一种具有肿瘤细胞靶向性的介孔硅纳米组装体及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种具有肿瘤细胞靶向性的介孔硅纳米组装体及其制备方法。本发明的具体步骤如下：(1)先以表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵作为模板，正硅酸四乙酯作为硅源，在碱性条件下，75?85℃温度下合成得到粗品，再后处理除去表面活性剂，得到介孔硅；(2)将介孔硅和药物在乙醇中混和，得到载药介孔硅；(3)将载药介孔硅用磷酸盐缓冲溶液PBS分散，加入到脂质体膜中，先水化，再均质，得到脂质体包裹的介孔硅纳米粒；(4)将脂质体包裹的介孔硅纳米粒和HA反应得到目标材料。本发明制备方法简单，得到的介孔硅纳米组装体能够从靶向和防止药物扩散两方面增强肿瘤细胞对药物的摄取，从而达到治疗肿瘤的效果，对于肿瘤的治疗具有明显的优势。
【专利说明】
一种具有肿瘤细胞靶向性的介孔硅纳米组装体及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于药物制剂技术领域，具体涉及一种具有肿瘤细胞靶向性的介孔硅纳米 组装体及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 近些年来，恶性肿瘤成为威胁人类生命健康的主要疾病，并且发病率和死亡率近 年来呈逐年上升的趋势。因此，抗肿瘤药物的研发成为各国政府、研究机构及制药公司的重 中之重，对抗肿瘤药物研究也给予了高度关注。目前，尽管治疗肿瘤的方式和手段众多，但 是化疗依然是治疗肿瘤的主要手段。但是这种方法却存在着许多的问题，诸如副作用大、选 择性差、耐药性强，而且更重要的是常规的化疗方法中，化疗药物分布于全身，但在肿瘤部 位却难以达到有效地治疗浓度，进而导致许多的毒副作用的产生，给患者及其家属带来许 多的痛苦。为寻求一种安全、高效、靶向的剂型，研究者基于肿瘤微环境的通透性强、缺乏淋 巴系统、微酸性环境、高表达某些特殊蛋白质等特点，利用日新月异的纳米技术，希望能够 研发出更加稳定可靠的纳米载体以治疗肿瘤。
[0003] 无机材料介孔二氧化娃(mesoporous silica nanoparticles，MSNs)作为一种纳 米载体，其自身有着优良的属性，理化性质稳定、比表面积大、孔隙和粒度可控、可修饰性强 以及良好的生物相容性，是一种优良的药物载体，被广泛的应用于生物医药领域。但是MSNs 同样存在药物不可控释放以及到达靶标前药物泄漏，进而引发副作用的问题。
【发明内容】
[0004] 为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种具有肿瘤细胞靶向性的介 孔硅纳米组装体及其制备方法。本发明的介孔硅纳米组装体是透明质酸修饰的脂质-介孔 硅核壳纳米组装体，其利用了肿瘤组织与正常组织之间的结构差异，通过EPR效应使纳米粒 到达并滞留于肿瘤组织，而且由于肿瘤细胞过度表达的CD44受体，所以肿瘤细胞会大量摄 取透明质酸修饰的脂质-介孔硅核壳纳米组装体，进而达到增强肿瘤细胞内药物浓度，增强 治疗作用的能力。
[0005] 本发明提供一种具有肿瘤细胞靶向性的介孔硅纳米组装体的制备方法，具体步骤 如下：
[0006] (1)先以表面活性剂作为模板，正硅酸四乙酯作为硅源，在碱性条件下，75-85Γ温 度下合成得到粗品，再后处理除去表面活性剂，得到介孔硅；
[0007] (2)将介孔硅和药物在乙醇中混和，得到载药介孔娃;其中：所述药物选自阿霉素、 紫杉醇或1 〇-羟基喜树碱中任意一种；
[0008] (3)将载药介孔硅用磷酸盐缓冲溶液PBS分散后，加入到脂质体膜中，先水化，再均 质，得到脂质体包裹的介孔硅纳米粒;其中：所述脂质体膜由氢化大豆卵磷脂、胆固醇和二 硬脂酰磷脂酰乙醇胺反应制备得到；
[0009] (4)将脂质体包裹的介孔硅纳米粒和透明质酸HA反应，得到具有肿瘤细胞靶向性 的介孔硅纳米组装体。
[0010]上述步骤(1)中，表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵。
[0011 ]上述步骤⑴中，将粗品在乙醇和盐酸的混合液中回流，除去表面活性剂。
[0012] 上述步骤(3)中，在50-80°C温度下水化，在500-1200Pa条件下均质。
[0013]上述步骤（4)中，制备具有肿瘤细胞靶向性的介孔硅纳米组装体时，先用EDC和 NHSS对透明质酸HA进行活化。
[0014] 本发明中，介孔硅和药物的质量比为1:1-10:1;透明质酸与脂质体膜的质量比为 1:2-1:50;介孔娃与脂质体膜的质量比在1:2-1: 8。
[0015] 本发明还提供一种上述的制备方法得到的具有肿瘤细胞靶向性的介孔硅纳米组 装体。优选的，其粒径范围在80nm-450nm之间。
[0016]本发明的有益效果在于：
[0017] 本发明的介孔硅纳米组装体能够从靶向和防止药物扩散两方面增强肿瘤细胞对 药物的摄取，从而达到治疗肿瘤的效果，对于肿瘤的治疗具有明显的优势。
[0018] 本发明以脂质膜包覆于介孔硅表面，可解决介孔硅载药释放可控性差和提前泄露 的问题，间接地增强了纳米粒到达肿瘤部位的能力;而且再以透明质酸为靶点，能够有效地 促进肿瘤细胞对载药纳米粒的摄取，进而增强肿瘤细胞内的药物浓度，更加有利于肿瘤的 治疗。以上本发明的介孔硅纳米组装体综合了介孔硅和脂质体两者的优点，是一种极具潜 力的新型功能性载体。
【附图说明】
[0019] 图 l:MSNs(A)与 LB-MSNs(B)的透射电镜图。
[0020]图2:药物载体在激光共聚焦显微镜下的荧光成像结果。
[0021 ]图3:流式细胞仪测定的不同含药载体在HeLa细胞内的释药情况。
[0022] 图4:MTT实验结果。
【具体实施方式】
[0023] 本发明构建出的靶向过度表达CD44受体的肿瘤细胞的纳米粒，其介孔硅有着良好 的载药能力，脂质体包裹能够有效防止药物提前泄露，透明质酸能够有效靶向肿瘤细胞。 [0024] 实施例1
[0025] -种透明质酸修饰的脂质介孔硅核壳纳米组装体的制备方法 [0026] (1)介孔硅纳米颗粒的制备：取3.6mL的2mol/L NaOH溶液，加入到800mL水中，加热 至80°C，然后将溶解有2.4g十六烷基三甲基溴化铵CTAB的乙醇溶液加入到80°C热水中，在 转速700rpm的条件下反应2h。然后缓慢加入正硅酸四乙酯TEOS 8mL，再继续反应8h。在该反 应体系中加入等体积的乙醇，待有絮状沉淀析出后，过滤，将沉淀溶解在乙醇:盐酸=9:1的 混合液中，80°C回流8h，便可有效地除去表面活性剂，然后离心，干燥，即得平均粒径在85nm 左右的介孔硅纳米粒(MSNs)。
[0027] (2)将制备好的介孔硅用乙醇分散，将其与10mg/mL的阿霉素(D0X)溶液混溶，避光 搅拌8h，使其充分接触。8h后离心，用PBS缓冲液冲洗多次，待冲洗液无颜色时即得载药的介 孔硅DOXOMSNs。收集冲洗用的缓冲液以及残余的D0X溶液，利用紫外分光光度计，在波长为 480nm的条件下，测定残余溶液的DOX浓度，进而求得MSNs的载药量。经测定，最终MSNs的载 药量为11.28mg，即每lOOmg MSNs载11.28mg D0X。
[0028] (3)分别称取25mg氢化大豆卵磷脂、6.25mg胆固醇和1.64mg二硬脂酰磷脂酰乙醇 胺，溶于20mL三氯甲烷。30°C旋蒸成膜。用溶解了 10mg介孔硅的40mL PBS缓冲液水化脂质 膜，在60 °C的水浴条件下，使用旋转蒸发仪水化。均质机在1 OOOPa的条件下高压均质5min， 得包载有介孔硅的脂质体(LB-MSNs)。
[0029] (4)称取26mg透明质酸HA(200-400KDa)置于1 OmL蒸馏水(pH预先调至4.0)中，水合 过夜使之充分溶胀和溶解;加入12mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC) 和6.8mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHSS)，以lmol/L盐酸调节pH至4.0，于37°C水浴条件下活化 2h，活化的HA以10%的质量比（HA/Lipid)加至脂质体混悬液中，用0.1M硼酸盐缓冲溶液调 节体系pH至8.6，37 °C反应过夜；反应结束后，离心除去反应副产物和游离HA( 12000rpm，4 °C，30min)，去离子水洗涤3次，得到介孔硅纳米组装体D0X@HA-LB-MSNs。测定实施例1的纳 米粒的粒径、PDI和zeta电位，具体结果见表1。
[0030] 表 1
[0031]
[0032] 从上表能够看出，所制备介孔娃纳米粒MSNs粒径小，大小均勾，带有负电性；而该 纳米粒在被脂质双分子层包裹并被透明质酸修饰后，粒径增加，zeta电位增大，使纳米粒在 溶液中更加稳定。
[0033] 通过透射电镜研究实施例1中的纳米载体的微观结构，如图1 (MSNs(A)与LB-MSNs (B)的透射电镜图)所示。MSNs呈类球形，有清晰的孔道结构，粒径均一，结构规整，粒径大小 与SAXRD实验的结果相吻合，且有较大的比表面积。而LB-MSNs形状圆整，能够清楚地看到其 在介孔硅外包裹有一层脂质双分子层，这直接证明成功制备得到了脂质-介孔硅核壳纳米 载体。
[0034] 实施例2
[0035] -种透明质酸修饰的脂质介孔硅核壳纳米组装体的制备方法
[0036] (1)按照实施例1中所述方法制备介孔硅纳米颗粒的制备，将制备好的介孔硅用乙 醇分散，将其与15mg/mL的阿霉素(D0X)溶液混溶，避光搅拌8h，使其充分接触。8h后离心，用 PBS缓冲液冲洗多次，待冲洗液无颜色时即得载药的介孔硅D0X麵SNs。收集冲洗用的缓冲液 以及残余的D0X溶液，利用紫外分光光度计，在波长为480nm的条件下，测定残余溶液的D0X 浓度，进而求得MSNs的载药量。经测定，最终MSNs的载药量为12.68mg，即每100mg MSNs载 12.68mg DOX〇
[0037] (2)分别称取30mg氢化大豆卵磷脂、7.5mg胆固醇和1.92mg二硬脂酰磷脂酰乙醇 胺，溶于20mL三氯甲烷。30°C旋蒸成膜。用溶解了 20mg介孔硅的40mL PBS缓冲液水化脂质 膜，在60 °C的水浴条件下，使用旋转蒸发仪水化。均质机在1 OOOPa的条件下高压均质5min， 得包载有介孔硅的脂质体D0X@LB-MSNs。
[0038] (3)称取26mg HA(200-400KDa)置于10mL蒸馏水(pH预先调至4.0)中，水合过夜使 之充分溶胀和溶解；加入12mg EDC和6 · 8mg NHSS，以lmol/L盐酸调节pH至4 · Ο，于37°C水浴 条件下活化2h，活化的HA以10%的质量比（说/1^?丨(1)加至脂质体混悬液中，用0.謂硼酸盐 缓冲溶液调节体系pH至8.6，37°C反应过夜；反应结束后，离心除去反应副产物和游离HA (12000rpm，4°C，30min)，去离子水洗涤3次，得到介孔硅纳米组装体DOX@HA-LB-MSNs。测定 实施例2的纳米粒的粒径、PDI和zeta电位，具体结果见表2。
[0039] 表 2
[0040]
[0041 ] 实施例3
[0042] (1)按照实施例1，将制备好的介孔硅用乙醇分散，将其与10-羟基喜树碱溶液混 溶，避光搅拌24h，使其充分接触。8h后离心，用PBS缓冲液冲洗，真空干燥，即得包载10-羟基 喜树碱的MSNs，避光室温保存。
[0043] (2)分别称取25mg氢化大豆卵磷脂、6.25mg胆固醇和1.64mg二硬脂酰磷脂酰乙醇 胺，溶于20mL三氯甲烷。30°C旋蒸成膜。用溶解了 10mg介孔硅的40mL PBS缓冲液水化脂质 膜，在60 °C的水浴条件下，使用旋转蒸发仪水化。均质机在1000Pa的条件下高压均质5min， 得包载有介孔硅的脂质体。
[0044] (3)称取26mg HA(600-800KDa)置于10mL蒸馏水(pH预先调至4.0)中，水合过夜使 之充分溶胀和溶解；加入12mg EDC和6 · 8mg NHSS，以lmol/L盐酸调节pH至4 · 0，于37°C水浴 条件下活化2h，活化的HA以10%的质量比（说/1^?丨(1)加至脂质体混悬液中，用0.謂硼酸盐 缓冲溶液调节体系pH至8.6，37°C反应过夜；反应结束后，离心除去反应副产物和游离HA (12000rpm，4°C，30min)，去离子水洗涤3次，得到介孔硅纳米组装体D0X@HA-PL-MSNs。测定 实施例3的纳米粒的粒径、PDI和zeta电位，具体结果见表3。
[0045] 表 3
[0046]
[0047] 实施例4
[0048] (1)按照实施例1，将制备好的介孔硅用乙醇分散，将其与10-羟基喜树碱溶液混 溶，避光搅拌24h，使其充分接触。8h后离心，用PBS缓冲液冲洗，真空干燥，即得包载10-羟基 喜树碱的MSNs，避光室温保存。
[0049] (2)分别称取30mg氢化大豆卵磷脂、8.4mg胆固醇和1.96mg二硬脂酰磷脂酰乙醇 胺，溶于20mL三氯甲烷。30 °C旋蒸成膜。用溶解了 15mg介孔硅的40mL PBS缓冲液水化脂质 膜，在60 °C的水浴条件下，使用旋转蒸发仪水化。均质机在1000Pa的条件下高压均质5min， 得包载有介孔硅的脂质体。
[0050] (3)称取18mg HA(600-800KDa)置于10mL蒸馏水(pH预先调至4.0)中，水合过夜使 之充分溶胀和溶解；加入12mg EDC和6 · 8mg NHSS，以lmol/L盐酸调节pH至4 · Ο，于37°C水浴 条件下活化2h，活化的HA以12%的质量比（HA/Lipid)加至脂质体混悬液中，用0.1M硼酸盐 缓冲溶液调节体系pH至8.6，37°C反应过夜；反应结束后，离心除去反应副产物和游离HA (12000rpm，4°C，30min)，去离子水洗涤3次，得到介孔硅纳米组装体DOX@HA-LB-MSNs。测定 实施例4的纳米粒的粒径、PDI和zeta电位，具体结果见表4。
[0051] 表 4
[0052]
[0053]应用实施例
[0054] 应用上述实施例1所制备的载药浓度为0.028mg/mL的DOXiMSNs溶液、DOXOLB-MSNs 溶液、DOXOHA-LB-MSNs溶液，然后配制0.028mg/mL的D0X溶液作为对照。
[0055] -、特异性胞内摄取
[0056] (1)透明质酸介导的细胞摄取
[0057] 以激光共聚焦显微镜观察比较FITC标记的D0X@HA-LB-MSNs与D0X@LB-MSNs在pH 7.4时的摄取情况。
[0058]将HeLa细胞以5 X104个/孔接种于12孔板的玻璃盖玻片上，每孔加入含10%胎牛 血清的DMEM培养基1.5mL，置于37 °C，5 %⑶2恒温培养箱中培养。培养8h，分别加入含有 MSNs、LB-MSNs与HA-LB-MSNs的DMEM培养基，不含纳米粒的空白培养液作为阴性对照，于培 养箱中共孵育5h。移除培养基，以4°C无菌PBS冲洗细胞，以90%甘油封片，置于共聚焦显微 镜下观察。
[0059] (2)流式细胞仪定量测定药物胞内摄取量
[0060] 以流式细胞仪定量测定D0X0HA-LB-MSNS在PH7.4培养基中HeLa细胞的摄取量，并 以 D0X 溶液、DOXOMSNs、D0X@LB-MSNs 作为对照。
[0061 ] 将HeLa细胞以2X 104个/孔接种于12孔板中，每孔加入含10%胎牛血清DMEM培养 基1.5mL，置于37 °C，5 % C02恒温培养箱中培养。培养8h后，待细胞密度为5 X 105个/孔时，分 别加入含有不同纳米载体的DMEM培养基丙酮溶液，于培养基中共孵育6h，移除培养基，以4 °C无菌PBS冲洗细胞三遍，胰酶消化，2000rmp离心3min，细胞重悬于0.5mL PBS缓冲液中，采 用流式细胞仪检测红色荧光强度，绘制胞内荧光强度-时间曲线。
[0062] 药物载体在激光共聚焦显微镜下的荧光成像结果如图2所示，所载药物阿霉素用 红色荧光表示，连接有介孔硅载体表面连接的荧光物质FITC用绿色荧光表示。结果表明，各 载体组荧光强度依次为HA-LB-MSNs，LB-MSNs，MSNs。从图中可以清晰的看出，与MSNs、LB-MSNs组相比，HA-LB-MSNs组在HeLa细胞中的红色和绿色荧光强度最大。这充分说明了HeLa 胞能够有效的靶向摄取HA-LB-MSNs，也即证明HA-LB-MSNs能够被肿瘤细胞摄取，并将药物 在肿瘤细胞内释放。
[0063] 从图3(流式细胞仪测定的不同含药载体在Hela细胞内的释药情况)可以看出，从 右往左，各细胞内药物浓度依次为D0X@HA-LB-MSNs，D0X@LB-MSNs，D0X溶液，DOXiMSNs以及 空白对照。很明显，DOXOHA-LB-MSNs在HeLa细胞内释药量是最大的，约为D0X溶液组的3倍左 右，DOXOLB-MSNs的两倍左右。这一结果与图2的结果相印证，进一步证明HA-LB-MSNs
[0064] 对肿瘤细胞胞内主动递送具有明显的促进作用，能够有效靶向肿瘤细胞并运输药 物进入肿瘤细胞。
[0065] 二、体外抗肿瘤效果
[0066] 以 MTT 法检测 D0X@HA-LB-MSNs 体外细胞毒性，并以D0X 溶液、D0XiMSNs、D0X@LB-MSNs作为对照。
[0067] 将HeLa细胞以2X 104个/孔或者1 X 104个/孔接种于96孔板中，每孔加入含10%胎 牛血清DMEM培养基0. lmL，置于37°C，5 %C02恒温培养箱中培养。培养24小时后，以培养基稀 释药物，药物浓度设定6个梯度（以所载0(?为标准，0,0.25、0.5、1、2、4、8卩 8/1^)，每组设3个 复孔，培养4h后，吸出培养液，换入新鲜培养基，在培养细胞12、24、48h。孵育结束后，每孔加 入新鲜配制的MTT溶液(5mg/mL) 10yL，继续孵育4h;弃去上清液，每孔加入DMSO 100yL，置37 °(：摇床中震荡溶解紫色结晶产物，于490nm处检测吸收度值。
[0068] 从图4(MTT实验结果)可以看出，D0X溶液与D0X麵SNs对细胞活力的抑制效果最弱， 细胞的存活率一直在70%以上，LB-MSNs次之，HA-LB-MSNs对肿瘤细胞的抑制作用最为明 显，细胞的抑制作用降低到30%左右，这一结果与上述图2,与图3的结果相互印证，表明HA-LB-MSNs能够有效地被HeLa细胞摄取，并将药物释放在肿瘤细胞内，进而抑制细胞的生长， 从而达到抗肿瘤的目标。
[0069]综上所述，该种载药系统能够从靶向和防止药物扩散两方面增强肿瘤细胞对药物 的摄取，从而达到治疗肿瘤的效果，对于肿瘤的治疗具有明显的优势。
【主权项】
1. 一种具有肿瘤细胞靶向性的介孔硅纳米组装体的制备方法，其特征在于，具体步骤 如下： (1) 先以表面活性剂作为模板，正硅酸四乙酯作为硅源，在碱性条件下，75-85Γ温度下 合成得到粗品，再后处理除去表面活性剂，得到介孔硅； (2) 将介孔硅和药物在乙醇中混和，得到载药介孔硅;其中：所述药物选自阿霉素、紫杉 醇或10-羟基喜树碱中任意一种； (3) 将载药介孔硅用磷酸盐缓冲溶液PBS分散后，加入到脂质体膜中，先水化，再均质， 得到脂质体包裹的介孔硅纳米粒;其中：所述脂质体膜由氢化大豆卵磷脂、胆固醇和二硬脂 酰磷脂酰乙醇胺反应制备得到； (4) 将脂质体包裹的介孔硅纳米粒和透明质酸HA反应，得到具有肿瘤细胞靶向性的介 孔硅纳米组装体。2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，表面活性剂是十六烷基三 甲基溴化铵。3. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，将粗品在乙醇和盐酸的混 合液中回流，除去表面活性剂。4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，在50-80°C温度下水化，在 500-1200Pa条件下均质。5. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，制备具有肿瘤细胞靶向性 的介孔硅纳米组装体时，先用H)C和NHSS对透明质酸HA进行活化。6. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，介孔硅和药物的质量比为1:1-10:1; 透明质酸与脂质体膜的质量比为1:2-1:50;介孔娃与脂质体膜的质量比在1:2-1: 8。7. -种根据权利要求1-6之一所述的制备方法得到的具有肿瘤细胞靶向性的介孔硅纳 米组装体。8. 根据权利要求7所述的具有肿瘤细胞靶向性的介孔硅纳米组装体，其特征在于，其粒 径范围在80nm-450nm之间。
【文档编号】A61K47/48GK105997881SQ201610594756
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月26日
【发明人】吴范宏, 王智慧, 田永峰, 于艳艳, 甘莉
【申请人】上海应用技术学院