在其上划有伤痕后接种到固体培养基中培养1～5周诱导获得愈伤组织，愈伤组织在固体培养基上每20～25天继代一次，继代时，比较培养物的外观性状(颜色、形态、含水量)，选择含水少、生长快、颜色浅、颗粒较明显的细胞进行继代培养，并定期检测培养物的紫杉醇含量，从中选出含量高的继续培养；(2)筛选到的愈伤组织转移到液体培养基中进行悬浮培养，每10天继代一次，第3代培养3～15天后，取出静置，在无菌条件下将上层含有单细胞或小细胞团的培养液用吸管吸出，过150～250目筛，滤液为单细胞或有少数小细胞团的悬液，然后对单细胞进行看护培养；(3)看护培养是用经15～20天保温培养的同种红豆杉鲜细胞以5～10g(dw)/L的量接种到固体培养基上，上面铺滤纸，保温培养3～7天后将单细胞悬液以100～1000个/cm2密度接种到滤纸上保温培养以获得克隆细胞；(4)选取块状或颗粒较明显的克隆细胞，然后将选到的每一克隆细胞分为二部分，一部分每20～25天继代一次，另一部分培养22～27天后用HPLC进行紫杉醇的定量分析，选出紫杉醇含量高的细胞株。固体培养基是B5基本培养基添加2～4％蔗糖，0.5～2g/L水解酪蛋白、1～10mg/L NAA、0.1～1mg/L 6-BA，PH值调至5.8～6.0，凝固剂为琼脂，25℃暗中培养。液体培养基除琼脂外，其它成份与固体培养基相同，摇床转速为120转/分钟。细胞中紫杉醇的定量分析采用Waters HPLC系统，流动相为甲醇-乙腈-水(29∶27∶44)，流速1ml/min，检测波长227nm，标准品产自SIGMA公司。红豆杉细胞是由短叶红豆杉、中间红豆杉、东北红豆杉、云南红豆杉、南方红豆杉、西藏红豆杉、浆果红豆杉或中国红豆杉诱导培养。
根据发明人在实验中的发现，对愈伤组织进行初步筛选后利用红豆杉单细胞克隆方法获得大量克隆细胞，然后依据细胞的外观特征与紫杉醇含量的关系进行分析和筛选，获得生长速率为0.52g(dw)/L.d，紫杉醇含量为0.1％的细胞优株，紫杉醇含量较原植物提高了10倍。本发明具有简便、快捷选取紫杉醇高产细胞株的特点，可节省大量人力、物力、提高劳动生产率。
下面结合附图，对本发明作进一步的描述
图1为优选细胞株(9#)悬浮培养后期的生长和紫杉醇生产情况。
图2为继代培养对优选细胞株(9#)的生长和紫杉醇累积的影响。
实施例一1、愈伤组织的诱导和初步筛选供试材料是采自本所植物园的中国红豆杉(Taxus Chinensis)幼嫩外植体(茎、叶)，用自来水清洗干净后用70％酒精消毒1分钟，再用次氯酸钠溶液消毒30分钟，随后用蒸馏水清洗4次并截短至1.5cm长，在其上划有伤痕后接种到固体培养基中培养3～5周以诱导所需的愈伤组织。
诱导获得的愈伤组织在固体培养基上每22天继代一次。继代时，比较培养物的外观性状(颜色、形态、含水量)，选择生长快、颜色浅、颗粒较明显的(均匀小粒)细胞进行继代培养，并定期检测培养物的紫杉醇含量，从中选出含量高的继续培养。因细胞生长好坏很容易从外观上表现出来生长好的细胞颜色浅、均匀疏松或长成特别突出的一堆；而长得差的细胞往往颜色深、易褐化、含水量大(水浸状)或聚集成硬的细胞团。经10次以上继代培养和筛选后，细胞生长速率提高了1.6倍，从0.37g(dw)/L.d提高到0.60g(dw)/L.d，紫杉醇含量亦提高了近10倍，请阅表2。
表2、筛选前后中国红豆杉细胞生长和紫杉醇含量变化
2、单细胞克隆(1)、单细胞悬液的制备经初步筛选获得的愈伤组织转移到锥瓶中进行悬浮培养，每10天继代一次。待第3代培养7天后，取出静置片刻，在无菌条件下将上层含有单细胞或小细胞团的培养液用吸管吸取，过150目筛，滤液为单细胞或有少数3～5个细胞聚集的小细胞团的悬液。
(2)、看护培养在固体培养基上经20天保温培养的同种红豆杉细胞以5g(dw)/L.d的量接种到新鲜固体培养基上，上面铺一层无菌滤纸，保温培养5天，然后将单细胞悬液稀释到密度为5×103个/ml，接种到上述滤纸上(接种量约为500个/cm2)保温培养。20天以后，有肉眼可见的小细胞团长成，30天以后，陆续将肉眼可见的小细胞团转移至另一培养基上继续看护培养(操作方法同上)。待克隆细胞长至2mm3以上时，接种到新鲜固体培养基中扩大培养。
(3)、克隆细胞的继代扩大培养与进一步筛选克隆细胞生长至一定程度时，依据上面所述的红豆杉细胞的外观特征与细胞中紫杉醇含量的关系进行筛选，选到的紫杉醇含量可能较高的每一克隆细胞分为二部分，一部分每20天继代一次，另一部分培养25天后进行定量分析(用HPLC)并选出紫杉醇含量较高的优株，结果见表2和
图1。从图中、表中均可以看出，获得的9#细胞株，生长速率为0.52g(dw)/L.d，悬浮培养27天后，紫杉醇总量达到0.1％，其中胞内含量为0.029％(占细胞干重)，约合3.6mg/L，胞外(培养基中)含量为19.8mg/L。这对于利用细胞培养法进行紫杉醇的工业化生产具有很大的促进作用。
3、稳定性试验高产细胞株的不稳定性是制约工业化生产的一大障碍，因我们所用的单细胞分离方法获得的克隆细胞有一部分可能来自小细胞团，而且培养条件的变化和细胞自身的原因(如突变等)都将影响细胞株的稳定性，所以有必要对获得的高产株进行稳定性试验。
将筛选到的细胞株转移到锥瓶中进行悬浮培养，每14天代一次，接种量为4g/L(干重)，每隔2～5代取样测定一次细胞干重、胞内胞外紫杉醇含量。取样时间为接种后的第27天，结果见图2。从图中可以看出，继代培养过程中经27天的悬浮培养后，细胞干重保持在12g/L左右，说明这一细胞株的生长是稳定的；细胞内外累积的紫杉醇总量维持在17～25mg/L之间，说明这一细胞株的生产也是稳定的。因此，我们认为所筛选获得的9#细胞株是稳定的，筛选方法也是可行的。
上述固体培养基是B5基本培养基添加2％蔗糖、1g/L水解酪蛋白、5mg/L NAA、0.2mg/L 6-BA和0.7％琼脂，每100ml三角瓶盛30ml培养基。所用液体培养基是B5基本培养基添加2.5％蔗糖、4mg/L NAA、0.1mg/L 6-BA，250ml锥瓶每瓶盛100ml培养基，摇床转速120rpm。PH值均调至5.8～6.0，25℃左右暗中培养。
4、紫杉醇的提取与检测方法(1)固体培养细胞中紫杉醇的提取收获经20～25天培养的待测培养物，置60℃烘干至恒重，研细过80目筛，称取0.5g，以甲醇浸提过夜，超声15分钟，静置后收集上层清液，重复三次。然后回收甲醇，用蒸馏水洗残渣，并用二氯甲烷萃取三次，合并二氯甲烷并回收，残渣用少量甲醇溶解并定容，待检测。
(2)悬浮培养物中紫杉醇的提取收获待测的悬浮培养物并用筛过滤，滤得细胞用蒸馏水洗干净，然后置60℃烘干至恒重后称重，其它处理与固体培养细胞中紫杉醇的提取方法一致。所得滤液量取10ml，用二氯甲烷萃取三次，其它处理同上。
(3)样品中紫杉醇含量的检测样品检测采用Waters HPLC系统，流动相为甲醇-乙腈-水(29∶27∶44)，流速1.0ml/min，检测波长227nm，标准品产自SIGMA公司。
权利要求
1．一种红豆杉细胞培养中筛选紫杉醇高产细胞株的方法，其特征在于(1)红豆杉外植体用自来水洗净后，用酒精和次氯酸钠消毒，然后用蒸馏水清洗并截短至1～2厘米长，在其上划有伤痕后接种到固体培养基中培养2～5周诱导获得愈伤组织，愈伤组织在固体培养基上每20～25天继代一次，继代时，比较培养物的外观性状(颜色、形态、含水量)选择生长快、颜色浅、颗粒较明显的(均匀小粒)细胞进行继代培养，并进行紫杉醇的定量分析，从中选出含量高的继续培养；(2)经初步筛选获得的愈伤组织转移到液体培养基中进行悬浮培养，每10天继代一次。待第3代培养3～15天后，取出静置片刻，在无菌条件下将上层含有单细胞或小细胞团的培养液用吸管吸取，过150～250目筛，滤液为单细胞或有少数小细胞团的悬液，然后对单细胞进行看护培养；(3)看护培养是用经15～20天保温培养的同种红豆杉鲜细胞以5～10g(dw)/L的量接种到固体培养基上，上面铺滤纸，保温培养3～7天后将单细胞悬液以100～1000个/cm2的密度接种到滤纸上保温培养，以获得克隆细胞；(4)选取块状或颗粒较明显的克隆细胞，然后将选取的每一克隆细胞分为二部分，一部分每20～25天继代一次，另一部分培养22～27天后进行紫杉醇的定量分析，选出紫杉醇含量高的细胞株。
2．依权利要求1所述的红豆杉细胞培养中筛选紫杉醇高产细胞株的方法，其特征在于固体和液体培养基均是B5基本培养基添加2～4％蔗糖、0.5～2g/L水解酪蛋白、1.0～10mg/L NAA、0.1～1.0mg/L 6-BA，PH值调至5.8～6.0，25℃暗中培养，固体培养基另添加0.6～1％的琼脂作凝固剂，液体培养时摇床转速为120转/分钟。
3．依权利要求1所述的红豆杉细胞培养中筛选紫杉醇高产细胞株的方法，其特征在于细胞中紫杉醇的定量分析采用Waters HPLC系统，流动相为甲醇-乙腈-水(29∶27∶44)，流速1ml/min，检测波长227nm，标准品产自SIGMA公司。
4．依权利要求1所述的红豆杉细胞培养中筛选紫杉醇高产细胞株的方法，其特征在于红豆杉细胞是由短叶红豆杉、中间红豆杉、东北红豆杉、云南红豆杉、南方红豆杉、西藏红豆杉、浆果红豆杉或中国红豆杉诱导培养。
全文摘要
本发明涉及红豆杉细胞培养中筛选紫杉醇高产细胞株的方法。红豆杉的外植体经诱导得到愈伤组织,进行初步筛选后,利用单细胞克隆方法获得大量克隆细胞,继代扩大培养后进行分析、筛选和稳定性试验,获得生长速率为0.52g(dw)/L.d、紫杉醇含量为0.1%的细胞优株,紫杉醇含量较原植物提高了10倍。本发明具有简便、快捷选取紫杉醇高产细胞株的特点,能节省大量人力、物力、提高劳动生产率。
文档编号C12N15/04GK1304996SQ0011759
公开日2001年7月25日 申请日期2000年11月2日 优先权日2000年11月2日
发明者李志良, 黄巧明, 张庆云, 侯嵩生 申请人:梅县梅雁生物工程研究所