专利名称：测定酚氧化酶原活化酶活性的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种测定酚氧化酶原活化酶(以下称为PPAE)活性的方法及一种利用所述测定方法测定β-1，3-葡聚糖和肽聚糖的方法。
昆虫的体液中有一个涉及一系列酶的称为酚氧化酶原活化系统(以下称为proPO活化系统)的级联，该级联与体液中的黑素形成过程有关。已知β-1，3-葡聚糖(一种真菌细胞壁组分)和肽聚糖(一种细菌细胞壁组分)能触发所述级联(Onishi，Annot.Zool.Jpn.，2733-39，1954;Ahida和Onishi，Arch.Biochem.Biophys.，122411-416，1967;Brunet，Insect Biochem.，10467-500，1980;Ashida和Yamazaki，Molting and Metamorphosis，239-265，Japan Sci.Soc.Press，1990)，这种作用被归因于对β-1，3-葡聚糖具有特异亲和性的β-1，3-葡聚糖识别蛋白(βGRP;分子量为62kD)和对肽聚糖具有特异亲和性的肽聚糖识别蛋白(PGRP;分子量为19kD)，这两种蛋白存在于所述proPO活化系统中。当其中任一种蛋白识别β-1，3-葡聚糖或肽聚糖时，则开始一系列的级联反应。经过一些尚未阐明的反应，包括一种需Ca2+酶的反应，产生一种能将酚氧化酶原(酚氧化酶的前体，以下称为proPO)转化为酚氧化酶(以下称为PO)的PPAE(Ashida和Dohke，Insect Biochem.，1037-47，1980)。
鉴于这一现象，已进行了各种研究而试图建立通过以所述级联反应为基础测定β-1，3-葡聚糖和肽聚糖而检测细菌感染和真菌感染的方法，以及对治疗剂进行安全检验的方法。
目前，一直用鲎试验试剂作为检测细菌感染和对治疗剂等进行安全检验的试剂，该试剂使用了鲎的变形虫状细胞溶解液，而鲎(Limulus polyphemus、Tachypleus tridentatus)也具有与昆虫类似的体内级联。然而，鲎体内缺少能与肽聚糖反应的系统，所以只可能检测到β-1，3-葡聚糖的脂多糖，这样便漏掉了不含脂多糖的革兰氏阳性菌。此外，提供该试剂的鲎在日本的数量有限，总会由于其未来供应量不稳定而造成某种困难。
另一方面，如果采用昆虫的级联(proPO活化系统)，则预计既可以有稳定的试剂供应，又可以对包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细菌(更不用说真菌)进行检测，因为该级联包括对肽聚糖有反应的系统。还可以从体液中分离出能与肽聚糖特异反应的组分或能与β-1，3-葡聚糖特异反应的组分，从而彼此独立地特异检测β-1，3-葡聚糖(真菌)和肽聚糖(细菌)(美国专利4，970，152)。
以昆虫级联为基础的测定方法包括了一种常规方法，其中通过测定由于proPO被PPAE转化为PO而产生的PO活性来检测β-1，3-葡聚糖和肽聚糖。该方法遇到的问题是PO(一种不稳定的酶)发生自身氧化以及检测灵敏度达不到显著增强。
为解决这些问题，Kenneth T.Soderhall提出了一种测定β-1，3-葡聚糖和内毒素(脂多糖)的方法，该方法使用一种合成肽作底物来测定能活化PO的某些丝氨酸蛋白酶活性(EP-A-96689)。该方法所用的底物在构建时并没有考虑到催化proPO转化为PO的PPAE的反应特异性，而只是依据了PPAE属于丝氨酸蛋白酶这样一个事实。且不说β-1，3-葡聚糖和内毒素(脂多糖)，就是PPAE活性是否能精确测定也尚有争议。
因此，本发明的一个目的是提供一种精确测定PPAE活性的方法，该方法是基于PPAE固有的底物特异性和高度的反应特异性而实现的。
本发明的另一个目的是提供一种利用所述PPAE活性测定方法测定β-1，3-葡聚糖和肽聚糖的方法。
本发明人分析了PPAE的固有底物proPO的一级结构，成功地阐明了PPAE所识别和切割的区域的氨基酸顺序。
根据这些发现，本发明涉及一种测定PPAE活性的方法和一种测定β-1，3-葡聚糖和/或肽聚糖的方法，前者使用包含proPO上PPAE识别一切割位点的肽链作为底物，后者则利用所述方法测得的PPAE活性作为指标。
图1是用于纯化PPAE的硫酸铵分级分离步骤的示意图。
图2显示了用合成肽作底物时，用液相色谱法测得的PPAE活性的分析结果，其中1是反应产物峰(2-Pyr-Ala-Leu-Asn-Arg-OH)，2是合成肽峰(2-Pyr-Ala-Leu-Asn-Arg-Phe-Gly-OH)。
图3是显示PPAE浓度和PPAE活性相关性的曲线图。
图4是用合成肽作底物检测CM-凝乳聚糖(CM-curdlan)的液相色谱图，其中1是反应产物峰(2-Pyr-Ala-Leu-Asn-Arg-OH)，2是合成肽峰(2-Pyr-Ala-Leu-Asn-Arg-Phe-Gly-OH)。
图5是显示CM-凝乳聚糖浓度和PPAE活性相关性的曲线图。
图6是用合成肽作底物检测肽聚糖的液相色谱图，其中1是反应产物峰(2-Pyr-Ala-Leu-Asn-Arg-OH)，2是合成肽峰(2-Pyr-Ala-Leu-Asn-Arg-Phe-Gly-OH)。
本发明是一种测定PPAE活性的方法，该方法包括至少测定PPAE与式(Ⅰ)的肽链接触时产生的X-Arg或YX-Arg-Y (Ⅰ)其中X为任选标记的氨基酸残基或肽残基，该残基带有任选保护的α-氨基或N末端，条件是邻接Arg的氨基酸残基不为Gly或Ala;Y为能够通过酰胺键或酯键与Arg的羧基结合的有机残基，或者任选标记的氨基酸残基或肽残基，该残基带有任选保护的α-羧基或C末端，所述肽链能够被得自昆虫的PPAE水解成X-Arg和Y[以下也称作测定(1)];本发明特别是如下定义的方法其中所述X为下式的基团X′-Asn其中X′为任选标记的氨基酸残基或肽残基，该残基带有任选保护的α-氨基或N末端，条件是X′的氨基酸数目为X的氨基酸数目减1，或者X′为Asn的α-氨基的保护基;并且/或者Y为下式的基团Phe-Gly-Z其中Z为任选标记的氨基酸残基或肽残基，该残基带有任选保护的α-羧基或C末端，条件是Z的氨基酸数目为Y的氨基酸数目减2，或者Z为Gly的羧基的保护基。此外，本发明涉及测定PPAE活性的方法，该方法包括使用包括紫外或可见光吸收、发光、荧光、放射性或磁性在内的测定方法。
本发明还是一种测定β-1，3-葡聚糖和/或肽聚糖的方法，该方法包括用PPAE活性作为指标，所述PPAE的测定方法是至少测定proPO活化系统和β-1，3-葡聚糖和/或肽聚糖与式(Ⅰ)的肽链接触时产生的X-Arg或YX-Arg-Y (Ⅰ)其中X为任选标记的氨基酸残基或肽残基，该残基带有任选保护的α-氨基或N末端，条件是邻接Arg的氨基酸残基不为Gly或Ala;Y为能够通过酰胺键或酯键与Arg的羧基结合的有机残基，或者任选标记的氨基酸残基或肽残基，该残基带有任选保护的α-羧基或C末端，所述肽链能够被得自昆虫的PPAE水解成X-Arg和Y[以下也称作测定(2)];本发明特别是如下定义的方法其中所述X为下式的基团
X′-Asn其中X′为任选标记的氨基酸残基或肽残基，该残基带有任选保护的α-氨基或N末端，条件是X′的氨基酸数目为X的氨基酸数目减1，或者X′为Asn的α-氨基的保护基;并且/或者Y为下式的基团Phe-Gly-Z其中Z为任选标记的氨基酸残基或肽残基，该残基带有任选保护的α-羧基或C末端，条件是Z的氨基酸数目为Y的氨基酸数目减2，或者Z为Gly的羧基的保护基。此外，本发明涉及测定β-1，3-葡聚糖和/或肽聚糖的方法，该方法包括使用包括紫外或可见光吸收、发光、荧光、放射性或磁性在内的测定方法。
此外，本发明涉及一种测定β-1，3-葡聚糖的方法和一种测定肽聚糖的方法，这两种方法都包括测定(2)的步骤，但前一方法使用除去了与肽聚糖特异反应的组分后得到的proPO活化系统[以下也称作测定(3)]，后一方法使用除去了与β-1，3-葡聚糖特异反应的组分后得到的proPO活化系统[以下也称作测定(4)]。
本发明的测定PPAE活性的方法[测定(1)]包括测定PPAE与底物肽链X-Arg-Y接触而得到的反应产物X-Arg和Y中的至少一种。
底物X-Arg-Y是由两个或更多个氨基酸残基组成的肽链，它不受任何特殊限制，而只需要满足下列要求A.可被得自昆虫的PPAE分解成X-Arg和Y。
B.X-Arg和Y中至少有一个可根据其化学或物理性质来测定。
C.Arg的α-氨基与Gly和Ala以外的氨基酸残基结合。
这里所用的肽链包括肽和肽衍生物。肽衍生物是指在肽的N末端和/或C末端带有保护基的衍生物、带有标记氨基酸残基的衍生物等。
与Arg结合的X和Y不受任何限制，而只需要满足上述A-C的要求。
X的例子包括除Gly和Ala以外的氨基酸残基，以及C末端氨基酸残基不为Gly或Ala的肽残基。可以对这些氨基酸残基和肽残基进行标记，并可对其α-氨基或N末端进行保护。
X优选为式X′-Asn的基团，其中X′为任选标记的氨基酸残基或肽残基，该残基带有任选保护的α-氨基或N末端，条件是X′的氨基酸数目为X的氨基酸数目减1，或者X′为Asn的α-氨基的保护基。
更为优选的是，X为带有家蚕(Bombyx mori)proPO氨基酸顺序C末端的至少2个氨基酸的基团，如下所示X＝Phe-Gln-Leu-Thr-Glu-Gln-Phe-Leu-Thr-Glu-Asp-Tyr-Ala-Asn-Asn-Gly-Ile-Glu-Leu-Asn-Asn或X＝Tyr-Gln-Arg-Val-Ser-Asn-Ala-Ile-Gly-Asn氨基酸残基的数目优选为2-20。
这里所用的肽残基或氨基酸残基的N-末端或α-氨基的保护基，以及Asn的α-氨基的保护基，可以是能够保护氨基酸残基的α-氨基的任何基团，其实例有含2-18个碳原子的苄氧羰基、琥珀酰基或烷氧羰基。
X-Arg-Y中的Y是能够通过酰胺键或酯键与Arg的羧基结合的有机残基，或者是氨基酸残基或肽残基。可以对这些氨基酸残基和肽残基进行标记，并可对其α-氨基或C末端进行保护。
有机残基是指通过酰胺键或酯键与Arg的羧基结合，并由于PPAE的作用而从X-Arg上释放出来的残基。有机残基不受任何特殊限制，只要求它能够用物理或化学方法检测，或只要求它从X-Arg-Y上释放出来而产生X-Arg和Y(有机残基)时使反应体系的性质发生改变从而可以用物理或化学方法测定。
其实例包括(但不限于)生色基团，如对硝基苯胺基和2-氯-4-硝基苯胺基;发光基团，如2-吡啶氨基、3-吡啶氨基、β-萘氨基、7-氨基-4-甲基香豆素和7-羟基-4-甲基香豆素;用同位素如125I、14C和3H标记的有机残基;以及磁性基团。
关于Y，肽残基优选为Phe-Gly-Z，其中Z为任选标记的氨基酸残基或肽残基，该残基带有任选保护的α-羧基或C末端，条件是Z的氨基酸数目为Y的氨基酸数目减2，或者Z为Gly的羧基的保护基。
更优选的是，Y为带有家蚕proPO氨基酸顺序N末端的至少2个氨基酸残基的基团，如下所示Y＝Phe-Gly-Asp-Asp-Ala-Ser-Glu-Lys-Ile-Pro-Leu-Lys-Asn-Leu-Ser-Lys-Leu-Pro-Glu-Phe-Lys-Ile或Y＝Phe-Gly-Ser-Asp-Ala-Gly-Arg-Met-Ile-Pro氨基酸残基的数目优选为2-20。
氨基酸残基不受特殊限制，但优选为Phe。
这里所用的肽残基或氨基酸残基的C末端或羧基的保护基，以及Gly的羧基的保护基，可以是能够保护氨基酸残基的α-羧基的任何基团，其典型实例为芳烷氧基，例如苄氧基或苯乙氧基。
在本发明中，标记物不受特殊限制，只要求它能修饰或取代肽残基或氨基酸残基的一部分，其结果是能够对含所述肽残基或氨基酸残基的化合物进行测定。
标记物的例子包括(但不限于)酶免疫测定中所用的酶，如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、过氧化物酶、微过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶和荧光素酶;放射免疫测定中所用的放射性同位素，如99mTc、131I、125I、14C和3H;荧光物质，如2-氨基吡啶、3-氨基吡啶，以及用于荧光免疫测定的荧光素、丹酰、荧光胺、香豆素、萘胺及其衍生物;发光物质，如荧光素、异鲁米诺、鲁米诺和草酸二(2，4，6-三氟苯基)酯;在紫外范围内有吸收的物质，如苯酚、萘酚、蒽及其衍生物;具有自旋标记性质的物质，例如带有烃氧基(如4-氨基-2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧基、3-氨基-2，2，5，5-四甲基吡咯烷-1-氧基、2，2-二叔丁基-α-(3，5-二叔丁基-4-氧-2，5-环已二烯-1-亚基)对甲苯氧基)的化合物。
作为PPAE来源的昆虫(昆虫纲)不受任何特殊限制，但优选那些有成熟饲养方法的昆虫，其实例包括鳞翅目，如蚕蛾科(Bombycidae)、烟草天蛾(Manduca sexta);双翅目，如家蝇(Muscadomestica、Boettcherisca Peregrina;直翅目，如蝗虫(Locustamigratoria)和Emmafield蟋蟀;甲虫(鞘翅目)，如Acalolepta luxuriosa。
不管什么发育阶段的昆虫都可使用，可以使用幼虫或成虫。鳞翅目、双翅目和鞘翅目的昆虫优选幼虫。
在本发明的测定PPAE活性的方法中，与X-Arg-Y接触的PPAE不受任何限制，只要求它是得自昆虫的PPAE本身或含有这种PPAE。含PPAE物质的优选实例是昆虫的体液。这种体液从易得性考虑一般是得自昆虫体腔的血淋巴。
制取血淋巴的方法有很多。优选方法包括将昆虫置于冰上使其不活动，在其体腔内注射生理盐水，将昆虫放置一会儿后从体腔内采集血淋巴。所注射的生理盐水中含有含蔗糖因子杂质(甘蔗中所含的高分子物质，由葡萄糖、氨基酸等组成)的蔗糖或蔗糖因子本身。以这种方式制取的血淋巴可以进行离心而除去血细胞，再进行透析而得到血浆备用。
本发明的测定PPAE活性的方法包括测定昆虫体液中所含的PPAE与上述肽链X-Arg-Y接触时产生的反应产物。
反应产物的检测可以用以X-Arg和Y中至少一种反应产物的化学或物理性质为基础的任何方法来进行。
这种方法的实例包括光吸收测定法、比色法、荧光法(见“图说荧光抗体”，软科学公司)、发光法(见“酵素免疫测定法、蛋白质核酸酵素”别册Vol.31，pp251-263，共立出版(株))、核磁共振谱(见“酵素免疫测定法、蛋白质核酸酵素”别册vol.31，pp264-271，共立出版(株))。
具体列举下列方法。
如果Y是生色基团如对硝基苯胺基，则可用常规方法测定反应前后系统光吸收的变化(吸收曲线);如果Y是荧光基团如β-萘氨基，则可用常规方法测定反应前后系统荧光强度的变化。如果Y是用同位素如14C或3H标记的有机残基，则可先根据X-Arg和Y的不同性质如分子量、疏水性和亲水性进行液相色谱或电泳分离，然后再根据所用同位素的种类用某种检测方法测定Y的存在。如果Y是有磁性的有机残基，则可通过磁粉的作用将X-Arg-Y固定在固相载体上，根据X-Arg从X-Arg-Y中释放的量来进行测定。
即使Y不具有检测特异性如荧光，也可先根据诸如分子量、疏水性等不同性质用液相色谱法或电泳法分离X-Arg和Y，然后通过测定光吸收来进行检测。如果X-Arg在显色、荧光、发光、放射性等方面具有特异性质，也可以用根据它所具有的性质而适当选择的检测方法测定X-Arg的生成量或X-Arg-Y的残留量。
如果X是用酶标记的，则可测定由于X-Arg或X-Arg-Y与能够起标记酶的底物作用的物质接触而引起的底物变化，从而测定PPAE活性。例如，如果X是用过氧化物酶标记的，则使用5-氨基水杨酸或邻苯二胺作底物时优选测定光吸收的变化(比色法);使用3-(对羟基苯基)丙酸时优选荧光法;使用鲁米诺时优选发光法。另外，如果X是用碱性磷酸酶标记的，则使用对硝基苯基磷酸作底物时优选比色法;使用4-甲基-7-羟基香豆素基磷酸时优选荧光法;使用4-甲氧基-4-(3-磷酸苯基)螺[1，2-二氧杂环丁烷-3，2′-金刚烷]二钠盐(AMPPD)时优选发光法。
本发明的测定β-1，3-葡聚糖和/或肽聚糖的方法[测定(2)]包括使用用如下方法测定的PPAE活性作指标至少测定proPO活化系统和β-1，3-葡聚糖和/或肽聚糖与上述式(Ⅰ)的肽链接触时产生的X-Arg或Y。
也就是说，测定(2)利用了上述测定(1)来检测用作指标的PPAE活性，其中用PPAE活性作指标来测定β-1，3-葡聚糖和/或肽聚糖，该PPAE活性是由于β-1，3-葡聚糖和/或肽聚糖的存在使proPO活化系统活化而诱导出来的。
proPO活化系统含有能特异识别β-1，3-葡聚糖的组分和/或能特异识别肽聚糖的组分。在proPO活化系统中，反应链由于β-1，3-葡聚糖和/或肽聚糖的存在而受到触发，由于一系列酶的作用而最终活化至少三个前体，即proBAEE酶(具有水解苯甲酰精氨酸乙酯活性的酶的前体)、proPPAE(活化proPO的丝氨酸蛋白酶的前体)、以及proPO，该系统是一个级联。
本发明的测定(2)所用的proPO活化系统可以是proPO活化系统本身，也可以含有proPO活化系统。含proPO活化系统的物质的优选实例是昆虫的体液。
昆虫体液的例子是上述的得自昆虫体腔的血淋巴。制取血淋巴的方法和所用昆虫的种类如前所述。
作为本发明测定对象的β-1，3-葡聚糖的例子包括(但不限于)带有β-1，3-键的葡萄糖聚合物或其衍生物，例如酵母聚糖、凝乳聚糖、茯苓聚糖、巩膜聚糖(sclerotan)、蘑菇多糖、裂裥菌素、choriolan、昆布聚糖、地衣聚糖及其衍生物。
同样是本发明测定对象的肽聚糖不受具体限制，其实例是构成各种细菌细胞壁的组分，例如属于微球菌属、链球菌属、金色杆菌属、芽孢杆菌属和土壤杆菌属的细菌。
本发明的测定(2)旨在特异性地检测和定量测定β-1，3-葡聚糖和/或肽聚糖。根据这一方法，有可能鉴定含有β-1，3-葡聚糖和/或肽聚糖的样品，或定量测定样品中的β-1，3-葡聚糖和/或肽聚糖。
测定(2)旨在测定反应混合物中的PPAE活性，其测定方法是按照上述测定(1)，测定由可能含有β-1，3-葡聚糖和/或肽聚糖的样品组成的溶液、含有式(Ⅰ)肽链的溶液及含有proPO活化系统(优选昆虫体液)的溶液中，经过一定的反应时间后产生的X-Arg或Y。
所用的肽链只需具有可检测的浓度，并根据测定系统而适当制备。proPO活化系统的量只需是能使proPO级联产生作用的量，这一量根据测定方法来适当调节。
反应pH一般为4-11，优选6-9。可以用缓冲液来维持所述pH，该缓冲液的种类和浓度不受任何特殊限制，只要求它对反应没有不利影响，其实例包括磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、Tris缓冲液和Good缓冲液。
反应温度和反应时间也不受任何限制，只要求能使反应进行。反应温度一般为0-50℃，优选4-30℃。反应时间一般为1秒至20小时，优选10秒至2小时。
优选的是，本发明的测定系统中应含有0.001-1000mM，优选5-100mM二价金属离子，如Ca2+或Mg2+。
如果在要用测定(2)测定β-1，3-葡聚糖和/或肽聚糖的样品中含有β-1，3-葡聚糖和肽聚糖，则所得到的PPAE活性以β-1，3-葡聚糖和肽聚糖的总和表示。
本发明的测定(3)特异检测和定量测定β-1，3-葡聚糖，本发明的测定(4)特异检测和定量测定肽聚糖。
测定β-1，3-葡聚糖的测定(3)就是上述的测定(2)，但其中使用的proPO活化系统已去除了与肽聚糖特异反应的组分。与肽聚糖特异反应的组分的例子有肽聚糖识别蛋白。
测定肽聚糖的测定(4)就是上述的测定(2)，但其中使用的proPO活化系统已去除了与β-1，3-葡聚糖特异反应的组分。与β-1，3-葡聚糖特异反应的组分的例子有β-1，3-葡聚糖识别蛋白。
从proPO活化系统中去除与肽聚糖或β-1，3-葡聚糖特异反应的组分的方法，包括生化领域常用的分离和纯化方法，例如凝胶过滤、电泳、亲和色谱、离子交换色谱和离心。作为除去与肽聚糖特异反应的组分的方法，可以举出使用结合有肽聚糖的载体的亲和色谱法(美国专利4，970，152)，作为除去与β-1，3-葡聚糖特异反应的组分的方法，可以举出使用结合有β-1，3-葡聚糖的载体的亲和色谱法(美国专利4，970，152)。
根据本发明，可以精确地定量测定PPAE活性，并可提供一种高度精确的测定β-1，3-葡聚糖和/或肽聚糖的方法，其中用所述PPAE活性作指标。
此外，借助本发明可以不经培养增殖而对真菌和细菌进行检测，这样便有可能对微生物感染进行早期诊断。本发明可以应用于广泛的用途，例如水和食品的微生物污染检验、治疗剂如抗生素和注射制剂的安全检验等。
本发明用下列示例性实施例和参考例更详细地说明，但这些实施例和参考例决不限制本发明。
参考例1养殖家蚕proPO的PPAE识别一切割位点的氨基酸顺序的鉴定(1)从养殖家蚕幼虫中纯化proPO在约200ml得自五龄养殖家蚕幼虫的血淋巴中，加入饱和硫酸铵(pH6.5)，得到70%硫酸铵溶液，将该溶液于4℃下放置过夜。向其中加入0.2M磷酸钾缓冲液(pH6.5)，得到40%硫酸铵溶液。将该溶液小心搅拌2小时并放置，然后于8000rpm下离心20分钟(日立RPR9-2转子，下同)，得到上清液。然后在上清液中加入饱和硫酸铵(pH6.5)，得到50%硫酸铵溶液，将该溶液放置过夜。将该溶液于8000rpm下离心20分钟使其发生沉淀。将沉淀物溶解于0.1M磷酸钾缓冲液(pH6.5)-20%硫酸铵溶液(pH6.5)中，再向其中加入饱和硫酸铵(pH6.5)，得到38%硫酸铵溶液。将混合物搅拌1小时，放置2.5小时，并以10000rpm离心20分钟，得到上清液。向其中加入饱和硫酸铵(pH6.5)，得到48%硫酸铵溶液。将混合物搅拌30分钟，放置过夜，并于8000rpm离心20分钟使其沉淀。将沉淀物溶解于0.01M磷酸钾缓冲液中，并用相同缓冲液透析。
将经过透析的样品以12000rpm离心20钟，所得上清液在65℃水浴中搅拌温热至54.5℃，然后在55℃水浴中再温热5分钟。用冰迅速冷却后，将样品以18000rpm离心20分钟，得到上清液。
对上清液进行DEAE纤维素柱色谱(日本和光纯药工业株式会社制造，φ1.5×19cm)，用KCl梯度进行洗脱以进行分级分离。检查每个部分用粗制PPAE活化后产生的可能的PO活性，借此来收集proPO部分。将所得的proPO部分用0.04MKCl-0.01M磷酸钾缓冲液(pH6.0)透析。
对样品进行羟磷灰石柱色谱(日本和光纯药工业株式会社制造，φ1.5×9.3cm)，并用50mM、75mM或95mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)洗脱。用上述方法测定所得各部分中的PO活性。结果证实在50mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)中洗脱出了proPO，并回收了其各部分。
将各部分在Sartrius公司的Collodion Bag(SM13200)中浓缩，并用0.01M Tris-HCl缓冲液(pH7.75)透析，得到纯化的proPO溶液。
(2)PPAE的纯化将五龄养殖家蚕幼虫的表皮匀浆液用硫酸铵进行分级分离，并回收0.2-0.4%硫酸铵部分。将各部分用0.01M Tris-HCl-0.01M CaCl2缓冲液(pH8.5)透析，然后用0.01M Tris-HCl缓冲液(pH8.5)透析。将经过透析的溶液倒在DEAE纤维素柱上，并用0.01M Tris-HCl缓冲液(pH8.5)洗脱。回收显示PPAE活性的部分并加到羟磷灰石柱上。所得各部分用0.01M磷酸钾缓冲液(pH7.5)洗涤，再用0.01M-0.5M磷酸钾缓冲液(pH7.5)线性梯度洗脱。收集显示PPAE活性的各部分并作为纯化的PPAE溶液使用。
(3)用PPAE切割proPO而得到的肽片段的氨基酸顺序分析将上述纯化的proPO与纯化的PPAE一起保温。将反应混合物加到Sephadex G-50柱上，用0.01M磷酸钾缓冲液(pH8.0)洗脱，并回收从proPO上切割并释放出的肽链。用ODS柱将这些肽链分成三个片段(fⅠ、fⅡ、fⅢ)。用Lys-内肽酶处理这些片段使其断裂，并用埃德曼降解法检查其氨基酸顺序。结果发现，fⅠ和fⅡ具有相同的顺序(顺序表中的2号顺序)，但略有不同，fⅢ具有不同的顺序(顺序表中的1号顺序)。
(4)用PPAE切割上述来自proPO的肽而产生的PO的N末端氨基酸顺序分析将0.01M磷酸钾缓冲液(pH7.5)中的proPO、硫脲和75mM磷酸钾(pH7.5)中的PPAE于0℃下保温3小时，将所有proPO转化为PO。用ODS柱将反应混合物分成两个主要部分，用埃德曼降解法鉴定每个N末端的氨基酸顺序(顺序表中的3号和4号顺序)。
参考例2家蚕proPO上的PPAE识别一切割位点的DNA碱基顺序的鉴定(1)养殖家蚕cDNA文库的构建由500只五龄养殖家蚕幼虫制取体液(25ml)并离心(40G，15分，4℃)分离血细胞。利用RNA提取试剂盒ISOGEN(日本和光纯药工业株式会社制造)从血细胞中制得约800μg总RNA。
利用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)由总RNA制得mRNA，利用cDNA合成试剂盒(Pharmacia)合成cDNA。将合成的cDNA克隆到λZAPⅡ噬菌体载体的EcoRI位点中，并利用Gigapack Gold包装提取物(Stratagene)进行体外包装。结果得到4.2×105噬斑形成单位(PFU)的噬菌体文库。
(2)proPO克隆的筛选利用PicoBlueTM免疫筛选试剂盒(Stratagene)进行筛选。
将养殖家蚕cDNA噬菌体文库(1.5×104PFU)与200μ1大肠杆菌XL-1 Blue(OD600约为0.5)混合，将该混合物于37℃下保温15分钟，然后接种在NZY平皿中(1.5%琼脂、1%NZ胺、0.2%MgSO4·7H2O、0.5%细菌酵母提取物、0.5%NaCl、12.5μg/ml四环素，pH7.5)，于42℃下培养约3.5小时。出现噬斑后，在其上放一块浸渍有10mM IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)的硝酸纤维素滤膜(Amersham)，再于37℃下培养3.5小时。然后用镊子小心取下硝酸纤维素滤膜，用TBST[20mM Tris-HCl(pH7.5)、150mM NaCl、0.05%(V/V)吐温20]洗涤15分钟，共洗涤3-5次。
为了每个平皿制备两块待筛选影印滤膜，取下第一块滤膜后在平皿上放上另一块浸渍有10mM IPTG的硝酸纤维素滤膜，于37℃下保温4小时。第二块滤膜按与第一块滤膜相同的方式进行洗涤。
对20个平皿进行同样的操作，制得总共带有3.0×105个噬斑的影印滤膜。
将这些滤膜置于封闭液[1%BSA、20mM Tris-HCl(pH7.5)、150mM NaCl]中小心振荡1小时，转移到用封闭液适当稀释的抗proPO兔抗体溶液中，并在室温下小心振荡1小时。将经过了初级反应的影印滤膜用TBST洗涤3-5次，每次洗5分钟，再置于用封闭液适当稀释的碱性磷酸酶标记的抗兔IgG羊抗体溶液中，于室温下小心振荡1小时以进行次级反应。反应后，将混合物用TBST洗涤3-5次，每次洗5分钟，再用TBS[20mM Tris-HCl(pH7.5)、150mM NaCl、1%BSA]洗涤5分钟。用滤纸吸去影印滤膜上的水滴，并将影印滤膜置于显色液
中显色。
从平皿上挑下相应于硝酸纤维素滤膜上蓝色位置的噬斑，进行次级筛选和三级筛选，从而进行纯化，最终得到8个克隆。
(3)亚克隆利用辅助噬菌体的作用从λZAPⅡ中自动切下克隆到其中的DNA片段，并重新环化。因此进行下列操作以亚克隆到pBluescript SK(-)噬粒载体中。
将λZAPⅡ重组噬菌体(100μl，＞1×105PFU)、大肠杆菌XL-1 Blue(200μl，OD600约为1.0)和ExAssist辅助噬菌体(1μl，＞1×106PFU)混合，并于37℃下保温15分钟。向其中加入3ml2×YT培养基(1%NaCl、1%酵母提取物、1.6%细菌胰胨)，将该混合物振荡培养2.5小时，然后于70℃下保温20分钟。将该混合物离心(4000×g，15分钟，室温)得到上清液。从上清液中取一份试样(1μl)与200μl大肠杆菌SOLRTM(OD600约为1.0)混合，将该混合物于37℃下保温15分钟，并铺在LB/Amp平板上(1.5%琼脂、1%NaCl、1.6%细菌胰胨、0.5%酵母提取物、50μg/ml氨苄青霉素)。选出单个克隆(pPO2、pPO3、pPO4、pPO5、pPO6、pPO8、pPO17、pPO20)。
(4)proPO克隆碱基顺序的鉴定对亚克隆后的克隆画出限制酶切割图谱。鉴于pPO2、pPO3、pPO4、pPO8、pPO17和pPO20有相似的限制酶位点，认为它们克隆的是同一蛋白，选择pPO17作为代表。此外，认为pPO5和pPO6克隆了不同的蛋白，而pPO6是pPO2等的部分克隆。因此选择pPO5作为另一个候选物。
为了找出proPO上可能的PPAE切割位点，鉴定了pPO5和pPO17的推定含有切割位点的cDNA插入片段5′端的碱基顺序。利用Taq DyeDeoxyTM终止循环测序试剂盒(Applied Biosystems Corp.)和Ampli TaqRDNA聚合酶，以重组质粒DNA作模板鉴定碱基顺序，然后用ABI 373A DNA测序仪进行分析。对照参考例1的氨基酸顺序检查所获得的顺序(顺序表中的5号和6号顺序)。决定将参考例1中得到的肽进行组合，鉴定出proPO上被PPAE识别和切割的区域的氨基酸顺序。所述氨基酸顺序及其相应密码子如下面顺序表中的5号和6号顺序所示。
由这些顺序明显可见，pPO5和pPO17这两个克隆具有不同的顺序，表明被PPAE识别和切割的proPO蛋白有两种。
实施例1PPAE活性的测定(1)肽的合成利用Fmoc-Gly-Alko树脂(由Watanabe Kagaku Kogyo制造)，用肽合成仪(PSSM-8型，Shimadzu公司制造)合成具有下列顺序的肽2-Pyr-Ala-Leu-Asn-Arg-Phe-Gly-OH
其中2-Pyr为2-吡啶基。
用以下方法进行肽合成用30%哌啶的DMF溶液处理Fmoc-Gly-Alko树脂的Fmoc基团(9-芴基甲氧羰基)，从而释放出末端氨基，再在BOP试剂存在下依次缩合Fmoc-Phe、Fmoc-Arg、Fmoc-Asn、Fmoc-Asn、Fmoc-Leu和供引入2-吡啶氨基的2-Pyr-Ala。
用甲醇洗涤结合有所得肽链的树脂，然后干燥。然后将树脂浸入三氟乙酸(950μl)和苯硫基甲烷(50μl)的溶液中1小时，从而释放出肽。将肽用三氟乙酸洗涤，回收滤液。在滤液中加入无水乙醚，将所得白色沉淀物离心(2000rpm，6分钟，4℃)并减压干燥。为进行进一步纯化，将白色沉淀溶解于30%乙酸中，并加到5C18反相色谱柱上(日本和光纯药工业株式会社制造)，将得到的主要部分冷冻干燥。临用前，将该部分溶解于0.01M磷酸钾缓冲液(pH7.0)中作为合成肽溶液使用。
(2)PPAE的纯化制取约500只五龄养殖家蚕幼虫的表皮(约100g)，用冷蒸馏水洗涤，然后匀浆。对所得匀浆液按图1的反应方案进行硫酸铵分级分离。
通过观察由于PPAE对proPO底物的作用而产生的PO活性，检查每个硫酸铵部分中的可能PPAE活性。为了证实该PO活性来源于所加的proPO，还检查了不含proPO的同一部分的PO活性。测定这些PO活性的方法是用DOPA作底物，测定由于所产生的多巴色素显色所致的490nm处的光吸收。
结果，在上清液1、沉淀物2、上清液3和沉淀物4(见图1)中测得PPAE活性(产生PO活性)，而在上清液1和沉淀物2中测得很大程度的原有PO活性，在上清液3中测得某种程度的原有PO活性。因此认为，沉淀物4是PPAE部分。将该部分用0.01M Tris-HCl缓冲液(pH8.5)透析，并作为PPAE溶液使用。
(3)用液相色谱法测定PPAE活性将合成肽以适当浓度溶于0.01M磷酸钾缓冲液(pH7.0)中的溶液(50μl)，与浓度为0.36mg/ml的PPAE溶于0.01MTris-HCl缓冲液(pH8.5)中的溶液(50μl)混合，将该混合物于30℃下加热10分钟。从中取一份试样(10μl)进行液相色谱分析[柱Wakosil-5C18(4.6内径×250mm，日本和光纯药工业株式会社制造);柱温40℃;流动相A缓冲液(50mM AcONH4(pH6.0)-10%乙腈);B缓冲液(50mM AcONH4(pH6.0)-50%乙腈);梯度B缓冲液0→50%(0→15分钟);流速1.5ml/分;检测Ex305nm，Em376nm](图2-A)。作为对照，取上述合成肽溶液(50μl)和0.01M Tris-HCl缓冲液(50μl，pH8.5)的混合物(图2-B)，以及0.01M磷酸钾缓冲液(50μl，pH7.0)和上述PPAE溶液(50μl)的混合物(图2-C)，以同样方式进行处理并进行液相色谱。结果证实了切割后的合成肽部分。也就是说，在图2-A的液相色谱分析中，在7.225分的保留时间处出现了一个代表切割后的合成肽部分的峰，并可测出PPAE活性。
(4)PPAE浓度与活性的相关将合成肽以适当浓度溶于0.01M磷酸钾缓冲液(pH7.0)中溶液(50μl)，与浓度为0、0.18、0.36或0.72mg/ml的PPAE溶于0.01M Tris-HCl缓冲液(pH8.5)中的溶液(50μl)混合，将该混合物于30℃下加热5分钟。从中取一份试样(10μl)进行液相色谱分析。取切割后的合成肽部分的峰面积作为PPAE活性值，考察该活性与PPAE浓度之间的相关性。结果证实了明显的相关性(图3)，这样便能够利用该肽来定量测定PPAE活性。
参考例3SLP溶液的制备将养殖家蚕幼虫(五龄)置于冰上10分钟使其停止运动，在第五和第六个腹节之间注射20mM从甘蔗中纯化出的蔗糖的溶液，注射量为幼虫体重的一半。用缝合线在幼虫的第五个腹节前结扎，使注射液保持在幼虫体内，在室温下放置20分钟。然后切下第三腹节处的附肢，从中回收血淋巴。
将回收的血淋巴在低温下以1500G离心5分钟以除去血细胞。所得上清液(约100ml)用含有0.1mM MOPS[3-(N-吗啉代)丙磺酸]、0.1M KCl和1%木糖醇的溶液(3升)在低温下透析2天，得到SLP溶液。
实施例2β-1，-3葡聚糖的测定(1)利用养殖家蚕幼虫的血淋巴(SLP)测定β-1，3-葡聚糖使用羧甲基凝乳聚糖(CM-凝乳聚糖)作为典型的β-1，3-葡聚糖。将实施例1(1)中得到的合成肽以适当浓度溶于0.01M磷酸钾缓冲液(pH7.0)中的溶液(10μl)、SLP溶于0.1M MOPS[3-(N-吗啉代)丙磺酸]、0.1M KCl和1%木糖醇中的溶液(5μl)、10mM苯硫脲(10μl)、80mM CaCl2(15μl)、1mg/ml CM-凝乳聚糖(5μl)、0.01M Tris-HCl缓冲液(100μl，pH8.5)和蒸馏水(55μl)混合在一起，将该混合物于25℃下加热25分钟。从中取一份试样(10μl)进行液相色谱分析[柱Wakosil-5C18(4.6×250mm)，日本和光纯药工业株式会社制造);柱温40℃;流动相A缓冲液(50mM AcONH4(pH6.0)-10%乙腈);B缓冲液(50mM AcONH4(pH6.0)-50%乙腈);梯度B缓冲液0→50%(0→15分钟);流速1.5ml/分;检测Ex 305nm，Em376nm](图4-A)。作为对照，取具有上述组成但额外加入5μl蒸馏水代替1mg/ml CM-凝乳聚糖的混合物(图4-B)，以相同方式进行处理并进行液相色谱。结果在6.279分的保留时间处出现一个代表切割后的合成肽部分的峰，并检测到β-1，3-葡聚糖。所用的SLP溶液是用参考例3所述的方法制备的。
(2)β-1，3-葡聚糖浓度和活性的相关使用CM-凝乳聚糖作为典型的β-1，3-葡聚糖。
在合成肽以适当浓度溶于0.01M磷酸钾缓冲液(pH7.0)中的溶液(10μl)、SLP溶于0.1M MOPS、0.1M KCl和1%木糖醇中的溶液(5μl)、10mM苯硫脲(10μl)、80mM CaCl2(15μl)、0.01M Tris-HCl缓冲液(100μl，pH8.5)和蒸馏水(55μl)的混合物中，以0、0.1、0.25、0.5或1.0mg/ml的浓度加入CM-凝乳聚糖(5μl)，将该混合物于25℃下加热25分钟。从中取一份试样(10μl)进行液相色谱分析。取切割后的合成肽部分的峰面积作为PPAE活性值，并考察该活性与CM-凝乳聚糖浓度之间的相关性。结果证实了明显的相关性(图5)，这样便能够利用所述肽定量测定β-1，3-葡聚糖。
实施例3利用养殖家蚕幼虫的体液(SLP)测定肽聚糖在下列测试中，使用通过超声破碎Micrococcus lysodeikticus(IFO3333)而制得的肽聚糖作为典型的肽聚糖。
将SLP溶于0.1M MOPS、0.1M KCl和1%木糖醇中的溶液(80μl)、80mM CaCl2(7.5μl)、0.3mg/ml肽聚糖溶液(10μl)和蒸馏水(2.5μl)混合，将该混合物于30℃下加热10分钟。向其中依次加入并混合0.5M EDTA(5μl)、1M Tris-HCl缓冲液(5μl，pH8.5)和实施例1(1)中制备的合成肽溶液(10μl)，并调至适当的浓度。将该混合物于30℃下加热30分钟。反应后，从混合物中取50μl进行液相色谱分析(分析条件与实施例2中分析β-1，3-葡聚糖的条件相同)(图6-A)。作为对照，取具有上述组成但额外加入10μl蒸馏水代替0.3mg/ml肽聚糖溶液的混合物(图6-B)，以相同的方式进行处理并进行液相色谱。结果，只在加入肽聚糖时才在4.36分的保留时间处出现一个代表切割后的合成肽部分的峰(图6-A)，这样便能够利用合成肽来测定肽聚糖。所用的SLP溶液是用参考例3所述的方法制备的。
参考例4PPAE的底物特异性合成出四种肽链并将其溶于蒸馏水中使其浓度达到0.5mg/ml。这四种肽链为Ala-Leu-Asn-＊-Arg-Phe-Gly，其中＊为Asn、Asp、Ser或Gly，并在N末端引入了2-吡啶基。向所得溶液(各125μl)中加入10μg/ml PPAE(25μl)、1M Tris-HCl缓冲液(25μl，pH8.5)、5M NaCl(25μl)和蒸馏水(50μl)，使该混合物在25℃下反应0、15或30分钟。在每个反应中取出80μl反应混合物，向其中加入50%乙酸(20μl)终止反应。向其中加入蒸馏水(100μl)并混合。从中取一份试样(100μl)进行液相色谱分析。计算该分析测得的代表合成肽Ala-Leu-Asn-＊-Arg-Phe-Gly的峰面积每15分钟减少的百分率，并以该百分率作为底物减少百分率。比较四种肽的所得减少百分率。结果示于表1。
表1底物Ala-Leu-Asn-＊-Arg-Phe-Gly*代表的氨基酸 底物减少(%)(15分钟反应) 表观反应速度(纳摩尔/μg PPAE/分)Asn 27.7 2.05Asp 26.6 1.96Ser 10.3 0.77Gly 2.3 0.18由表1明显可见，当＊代表的氨基酸为Gly时，底物减少百分率较小，PPAE反应速度降低。
结果是，当＊代表的氨基酸为Gly时，该肽不适于作为PPAE活性测定的底物使用。
顺序表顺序号1顺序长度22顺序类型氨基酸拓扑结构线性顺序种类肽顺序 顺序号2顺序长度11顺序类型氨基酸拓扑结构线性顺序种类肽顺序Tyr Gln Arg Val Ser Asn Ala Ile Gly Asn Arg1 5 10顺序号3顺序长度22顺序类型氨基酸拓扑结构线性顺序种类肽顺序
顺序号4顺序长度10顺序类型氨基酸拓扑结构线性顺序种类肽顺序Phe Gly Ser Asp Ala Gly Arg Met Ile Pro1 5 10顺序号5顺序长度132顺序类型核酸拓扑结构线性顺序种类cDNA来源生物体家蚕顺序特征显示特征的符号CDS位置未知测定特征的方法E显示特征的符号peptide位置未知测定特征的方法E顺序
顺序号6顺序长度63顺序类型核酸链数双链拓扑结构线性顺序种类cDNA来源生物体家蚕顺序特征显示特征的符号CDS位置未知测定特征的方法E显示特征的符号peptide位置未知测定特征的方法E顺序
权利要求
1.一种测定酚氧化酶原活化酶活性的方法，该方法包括(1)使酚氧化酶原活化酶与式(Ⅰ)所示的肽链反应其中X为带有任选保护的α-氨基的任选标记的氨基酸残基，或者带有任选保护的N末端的任选标记的肽残基，条件是邻接Arg的氨基酸残基不是Gly或Ala；Y为能够通过酰胺键或酯键与Arg的羧基结合的有机残基，或者带有任选保护的α-羧基的任选标记的氨基酸残基，或者带有任选保护的C末端的任选标记的肽残基；该肽链能够被得自昆虫的酚氧化酶原活化酶水解X-Arg和Y；(2)测定由式(Ⅰ)所示的肽链和酚氧化酶原活化酶之间的反应产生的X-Arg和Y中至少一种的量；(3)根据(2)中测得的量确定酚氧化酶原活化酶的活性。
2.根据权利要求1的方法，其中X为下式所示的基团X′-Asn其中X′为带有任选保护的α-氨基的任选标记的氨基酸残基，或者带有任选保护的N末端的任选标记的肽残基，条件是X′的氨基酸数目为X的氨基酸数目减1，或者X′为Asn的α-氨基的保护基。
3.根据权利要求1或2的方法，其中Y为下式所示的基团Phe-Gly-Z其中Z为带有任选保护的α-羧基的任选标记的氨基酸残基，或带有任选保护的C末端的任选标记的肽残基，条件是Z的氨基酸数目为Y的氨基酸数目减2，或者Z为Gly的羧基的保护基。
4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中根据X-Arg或Y的性质，用以紫外或可见光吸收、发光、荧光、放射性或磁性为基础的方法，测定X-Arg和Y中至少一种的量。
5.一种测定β-1，3-葡聚糖、肽聚糖或其混合物的方法，该方法包括(1)使酚氧化酶原活化系统与β-1，3-葡聚糖、肽聚糖或其混合物及式(Ⅰ)所示的肽链接触其中X为带有任选保护的α-氨基的任选标记的氨基酸残基，或者带有任选保护的N末端的任选标记的肽残基，条件是邻接Arg的氨基酸残基不是Gly或Ala;Y为能够通过酰胺键或酯键与Arg的羧基结合的有机残基，或者带有任选保护的α-羧基的任选标记的氨基酸残基，或者带有任选保护的C末端的任选标记的肽残基;该肽链能够被得自昆虫的酚氧化酶原活化酶水解成X-Arg和Y;(2)测定由式(Ⅰ)所示的肽链与酚氧化酶原活化系统和β-1，3-葡聚糖、肽聚糖或其混合物接触而产生的X-Arg和Y中至少一种的量;(3)根据(2)中测得的量确定酚氧化酶原活化酶的活性;(4)用(3)中确定的酚氧化酶原活化酶活性作为指标，确定β-1，3-葡聚糖、肽聚糖或其混合物的量。
6.根据权利要求5的方法，其中X为下式所示的基团X′-Asn其中X′为带有任选保护的α-氨基的任选标记的氨基酸残基，或者带有任选保护的N末端的任选标记的肽残基，条件是X′的氨基酸数目为X的氨基酸数目减1，或者X′为Asn的α-氨基的保护基。
7.根据权利要求5或6的方法，其中Y为下式所示的基团Phe-Gly-Z其中Z为带有任选保护的α-羧基的任选标记的氨基酸残基，或带有任选保护的C末端的任选标记的肽残基，条件是Z的氨基酸数目为Y的氨基酸数目减2，或者Z为Gly的羧基的保护基。
8.根据权利要求5-7中任一项的方法，其中根据X-Arg或Y的性质，用以紫外或可见光吸收、发光、荧光、放射性或磁性为基础的方法，测定X-Arg和Y中至少一种的量。
9.根据权利要求6-8中任一项的方法，其中酚氧化酶原活化系统不含与肽聚糖特异反应的组分。
10.根据权利要求6-8中任一项的方法，其中酚氧化酶原活化系统不含与β-1，3-葡聚糖特异反应的组分。
全文摘要
一种测定酚氧化酶原活化酶(PPAE)活性的方法，该方法包括至少测定PPAE与式X-Arg-Y的肽链接触而产生的A-Arg或Y，其中X和Y如说明书中所限定。根据本发明，可以精确地定量测定PPAE活性，并可提供一种高度精确的测定β-1，3-葡聚糖和/或肽聚糖的方法，其中用所述PPAE活性作指标。此外，本发明可以不经培养增殖而对真菌和细菌进行检测，这样便有可能对微生物感染进行早期诊断。本发明可应用于广泛的用途，例如水和食品的微生物感染检验、治疗剂如抗生素和注射制剂的安全检验等。
文档编号C12Q1/37GK1108696SQ9411604
公开日1995年9月20日 申请日期1994年11月18日 优先权日1993年11月18日
发明者芦田正明, 川端智久, 平安一成, 土谷正和 申请人:和光纯药工业株式会社