本发明属于植物繁殖技术领域，涉及一种米槠组织培养的快速繁殖方法。
背景技术：
米槠（Castanopsis carlesii （Hemsl.）Hay.），壳斗科锥属，乔木，高可达20米，芽小，叶披针形，叶全缘，或兼有少数浅裂齿，嫩叶叶背有红褐色或棕黄色稍紧贴的细片状蜡鳞层，成长叶呈银灰色或多少带灰白色；雄圆锥花序近顶生，花序轴无毛或近无毛，果序无毛，壳斗近圆球形或阔卵形，坚果近圆球形或阔圆锥形，熟透时无毛，果脐位于坚果底部。3-6月开花，次年9-11月结果成熟。产中国长江以南各地。生于山地或丘陵常绿或落叶阔叶混交林中。喜雨量充沛和温暖气候，能耐荫，喜深厚、温润之中性和酸性土，亦耐干旱和贫瘠。既是优良的用材树种，又是培育食用菌的优良原料，培肥土壤、涵养水源能力都比较强。米槠树形高大、美观，叶椭圆或长圆形。早期生长迅速，适应能力强，抗风力强，又耐烟尘、抗污染并能杀菌。在庭院观赏及营造防火林带中有着广阔的应用前景和发展潜力。组织培养能通过无性繁殖，遗传树种的优良特性，能在短时间内快速繁殖获得大量优质的组培苗，为优质种源推广提供可能。
技术实现要素：
本发明的目的是针对米槠组织培养过程中芽增殖系数低，生长缓慢等问题,提供一种生长效果好、扩繁快的米槠嫩枝组培繁殖方法。
为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一种米槠组织培养的快速繁殖方法，包括外植体选择、外植体处理、初始芽诱导培养、增殖培养、壮芽培养和生根培养工序，采集半木质化、生长健壮的当年生米槠嫩枝作为外植体，对外植体进行修剪、灭菌消毒处理后接种于初始芽诱导培养基中获取初始芽，再将初始芽接种于增殖培养基中经过3-4个周期增殖培养，形成丛生芽，将丛生芽接入壮芽培养基中培养，最后将高≥2cm的单芽插入生根培养基中诱导生根，具体操作步骤如下：
（1）外植体选择：采集半木质化、生长健壮的当年生米槠嫩枝作为外植体；
（2）外植体处理：将外植体置于自来水下冲洗10-15 min，然后去除外植体叶片，再将外植体浸泡在体积浓度 0.3%的氯化汞溶液中，控制浸泡时间15-20 min，最后用纯净水洗净药物，将外植体裁成带至少1个腋芽，1.5-3cm长的茎段，视茎段木质化程度分类置放容器内，备用；
（3）初始芽诱导培养：将步骤（2）得到的外植体接种于初始芽诱导培养基中培养，培养30-35 d，初始芽萌发、生长；
（4）增殖培养：将高≥1cm的初始芽接入增殖培养基中进行增殖培养，35-40 d转接一次，循环往复，经3-4个周期的培养，形成丛生芽；
（5）壮芽培养：将步骤（4）得到的丛生芽进行切割，4-5颗芽/丛，插入壮芽培养基中，培养35-40 d，形成壮芽；
（6）生根培养：将步骤（5）得到的高≥2cm的单芽插入生根培养基中诱导生根；余下小芽丛再次接种于步骤（4）的增殖培养基中继续增殖，然后再重复步骤（5），循环往复，获得大量壮芽。
以上所述的初始芽诱导培养基的配方为：1/2改良MS培养基+6-BA 4.0-6.0 mg/L+IAA 2.0-3.0 mg/L+KT 1.0-2.0 mg/L+ZT 1.5-2.0 mg/L+ VC 15 mg/L+叶酸10mg/L+VB2 15 mg/+琼脂3.0 g/L+卡拉胶25 g/L。
以上所述的增殖培养基的配方为：改良1/2MS培养基+6-BA 6.0-8.0 mg/L+IAA 2.0-3.0 mg/L+ZT 0.5-1.0 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+琼脂 3.6 g/L+卡拉胶 30 g/L。
以上所述的壮芽培养基的配方为：改良MS培养基+6-BA 3.0-4.0 mg/L+IAA 1.0-1.5 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+琼脂 3.5 g/L+卡拉胶 25 g/L。
以上所述的生根培养基的配方为：1/2改良MS培养基+6-BA 1.5-2.5 mg/L+IAA 1.0-1.5 mg/L+琼脂 3.5 g/L+卡拉胶 30 g/L。
以上所述的改良MS培养基的配方为： KNO3 890 mg·L-1；NH4NO3 850 mg·L-1；CaCl2·2H2O 196 mg·L-1；MgSO4·7H2O 370 mg·L-1；Ca(NO3)2·4H2O 720 mg·L-1；KH2PO4280 mg·L-1；MnSO4·H2O 22.3 mg·L-1；ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1；CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1；H3BO3 6.2 mg·L-1；Na2MoO4·2H2O 0.025 mg·L-1；KI 0.83 mg·L-1；CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1；维生素B1 1.0 mg·L-1；维生素B6 0.5 mg·L-1；烟酸 0.5 mg·L-1；甘氨酸 2.0 mg·L-1；肌醇 90 mg·L-1。
以上步骤（3）所述的初始芽诱导培养的培育控制条件为：光培养、光照500-1000 lx，培养温度20±1℃；步骤（4）所述的增殖培养、步骤（5）所述的壮芽培养、步骤（6）所述的生根培养的培育控制条件均为：光培养，光照2500-4000 lx，每日光照16 h，培养温度25-28℃。
相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果如下：
1、本发明以米槠当年生嫩枝作为外植体，经过初始芽培养基培养，初始芽萌动率90%以上；经过3-4个周期增殖培养，形成丛生芽，芽增殖系数5/30d-7/30d，再将丛生芽接入壮芽培养基中培养，最后将高≥2cm的单芽插入生根培养基中诱导生根，从而缩短了米槠的育苗周期，节省育苗材料，克服了传统育苗方法中存在的育苗所需材料多、周期长等问题，大大降低了生产成本，提高了生产效率。
2、本发明将高≥2cm的单芽插入生根培养基中诱导生根，余下小芽丛继续增殖培养，使得材料能够多次继代，实现大量增殖，规模化生产壮芽，实现黄樟油素型樟树的扩繁。
3、本发明对MS基本培养基进行了改良，同时重点调整了与米槠出芽壮芽相关元素，使得培养基更科学，更有针对性，更易促使米槠芽诱导的发生、增殖和壮芽，效果显著。
4、本发明操作过程简便，培养周期短，继代芽产量大,并且质量优，增殖系数达到5以上的组培苗产业化技术要求，具有很好的经济效益、生态效益和社会效益。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1：
（1）外植体选择：采集半木质化、生长健壮的当年生米槠嫩枝作为外植体；
（2）外植体处理：将外植体置于自来水下冲洗10 min，然后去除外植体叶片，再将外植体浸泡在体积浓度 0.3%的氯化汞溶液中，控制浸泡时间15 min，最后用纯净水洗净药物，将外植体裁成带至少1个腋芽，1.5-3cm长的茎段，视茎段木质化程度分类置放容器内，备用；
（3）初始芽诱导培养：将步骤（2）得到的外植体接种于初始芽诱导培养基中培养，置于光培养、光照500 lx，培养温度20±1℃的环境中培养30-35 d，初始芽萌发、生长；所述的初始芽诱导培养基的配方为：1/2改良MS培养基+6-BA 4.0 mg/L+IAA 2.0 mg/L+KT 1.0 mg/L+ZT 1.5 mg/L+ VC 15 mg/L+叶酸10mg/L+VB2 15 mg/+琼脂3.0 g/L+卡拉胶25 g/L；
（4）增殖培养：将高≥1cm的初始芽接入增殖培养基中进行增殖培养，置于光培养，光照2500 lx，每日光照16 h，培养温度25-28℃的环境中，35-40 d转接一次，循环往复，经3-4个周期的培养，形成丛生芽；所述的增殖培养基的配方为：1/2改良MS培养基+6-BA 6.0 mg/L+IAA 2.0 mg/L+ZT 0.5 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+琼脂 3.6 g/L+卡拉胶 30 g/L；
（5）壮芽培养：将步骤（4）得到的丛生芽进行切割，4-5颗芽/丛，插入壮芽培养基中，置于光培养，光照2500 lx，每日光照16 h，培养温度25-28℃的环境中培养35-40 d，形成壮芽；所述的壮芽培养基的配方为：改良MS培养基+6-BA 3.0 mg/L+IAA 1.0 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+琼脂 3.5 g/L+卡拉胶 25 g/L；
（6）生根培养：将步骤（5）得到的高≥2cm的单芽插入生根培养基中，余下小芽丛再次接种于步骤（4）的增殖培养基中继续增殖，然后再重复步骤（5），循环往复，获得大量壮芽；生根培养是置于光培养，光照2500 lx，每日光照16 h，培养温度25-28℃的环境中诱导生根，生根率为89%；所述的生根培养基的配方为：1/2改良MS培养基+6-BA 1.5 mg/L+IAA 1.0 mg/L+琼脂 3.5 g/L+卡拉胶 30 g/L。
以上所述改良MS培养基的配方为：KNO3 890 mg·L-1；NH4NO3 850 mg·L-1；CaCl2·2H2O 196 mg·L-1；MgSO4·7H2O 370 mg·L-1；Ca(NO3)2·4H2O 720 mg·L-1；KH2PO4 280 mg·L-1；MnSO4·H2O 22.3 mg·L-1；ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1；CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1；H3BO3 6.2 mg·L-1；Na2MoO4·2H2O 0.025 mg·L-1；KI 0.83 mg·L-1；CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1；维生素B1 1.0 mg·L-1；维生素B6 0.5 mg·L-1；烟酸 0.5 mg·L-1；甘氨酸 2.0 mg·L-1；肌醇 90 mg·L-1。
实施例2：
（1）外植体选择：采集半木质化、生长健壮的当年生米槠嫩枝作为外植体；
（2）外植体处理：将外植体置于自来水下冲洗15 min，然后去除外植体叶片，再将外植体浸泡在体积浓度 0.3%的氯化汞溶液中，控制浸泡时间20 min，最后用纯净水洗净药物，将外植体裁成带至少1个腋芽，1.5-3cm长的茎段，视茎段木质化程度分类置放容器内，备用；
（3）初始芽诱导培养：将步骤（2）得到的外植体接种于初始芽诱导培养基中培养，置于光培养、光照1000 lx，培养温度20±1℃的环境中培养30-35 d，初始芽萌发、生长；所述的初始芽诱导培养基的配方为：1/2改良MS培养基+6-BA 5.0 mg/L+IAA 3.0 mg/L+KT 1.5 mg/L+ZT 1.5 mg/L+ VC 15 mg/L+叶酸10mg/L+VB2 15 mg/+琼脂3.0 g/L+卡拉胶25 g/L；
（4）增殖培养：将高≥1cm的初始芽接入增殖培养基中进行增殖培养，置于光培养，光照3000 lx，每日光照16 h，培养温度25-28℃的环境中，35-40 d转接一次，循环往复，经3-4个周期的培养，形成丛生芽；所述的增殖培养基的配方为：1/2改良MS培养基+6-BA 7.0 mg/L+IAA 2.5 mg/L+ZT 1.0 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+琼脂 3.6 g/L+卡拉胶 30 g/L；
（5）壮芽培养：将步骤（4）得到的丛生芽进行切割，4-5颗芽/丛，插入壮芽培养基中，置于光培养，光照3000 lx，每日光照16 h，培养温度25-28℃的环境中培养35-40 d，形成壮芽；所述的壮芽培养基的配方为：改良MS培养基+6-BA 3.5 mg/L+IAA 1.0 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+琼脂 3.5 g/L+卡拉胶 25 g/L；
（6）生根培养：将步骤（5）得到的高≥2cm的单芽插入生根培养基中，余下小芽丛再次接种于步骤（4）的增殖培养基中继续增殖，然后再重复步骤（5），循环往复，获得大量壮芽；生根培养是置于光培养，光照3000 lx，每日光照16 h，培养温度25-28℃的环境中诱导生根，生根率为92%；所述的生根培养基的配方为：1/2改良MS培养基+6-BA 2.0 mg/L+IAA 1.5 mg/L+琼脂 3.5 g/L+卡拉胶 30 g/L。
以上所述改良MS培养基的配方为：KNO3 890 mg·L-1；NH4NO3 850 mg·L-1；CaCl2·2H2O 196 mg·L-1；MgSO4·7H2O 370 mg·L-1；Ca(NO3)2·4H2O 720 mg·L-1；KH2PO4 280 mg·L-1；MnSO4·H2O 22.3 mg·L-1；ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1；CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1；H3BO3 6.2 mg·L-1；Na2MoO4·2H2O 0.025 mg·L-1；KI 0.83 mg·L-1；CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1；维生素B1 1.0 mg·L-1；维生素B6 0.5 mg·L-1；烟酸 0.5 mg·L-1；甘氨酸 2.0 mg·L-1；肌醇 90 mg·L-1。
实施例3：
（1）外植体选择：采集半木质化、生长健壮的当年生米槠嫩枝作为外植体；
（2）外植体处理：将外植体置于自来水下冲洗15 min，然后去除外植体叶片，再将外植体浸泡在体积浓度 0.3%的氯化汞溶液中，控制浸泡时间20 min，最后用纯净水洗净药物，将外植体裁成带至少1个腋芽，1.5-3cm长的茎段，视茎段木质化程度分类置放容器内，备用；
（3）初始芽诱导培养：将步骤（2）得到的外植体接种于初始芽诱导培养基中培养，置于光培养、光照1000 lx，培养温度20±1℃的环境中培养30-35 d，初始芽萌发、生长；所述的初始芽诱导培养基的配方为：1/2改良MS培养基+6-BA 6.0 mg/L+IAA 2.5 mg/L+KT 2.0 mg/L+ZT 2.0 mg/L+ VC 15 mg/L+叶酸10mg/L+VB2 15 mg/+琼脂3.0 g/L+卡拉胶25 g/L；
（4）增殖培养：将高≥1cm的初始芽接入增殖培养基中进行增殖培养，置于光培养，光照4000 lx，每日光照16 h，培养温度25-28℃的环境中，35-40 d转接一次，循环往复，经3-4个周期的培养，形成丛生芽；所述的增殖培养基的配方为：1/2改良MS培养基+6-BA 8.0 mg/L+IAA 3.0 mg/L+ZT 1.0 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+琼脂 3.6 g/L+卡拉胶 30 g/L；
（5）壮芽培养：将步骤（4）得到的丛生芽进行切割，4-5颗芽/丛，插入壮芽培养基中，置于光培养，光照4000 lx，每日光照16 h，培养温度25-28℃的环境中培养35-40 d，形成壮芽；所述的壮芽培养基的配方为：改良MS培养基+6-BA 4.0 mg/L+IAA 1.5 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+琼脂 3.5 g/L+卡拉胶 25 g/L；
（6）生根培养：将步骤（5）得到的高≥2cm的单芽插入生根培养基中，余下小芽丛再次接种于步骤（4）的增殖培养基中继续增殖，然后再重复步骤（5），循环往复，获得大量壮芽；生根培养是置于光培养，光照4000 lx，每日光照16 h，培养温度25-28℃的环境中诱导生根，生根率为93%；；所述的生根培养基的配方为：1/2改良MS培养基+6-BA 2.5 mg/L+IAA 1.5 mg/L+琼脂 3.5 g/L+卡拉胶 30 g/L。
以上所述改良MS培养基的配方为：KNO3 890 mg·L-1；NH4NO3 850 mg·L-1；CaCl2·2H2O 196 mg·L-1；MgSO4·7H2O 370 mg·L-1；Ca(NO3)2·4H2O 720 mg·L-1；KH2PO4 280 mg·L-1；MnSO4·H2O 22.3 mg·L-1；ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1；CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1；H3BO3 6.2 mg·L-1；Na2MoO4·2H2O 0.025 mg·L-1；KI 0.83 mg·L-1；CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1；维生素B1 1.0 mg·L-1；维生素B6 0.5 mg·L-1；烟酸 0.5 mg·L-1；甘氨酸 2.0 mg·L-1；肌醇 90 mg·L-1。