一种植物组织的显微观察方法与流程

本发明涉及生物技术领域,尤其涉及一种植物组织的显微观察方法。

背景技术：

随着功能基因组学、分子生物学研究的不断深入，特定基因在植物体内的表达部位其在特定发育时期的功能得到了广泛关注。荧光显微观察和三维成像技术为植物表型分析、植物与病原菌互作以及基因表达模式分析提供了重要工具。与动物细胞相比，植物细胞壁与细胞质折射率不同，而且细胞中含量丰富的色素和芳香类物质使获取的图像信噪比降低。因此，以往对植物细胞的显微观察仅限于深度大约为30μm左右的几层细胞，极大地影响了植物细胞结构和功能的解析。

为了观察植物体更深层的内部结构或亚细胞结构，往往需要经过特殊处理，使植物样品减少厚度及体积，使光线透过样品才能进行显微观察。处理后的材料要求小而薄、完整、透明、保持原结构，又具有颜色容易辨认。为达到上述要求，需要采取不同的制片方法或者在成像之前对植物材料进行透明，以方便观察组织较厚的植物样品，例如烟草和番茄叶片、沙葱叶片等。

技术实现要素：

本发明一个目的是提供一种植物组织显微镜检测前处理的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤A：

1)将植物组织用固定液固定，得到固定后的植物组织；

2)将所述固定后的植物组织用氢氧化钾消化，得到消化后的植物组织；

3)将消化后的植物组织用PHEM溶液洗涤，得到洗涤后植物组织；

4)将所述洗涤后植物组织在透明液中浸没处理，得到透明后的植物组织，实现植物组织显微镜检测前处理；

所述PHEM溶液包括PIPES(对二氮己环-1,4-二(2-乙磺酸))、HEPES(羟乙基哌嗪乙硫磺酸)、EGTA和MgCl₂；

所述透明液由尿素、丙三醇、Triton X-100和所述PHEM溶液组成；

上述方法中，

所述PIPES、所述HEPES、所述EGTA和所述MgCl₂的摩尔的量比为40-80：15-35：5-15：1-3；

或所述PIPES、所述HEPES、所述EGTA和所述MgCl₂的摩尔的量比为60：25：15：2；

或所述PIPES、所述HEPES、所述EGTA和所述MgCl₂的摩尔的量比为60：25：10：2；

或所述PIPES、所述HEPES、所述EGTA和所述MgCl₂的摩尔的量比为40：15：5：1；

或所述尿素、所述丙三醇、所述Triton X-10的配比为4-8mol：20-40ml：0.05-0.15g；

或所述尿素、所述丙三醇、所述Triton X-10的配比为6mol：20ml：0.1g；

或所述尿素、所述丙三醇、所述Triton X-10的配比为6mol：30ml：0.1g；

或所述尿素、所述丙三醇、所述Triton X-10的配比为4mol：20ml：0.1g。

上述方法中，

所述PHEM溶液由终浓度为40-80mM PIPES、终浓度为15-35mM HEPES、终浓度为5-15mM EGTA、终浓度为1-3mM MgCl₂和水组成；

或所述PHEM溶液由终浓度为60mM PIPES、终浓度为25mM HEPES、终浓度为15mM EGTA、终浓度为2mM MgCl₂和水组成；

或所述PHEM溶液由终浓度为60mM PIPES、终浓度为25mM HEPES、终浓度为10mM EGTA、终浓度为2mM MgCl₂和水组成；

或所述PHEM溶液由终浓度为40mM PIPES、终浓度为15mM HEPES、终浓度为5mM EGTA、终浓度为1mM MgCl₂和水组成；

或所述透明液由终浓度为4-8M尿素、体积百分比20-40％丙三醇、质量百分含量0.05-0.15％Triton X-100和PHEM溶液组成；

或所述透明液由终浓度为6M尿素、体积百分比20％丙三醇、体积百分比0.1％Triton X-100和PHEM溶液组成；

或所述透明液由终浓度为6M尿素、体积百分比30％丙三醇、体积百分比0.1％Triton X-100和PHEM溶液组成；

或所述透明液由终浓度为4M尿素、体积百分比20％丙三醇、体积百分比0.1％Triton X-100和PHEM溶液组成。

上述方法中，

所述PHEM溶液的pH值为6.9；

上述方法中，

所述将固定后的植物组织用氢氧化钾消化的方式为将固定后的植物组织浸在浓度为质量百分比10-15％的氢氧化钾水溶液中；

或所述将消化后的植物组织用PHEM溶液洗涤的方式为将所述消化后的植物组织浸没在所述PHEM溶液中。

上述方法中，

所述固定采用的固定液由戊二醛、多聚甲醛和所述PHEM溶液组成，

所述戊二醛和所述多聚甲醛的配比为4-8ml：4-8g；

或所述固定液由体积百分含量为4-8％戊二醛、质量百分比为4-8％多聚甲醛和所述PHEM溶液组成。

上述方法中，

所述固定的温度为0-4℃，所述固定的时间为10-16小时；

或所述消化的时间为6-8小时；

或所述洗涤的方式为洗涤3-5次，每次5-10分钟；

或所述浸没处理的时间为5-10，所述浸没处理的方式为每隔1天更换一次所述透明液。

上述方法中，

所述植物组织为长度为0.5-1cm²的植物叶片或0.5-1cm长的植物组织。

本发明第二个目的是提供一种植物组织的显微观察方法。

本发明提供的方法，包括上述步骤A。

本发明第三个目的是提供一种植物组织显微镜检测的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括上述的步骤A的所述PHEM溶液和/或所述透明液。

本发明提供的植物组织的显微观察方法，其具有以下优点：1)操作简单、快速：缩短了酶解和透明等前期处理的时间；2)固定处理后再使用氢氧化钾进行消化，避免了酶解或其它操作，节省了成本；3)透明效果好，与荧光染色和标记操作兼容性好：可通过荧光染色在荧光显微镜下清晰地观测到植物深层组织的内部结构。

实验证明，采用本发明提供的方法对植物组织进行显微观察，观察深度显著提高；纤维素酶等的用量减少，达到节省成本的目的；为深入研究植物基因表达模式和深层组织结构提供了重要工具。由此可见，消化处理结合透明技术对植物深层组织进行显微观察的方法为高等植物表型鉴定以及基因表达模式的深入研究奠定了基础，尤其在植物深层组织结构进行观察的研究中发挥重要作用，实际应用价值高。

附图说明

图1为在荧光显微镜下观察到的拟南芥叶片中Remorin1.2蛋白的分布情况。

图2为在普通光学显微镜下观察到的沙葱叶片中叶绿体的分布情况。

图3为在荧光显微镜下观察到的烟草叶片中Remorin蛋白的分布情况。

图4为对比例在荧光显微镜下观察到的烟草叶片情况。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所述百分含量如无特别说明均为质量百分含量。

实施例1、拟南芥叶片的透明处理及显微镜观测

一、叶片的透明处理所需试剂

固定液由戊二醛、多聚甲醛和PHEM溶液组成，其中戊二醛的体积百分比为4％，多聚甲醛的质量百分比为4％。

PHEM溶液由终浓度为40mM PIPES、15mM HEPES、5mM EGTA、1mM MgCl₂和水组成，pH值为6.9；

透明液由终浓度为4M尿素、20％丙三醇(体积百分比)、体积百分比0.1％Triton X-100和PHEM溶液组成。

二、拟南芥叶片的透明处理及显微镜观测

1、拟南芥叶片的透明处理

将拟南芥(哥伦比亚生态型)种子种植于1/2MS培养基上，0-4℃春化两天后，置23±2℃培养箱中萌发，五天后移至培养土中继续培养20-30天，于抽臺前剪取莲座叶叶片。

1)将上述莲座叶叶片切成0.5cm²见方的小块，用去离子水洗涤至去除杂质；

2)将步骤1)获得的0.5cm²见方的小块转移至固定液中浸没，得到固定后拟南芥叶片；固定的温度为4℃，固定的时间为12小时；固定采用摇床转速50rpm，旋转半径为50mm。

3)将固定后拟南芥叶片置于质量百分比10％的氢氧化钾水溶液中浸没，消化，消化时间为4小时，得到消化后的拟南芥叶片；

4)将消化后的拟南芥叶片在上述PHEM溶液浸没5分钟，重复3次，得到洗涤后的拟南芥叶片；

5)将洗涤后的拟南芥叶片在透明液中浸没进行透明处理3天，每隔1天更换一次透明液；得到透明后的拟南芥叶片。

2、显微镜观测

将上述1得到的透明后的拟南芥叶片在激发波长为488nm的荧光显微镜下观察，结果如图1所示，从图1中可以观察到表皮细胞和叶肉细胞，可以看出拟南芥叶片中Remorin蛋白主要分布在细胞质膜，可见细胞内部存在少量小泡状结构。

实施例2、沙葱叶肉细胞中叶绿体的分布

一、叶片的透明处理所需试剂

固定液由戊二醛、多聚甲醛和PHEM溶液组成，其中戊二醛的体积百分比为4％，多聚甲醛的质量百分比为8％。

PHEM溶液由终浓度为60mM PIPES、25mM HEPES、10mM EGTA、2mM MgCl₂和水组成，pH值为6.9；

透明液由终浓度为6M尿素、30％丙三醇(体积百分比)、体积百分比0.1％Triton X-100和PHEM溶液组成。

二、沙葱叶片的透明处理及显微镜观测

将沙葱培养至20-30cm高,取幼苗的地上部分；

1)将上述沙葱叶片切成0.8cm长的小段，用去离子水洗涤至去除叶片上的土和其他杂质；

2)将步骤1)获得的20段沙葱叶片转移至固定液中浸没；固定采用摇床转速50rpm，旋转半径为50mm。

固定的温度为4℃，固定的时间为12小时。

3)将固定后拟南芥叶片置于质量百分比10％的氢氧化钾水溶液中浸没，消化，消化时间为8小时，得到消化后的沙葱叶片；

4)将消化后的沙葱叶片在上述PHEM溶液中浸没5分钟，重复3次，得到洗涤后的沙葱叶片；

5)将洗涤后的沙葱叶片在透明液中浸没进行透明处理5天，每隔1天更换一次透明液，得到透明后的沙葱叶片。

2、显微镜观测

将上述1得到的透明后的沙葱叶片在激发波长为488nm的荧光显微镜下观察，结果如图2所示，从图2中可以观察到表皮细胞和叶肉细胞，沙葱叶肉细胞中叶绿体排列紧密，其间分布有少量气孔。

实施例3、烟草叶肉细胞中REMORIN蛋白的分布

一、叶片的透明处理所需试剂

固定液由戊二醛、多聚甲醛和PHEM溶液组成，其中戊二醛的体积百分比为5％，多聚甲醛的质量百分比为5％。

PHEM溶液由终浓度为60mM PIPES、20mM HEPES、10mM EGTA、2mM MgCl₂和水组成，pH值为6.9；

透明液由终浓度为6M尿素、20％丙三醇(体积百分比)、体积百分比0.1％Triton X-100和PHEM溶液组成。

二、烟草叶片的透明处理及显微镜观测

将烟草种子于20-25℃下催芽，种子萌发后，置25±2℃温室中花卉土种植，培养至株高5-10cm。

1)将携带REMORIN2基因的农杆菌菌种振荡培养至OD值为0.8(检测波长660nm)，6000rpm室温离心3分钟收集菌体，以烟草叶片注射缓冲液重悬菌体；

2)将步骤1)获得的菌液以1mL注射器注射至烟草叶片中，将上述烟草幼苗置25±2℃温室中继续培养36小时；

3)将上述注射后的叶片切成0.5cm²见方的小块，用去离子水洗涤至去除杂质；

4)将步骤1)获得的0.5cm²见方的小块转移至固定液中浸没，得到固定后烟草叶片；

固定的温度为4℃，固定的时间为12小时，固定采用摇床转速50rpm，旋转半径为50mm；

5)将固定后的烟草叶片置于质量百分比10％的氢氧化钾水溶液中浸没，消化；消化时间为6小时，得到消化后的烟草叶片；

6)将消化后的烟草叶片在上述PHEM溶液浸没5分钟，重复3次，每次5分钟，得到洗涤后的烟草叶片；

7)将洗涤后的烟草叶片在透明液中浸没进行透明处理5天，每隔1天更换一次透明液；得到透明后的烟草叶片。

2、显微镜观测

将上述1得到的透明后的烟草叶片在激发波长为488nm的荧光显微镜下观察，结果如图3所示，从图3中可以观察到表皮下深层的叶肉细胞，烟草叶肉细胞中Remorin蛋白主要分布在细胞质膜。

对比例：常规材料透明方法与荧光蛋白标记不兼容，不能用于观察荧光蛋白表达，因而仅能观察样品厚度较薄的材料，厚度较大的样品不能被照明，观察厚度仅为30μm左右的几层细胞。图4为常规方法观察厚度为100μm烟草叶片深层叶肉细胞的结果。

本发明中使用的方法与荧光蛋白标记相兼容，荧光信号可以保持数月，而且可以观察到厚度为100μm左右的深层细胞。