本发明涉及一种石蝉草(Peperomia dindygulensis Miq)组织培养快速繁殖的方法，特别是一种利用野生药用植物石蝉草带芽茎段进行组织培养快速繁殖的方法。属野生药用植物种苗繁殖技术领域。
背景技术：
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石蝉草(Peperomia dindygulensis Miq)系胡椒科草胡椒属植物，为一年生肉质草本，主要分布于我国南方的各省区。石蝉草以全草入药，味辛，性凉，具有清热解毒，化瘀散结、利水消肿的功效，主治肺热咳嗽、麻疹、疮毒、癌肿等症。在民间常作为抗肿癌草药应用。在《云南中草选》中记载用其治疗胃癌、食道癌、肝癌、乳腺癌和肺癌。石蝉草在云南主要分布于南部地区的石山林下，为云南省苗族、彝族、拉祜族等民族民间常用珍稀抗癌药材。石蝉草具有可开发为抗癌药品和抗癌食品的潜力。长期以来，石蝉草药材来源全部依赖于野生植物资源，随着天然药品市场的需求量与日俱增，石蝉草野生资源受到严重破坏，目前野生资源已经很难找到。
石蝉草地域分布狭窄，生长速度较慢，自然繁殖困难，加之近年来掠夺式过度采挖，目前全草干品价格昂贵，极度珍稀、濒临灭绝。急需对其进行资源保护和人工种苗快速繁殖技术研究。
经文献检索，还未见到任何有关石蝉草种苗快速繁殖、种子萌发、野生资源调查、人工种植等公开发表的内容。
技术实现要素：
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本发明的目的在于提供一种利用石蝉草(Peperomia dindygulensis Miq)带芽茎段进行组织培养快速繁殖的方法。本方法通过外植体的选择消毒、增殖培养、生根培养等到技术环节的调控，能有效实现石蝉草组织培养快速繁殖。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种石蝉草(Peperomia dindygulensis Miq)组织培养快速繁殖的方法，其特征在于包含下列步骤：
A.外植体的选择和消毒：
剪取石蝉草生长旺盛的带芽茎段，清洗、消毒后去除叶片，带入无菌操作台；用75％乙醇浸泡8S，快速取出后用无菌水清洗2次，再将茎枝放入2％次氯酸钠溶液中浸泡10-15min，取出后用无菌水清洗3次，用剪刀将取枝条剪切成带节小茎段，接种于诱导增殖培养基上。
B.诱导增殖培养：
诱导增殖培养基成分为MS+6-BA1.0～1.5mg/L+130g/L椰子汁+25g/L蔗糖+8～10g/L琼脂,培养基pH值为5.8～6.0；诱导培养条件为光照强度1500-2000lx，光照10h/d，温度20～22℃；在诱导培养基培养20～25d后，节上会出现大量芽，待芽枝长到2～3cm，切取芽枝在相同培养条件下连续培养，可实现不断增殖。C.生根培养：
切取2～3cm生长健壮的新梢转接到生根培养基上；生根培养基成分为1/2MS+NAA0.6～0.9mg/L+Pt50g/L+Bn100g/L+25g/L蔗糖+8～10g/L琼脂+0.2g/L活性炭,培养基pH值为5.8～6.0；生根培养条件为光照强度2000～3000lx，光照10～12h/d，温度20～22℃；在生根培养基培养40～60d后可成苗。
本发明的优点在于：通过采用外植体选择消毒、诱导增殖培养、生根培养相结合的配套技术，能通过石蝉草组织培养实现种苗快速繁殖。本发明属首次进行石蝉草组织培养成果，本发明技术方法简单，成本较低，便于操作，适宜于实际生产应用。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案更清楚明白，本发明用具体实例对外植体的选择处理、诱导增殖培养和生根培养等技术的研究筛选过程进行了充分的说明，以证明本研究成果的正确性，但并非说明本发明仅限用于这些例子。
不同外植体的选择研究
为了研究石蝉草不同器官培养的效果，选择出最佳的培养材料。本研究分别采用石蝉草的叶片、休眠芽、带节嫩茎段、成熟种子、未成熟种子为外植体。各种外植体采取用75％乙醇浸泡5～10S，快速取出后用无菌水清洗2次，再放入2％次氯酸钠溶液中浸泡8-15min，取出后用无菌水清洗3次，然后接种于MS+6-BA0.8mg/L+Pt150g/L+25g/L蔗糖+8g/L琼脂,培养基pH值为5.8；每处理接种5瓶，叶、芽和带节嫩茎段，每瓶接种3个，成熟种子和未成熟种子每瓶按100粒；接种后的材料在光照强度1500～2000lx，光照10h/d，温度20℃下培养，40d时观察比较各处理的萌发时间、萌发率和新芽生长情况。
通过试验比较发现：石蝉草带节嫩茎芽作为外植体培养效果最好，表现为萌发时间最短，萌发数量最多，40天左右萌发的新芽可达24～32mm；休眠芽虽然能萌发，但表现为萌发速度较慢、萌发率较低、萌发后芽的生长速度较慢；成熟种子也能少量萌发，虽萌发速度和生长速度都较快，但污染率极高，在生产中极难操作；叶片和未成熟种子都未萌发；各处理有显著差异。研究结果表明石蝉草的带节嫩茎枝为最佳接种外植体。
表1石蝉草不同器官培养萌发情况比较
注:同一列上不同的字母,分别表示在P<0.05水平上的差异显著性；表中数据为5个重复的平均数。
石蝉草嫩茎枝诱导增殖培养中不同基本培养基的筛选研究
为了筛选出石蝉草带芽茎段培养中最佳基本培养基种类。本研究以带芽茎段为接种材料，分别以采取了MS、1/2MS、B5三种不同基本培养基，二种的6-BA浓度(2.0mg/L、1.0mg/L)进行培养。在各处理中都添加相同的Pt150g/L+25g/L蔗糖+8g/L琼脂，培养基pH值为5.8；每处理接种5瓶，每瓶接种3个0.3～0.5cm带1个节嫩茎枝；接种后的材料在光照强度1500～2000lx，光照10h/d，温度20℃下培养，30d时观察比较各处理的萌发时间、萌发情况和芽的生长情况。通过比较发现各处理差异著；处理1结果最佳，表现为接种后11～15天就开始萌发，同时萌发后的茎枝节上腋芽开始萌动侧枝，接种30d主枝平均长到时2～3cm，增殖明显；其次为处理2、3和4，虽然能萌发，但与处理1相比，萌发时间延迟，同时萌发芽数量较少，新芽生长速度慢，增殖不明显；处理5和处理6萌发速度慢。研究结果表明MS可作为石蝉草带节嫩茎枝诱导增殖培养的最佳基本培养基。
表2不同基本培养基对石蝉草带芽茎段诱导增殖培养中芽的萌发情况比较
注:同一列上不同的字母,分别表示在P<0.05水平上的差异显著性；表中数据为5个重复的平均数。
石蝉草带芽茎段诱导增殖培养中细胞分裂素种类和浓度的筛选研究
为了筛选出石蝉草带芽茎段诱导增殖培养中最佳细胞分裂素种类和浓度。本研究以带节嫩茎枝为接种材料，以MS为基本培养基，选择3种不同的细胞分裂素种类(6-BA、KT、ZT)，3种不同浓度(1.5mg/L、1.0mg/L、0.5mg/L)进行培养。在各处理中都添加相同的Pt150g/L+25g/L蔗糖+6g/L琼脂，培养基pH值为5.8；每处理接种5瓶，每瓶接种3个0.3～0.5cm带1个节嫩茎枝；接种后的材料在光照强度1500～2000lx，光照10h/d，温度20℃下培养，30d时观察比较各处理的萌发时间、萌发情况和芽的生长情况。
通过比较发现各处理差异著；处理2萌发增殖效果最佳，表现为接种后10～15天就开始萌发，同时萌发后的茎枝节上腋芽开始萌动侧枝，接种单茎萌发数可达4～6个，接种30d主枝平均长到时3～5cm，为侧枝增殖非常明显；其次为处理3，也表现出较好萌发增殖效果，但与处理2相比，虽然萌发速度和芽数量无显著差异，但新芽生长速度减慢；其余处理萌发增殖效果均较差。研究结果表明石蝉草带节嫩茎枝诱导增殖培养基配方中最佳的细胞分裂素种类为6-BA,其较适宜的浓度为1.0-1.5mg/L之间。
表3不同细胞分裂素对石蝉草嫩茎枝诱导增殖培养中芽的萌发情况比较
注:同一列上不同的字母,分别表示在P<0.05水平上的差异显著性；表中数据为5个重复的平均数。
石蝉草带芽茎段诱导增殖培养培养的最佳添加有机物的筛选研究
为了摸清石蝉草带芽茎段诱导增殖培养的最适宜的有机添加物种类。本研究以带芽茎段枝为接种材料，选择5种不同有机添加物(椰子汁、香蕉泥、马铃薯汁、苹果汁、香蕉泥马铃薯汁混合)种类进行培养，每种有机添加物的量为130g/L。在各处理中都添加相同的MS+6-BA1.0mg/L+25g/L蔗糖+8g/L琼脂,培养基pH值为5.8；每处理接种5瓶，每瓶接种3个0.3-0.5cm带1个节嫩茎枝；接种后的材料在光照强度1500～2000lx，光照10h/d，温度20℃下培养，30d时观察比较各处理的萌发时间、萌发情况和芽的生长情况。
通过比较发现，处理1萌发增殖效果最佳，表现为接种后9～13天就开始萌发，接种单茎萌发数可达6～8个，接种30d主枝平均长到时4～5cm，为侧枝增殖非常明显；处理效果较好的为处理3，也表现出较好萌发增殖效果，但与处理1相比，同时萌发芽数量减少，新芽生长速度减慢，二者差异显著，；其次为处理3和处理2，虽然也表现出一定的萌发增殖效果，但萌发芽数量和新芽生长速度都减慢，说明单独应用马铃薯和香蕉，结果都还太理想；所有处理中，处理5效果最差，说明带芽茎段诱导增殖培养中添加苹果，效果不佳。研究结果表明，椰子汁作为石蝉草带芽茎段诱导增殖培养的最适宜添加的有机物，但因椰子汁取材比较困难，综合考虑材料来源、价格、成本等因素，在条件不允许的地区也可以使用香蕉和马铃薯的混和有机添加物。
表4不同有机添加物对石蝉草带芽茎段诱导增殖培养中芽的萌发情况比较
注:同一列上不同的字母,分别表示在P<0.05水平上的差异显著性；表中数据为5个重复的平均数。
化血胆带带芽茎段诱导增殖培养培养条件的研究
为了摸清化血胆带芽茎段枝诱导增殖培养最适宜的培养条件。本研究以带节嫩茎枝为接种材料，设置5种不同的培养温度(18℃、20℃、22℃、24℃、26℃)、2种光照强度(1500～2000lx、2500～3000lx)进行培养。在各处理中都添加相同培养基MS+6-BA1.0mg/L+椰子汁130g/L+25g/L蔗糖+8g/L琼脂，培养基pH值为5.8；每处理接种5瓶，每瓶接种3个0.3-0.5cm带1个节嫩茎枝；接种后都在光照10h/d，30d时观察比较各处理的萌发时间、萌发情况和芽的生长情况。
通过比较发现，处理3、处理4和处理5萌发增殖效果最佳，单茎平均增殖数和芽生长显著高于其它处理，表现为接种后9-11天就开始萌发，接种单茎萌发数可达6-8个，接种30d主枝平均长到时3-5cm，三者之间无显著差异；其次为处理6和2，也表现出较好萌发增殖效果，但与处理3相比，同时萌发芽数量减少，出现丛生芽，且新芽生长速度减慢，少数会出现新稍枯黄；效果最差为处理1、处理9和10处理，虽然也能增殖萌发，但萌发芽数量和新芽生长速度显著低于其它处理。由以上结果说明石蝉草带芽茎段诱导增殖培养，其最佳培养温度为20～22℃，其最适应的光照强度为1500～2000LX，温度过高或过低，光照过强也会显著抑制芽的诱导增殖效果。
表5不同培养条件对石蝉草带芽茎段导增殖培养中芽的萌发情况比较
9注:同一列上不同的字母,分别表示在P<0.05水平上的差异显著性；表中数据为5个重复的平均数。
石蝉草生根培养中生长素种类和浓度的筛选研究
为了筛选出化血胆带芽茎段生根培养中最佳生长素种类和浓度。本研究以带芽茎段为接种材料，设置3种不同的生长素种类(2,4-D、NAA、IAA)，4种不同浓度(0.3mg/L、0.6mg/L、0.9mg/L、1.2mg/L)进行培养。在各处理都添加相同1/2MS+Pt50g/L+Bn100g/L+25g/L蔗糖+0.2g/LCN+8g/L琼脂，培养基pH值为5.8；每处理接种5瓶，每瓶接种3个0.3-0.5cm带1个节嫩茎枝；接种后的材料在光照强度2000～3000lx，光照12h/d，温度20℃下培养，40d时观察比较各处理的发根时间、发根数、根系长度和苗的生长情况。
通过比较发现，处理6和处理7生根培养殖效果最佳，表现为接种后20-25天就开始生根，平增多生根条数4-6条，根长可达1-2cm，植株整体表现为植株健壮，生长速度快，分枝多，叶厚茸毛多，茎杆较粗绿中带红，根系较粗，二者平均生根速度、根的条数和平均根长无显著差异；生根培养较果较好的处理为5、8、9、和10，但其生根培养效果显著低于最佳的处理6和处理7，表现为平均生根时间推迟，根的条数减少，平均根较短，植物整体表现为生长较慢、分枝少、叶薄且色淡、茎细、根系弱；在所有处理中处理1、2、3、4、12生根培养效果最差，说明2,4-D不太适宜作为生根培养的添加生长素类型。研究结果表明石蝉草生根培养基配方中最佳的生长素种类为NAA,其较适宜的浓度为0.6-0.9mg/L。
表6不同生长素对石蝉草带芽茎段生根培养情况比较
注:同一列上不同的字母,分别表示在P<0.05水平上的差异显著性；表中数据为5个重复的平均数。
石蝉草带芽茎段生根培养的最佳培养光照时间的筛选研究
为了摸清石蝉草带节嫩茎枝生根培养的最适宜光照时间。本研究以带节嫩茎枝为接种材料，在设置5种不同光照时间(8、10、12、14、16)种类进行培养，各处理培养基都为1/2MS+NAA0.6mg/L+Pt50g/L+Bn100g/L+25g/L蔗糖+8g/L琼脂+0.2g/L活性炭,培养基pH值为5.8；每处理接种5瓶，每瓶接种3个0.3-0.5cm带1个节嫩茎枝；接种后的材料在光照强度2000-3000lx，温度20℃下培养，40d时观察比较各处理的发根时间、发根数、根系长度和苗的生长情况。
通过比较发现，处理2和处理3生根培养殖效果最佳，表现为接种后20-25天就开始生根，平增多生根条数5-7条，根长可达2-3cm，植株整体表现为生长较快，分枝多，茎杆较粗，叶厚实色浓绿，茸毛多，根系较粗，有大量气生根，苗健壮，其生根培养效果显著好于其它处理，但二者无显著差异；生根培养效果较好的处理为4，但其生根培养效果显著低于最佳的处理2和3，表现为根的条数显著减少，植株生长缓慢，分枝少，苗节间密有矮化趋势；在所有处理中处理1和5生根培养效果最差，表现为生长慢，分枝少，茎细，苗较弱，叶色淡，严重黄化和玻璃化。研究结果表明石蝉草生根培养培养阶段需要中等的光照时间，适宜光照时间为10～12h/d，因考虑成本的问题，建议化血胆生根培养光照时间10h/d较为适宜。
表7不同有机添加物对石蝉草带芽茎段生根培养情况比较
注:同一列上不同的字母,分别表示在P<0.05水平上的差异显著性；表中数据为5个重复的平均数。
本发明利用石蝉草带芽茎段进行组织培养快速繁殖的方法。对于保护野生石蝉草资源，提高繁殖系数，促进石蝉草资源可持续利具有现实意义。