专利名称：蔗糖测定试剂盒及蔗糖浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种蔗糖测定试剂盒，同时本发明还涉及测定蔗糖浓度的 方法，属于食品检验测定技术领域。
技术背景当前，蜂蜜掺假的现象严重，据调查，在基层收购的蜂蜜中，出现的掺假的样品中，蔗糖的含量多在10-28%之间，有的甚至高达50%以上。另外， 在中、低档茶叶加工时掺糖，以增加重量谋取不法利益的现象也比较普遍。 无糖食品查出含有蔗糖的问题，也时有所闻，对糖尿病患者造成危害。申请专利号200510099310.4的一种甘蔗汁中蔗糖含量的检测方法，公 开一种蔗糖的测定方法，其方法包括蔗糖的水解，还原糖与铁氰化钾的反 应，亚铁氰化钾的电位滴定等步骤。由于用常规的滴定法测定蔗糖含量过程繁琐，准确性差，也有利用高效 液相色谱仪对样品进行检测。中华人民共和国国家标准GB 5009.8-85公布了食品中蔗糖的测定方 法，其原理为样品经除去蛋白质后，其中蔗糖经盐酸水解转化为还原糖， 再按还原糖测定。水解前后还原糖的差值为蔗糖含量。本国家标准由全国 卫生标准技术委员会食品卫生标准分委员会提出，由卫生部食品卫生监督 检验所归口。本国家标准由卫生部食品卫生监督检验所负责起草。发明内容本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic ColorimetricMethod)及酶(偶)联法(CoupleReaction)技术，监测还原 型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定蔗 糖浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的蔗糖测定试剂盒， 采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行 蔗糖浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应 用。本发明蔗糖浓度测定方法原理如下蔗糖蔗糖酶D-葡萄糖+ D-果糖D-果糖+还原型辅酶甘露醇脱氢酶甘露醇+辅酶这种方法应用蔗糖酶(sucrase; EC 3.2丄48)偶联甘露醇脱氢酶(Mannito1 dehydrogenase; EC 1丄1.138; EC LU.67)酶促反应连续监测法/终点比色 法。蔗糖酶酶解蔗糖反应产生果糖，再通过偶联甘露醇脱氢酶的作用，最 终将还原型辅酶(在340nrn处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有 吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的程度/速度， 通过测量340nm处吸光度下降的程度/速度，可以测算蔗糖的浓度大小。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑， 无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明蔗糖测定试剂盒较为 理想缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L还原型辅酶 0.25 mmol/L蔗糖酶 10000 U/L甘露醇脱氢酶 12000 U/L本发明的蔗糖测定试剂盒可以是单剂，包括缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、蔗糖酶、甘露醇脱氢酶。 试剂盒可以是千粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体 试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂-试剂1缓冲液、稳定剂、还原型辅酶。 试剂2缓冲液、稳定剂、蔗糖酶、甘露醇脱氢酶。 还原型辅酶、蔗糖酶、甘露醇脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不 限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 体试剂，直接使用。还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、还原型辅酶。 试剂2缓冲液、稳定剂、甘露醇脱氢酶。 试剂3缓冲液、稳定剂、蔗糖酶。 还原型辅酶、蔗糖酶、甘露醇脱氢酶在试剂l、试剂2或试剂3中的位500 mmol/L 0.25 mmol/L置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以 配制成液体试剂，直接使用。无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定蔗糖浓度的方法，其还原型辅 酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一种。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。本实施例的蔗糖测定试剂为单试剂，包括三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 还原型辅酶蔗糖酶 10000 U/L甘露醇脱氢酶 12000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉^;剂；使用 前，加入纯净水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定温度37"C，反应时间10分钟，起始吸光 度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测蔗糖样品与试 剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约0 分钟左右，检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析 仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出蔗糖的浓度 大小。实施例二本实施例的蔗糖测定试剂为双试剂，包括 试剂1三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液稳定剂还原型辅酶100mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L试剂2三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100 mmol/L稳定剂甘露醇脱氢酶500 mmol/L10000U/L12000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测蔗糖样品与试剂l、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出蔗糖的浓度大小。实施例三 ， 本实施例的蔗糖测定试剂为三试剂，包括 试剂1三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50 mmol/L还原型辅酶0.25 mmol/L试剂2三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓; 稳定剂甘露醇脱氢酶100 mmol/L 500 mmol/L 12000 U/L试剂3三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100 mmol/L 稳定剂 500 mmol/L蔗$10000U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定蔗糖浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37°C，反应时间 10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nrn， 被测蔗糖样品与试剂l、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向 为负反应(下降反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。 加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析 仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出蔗糖的浓度 大小。申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色 原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同， 不另一一例举。总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪 器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应用。
权利要求
1.一种利用酶比色法及酶联法技术的蔗糖浓度测定方法，其方法原理如下蔗糖 蔗糖酶 D-葡萄糖+D-果糖D-果糖+还原型辅酶 甘露醇脱氢酶 甘露醇+辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，测算出蔗糖的浓度大小测定结果。
2. —种蔗糖测定试剂盒，主要成分包括缓冲液 20——50Ommol/L稳定剂 1——4000 mmol/L还原型辅酶 0.1——0.35 mmol/L蔗糖酶 1000——80000 U/L甘露醇脱氢酶 1000——80000 U/L其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述蔗糖测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、蔗糖酶、甘露醇脱氢酶组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述蔗糖测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、蔗糖酶、甘露醇脱氢酶组成双剂试剂; 试剂l，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶组成；试剂2，由缓冲液、稳 定剂、蔗糖酶、甘露醇脱氢酶组成。还原型辅酶、蔗糖酶、甘露醇脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述蔗糖测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、蔗糖酶、甘露醇脱氢酶组成多剂试剂; 试剂l，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶组成；试剂2，由缓冲液、稳 定剂、甘露醇脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、蔗糖酶组成。 还原型辅酶、蔗糖酶、甘露醇脱氢酶在试剂l、试剂2或试剂3中的位 置可以不限。
6. 根据权利要求2所述蔗糖测定试剂盒，其特征在于还包括稳定剂 1~4000 mmol/L或0.1%-100°/。体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol),丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的蔗糖测定试剂盒，同时本发明还涉及测定蔗糖浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于食品检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、还原型辅酶、蔗糖酶、甘露醇脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的程度/速度，从而测算出蔗糖的浓度大小。
文档编号C12Q1/26GK101329267SQ20071002473
公开日2008年12月24日 申请日期2007年6月21日 优先权日2007年6月21日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司