本发明属于中药材组培技术领域，涉及一种白芨体细胞胚诱导及成苗方法。
背景技术：
白芨又名白根、地螺丝、白鸡娃、羊角七、紫兰、刀口药、连及草等，为兰科白芨属植物白芨的干燥块茎。白芨性温、味苦、甘、辛，药用价值较高，具有补肺、止血、散风除湿、通窍止痛、消肿排脓、生肌、敛疮的功能，主要用于治疗感冒头痛、眉棱骨痛、 鼻塞、鼻渊、牙痛、白带、肺伤咳血、衄血、金疮出血、痈疽肿毒、溃疡疼痛、汤火灼伤、手足皱裂等， 是我国民间的传统中药。白芨除了具有重要的药用价值外，还应用于保健食品、纺织印染、特种涂料、日用化工等各行业领域，需求量日趋增多，现已被列入《濒危动植物种国际贸易公约》予以保护。
白芨的繁殖有有性繁殖和无性繁殖两种，在有性繁殖中，由于白芨种子培育过程烦琐，生长速度慢，出苗率低，在自然状态下极少能萌发成苗。白芨的无性繁殖主要利用地下假鳞茎和地上茎进行繁殖，但是长期的无性假鳞茎和地上茎繁殖，假鳞茎和地上茎中容易滋生真菌和积累病毒，在进行组培苗时，组培苗容易被污染，导致繁殖速度减慢，成苗率低，品种种性退化的问题。
白芨除了利用假鳞茎和地上茎进行无性繁殖外，还可以利用茎尖生长点和无菌实生苗进行无性繁殖，该繁殖方法取材料较难，且该方法从脱分化、原球茎增殖、分化、炼苗至大田移栽周期至少需要24个月，培养周期过长，且培养期间需要更换8-10次培养基，工作量大，成本高，一般的药材种植企业和药农无法承担高昂的种植成本。
技术实现要素：
针对现有技术中白芨的无性繁殖存在繁殖速度慢、培养周期长、成本高、地下假鳞茎和地上茎等外植体中容易滋生真菌和积累病毒，造成品种种性退化的问题，本发明提供一种白芨体细胞胚诱导及成苗方法，具体方案包括以下步骤：
（1）种子准备：选用未开裂的白芨新鲜蒴果里的种子作为体细胞胚诱导体，蒴果用洗衣粉或肥皂洗净，洗干净后，将蒴果放于超净工作台上的烧杯中，烧杯中加入75%的乙醇浸泡5 min，浸泡结束后，用无菌水冲洗蒴果3～4遍，冲洗结束后，将蒴果放到灭菌的培养皿中进行吹风，待蒴果被吹干后，剖开蒴果，留取种子，得到白芨体细胞胚诱导体，备用；
（2）培养基准备：在容量为1 L的容量瓶中加入0.7 L蒸馏水，20000~30000 mg的硫代硫酸钠，100~150 mg的维生素C，1.0~5.0 mg的活性炭，1.0~10 mg的氯化钠和30000 mg的蔗糖，60~80 g的香蕉，100~120 mL的椰乳，最后再加蒸馏水使容量瓶的液体体积达到1 L，配制成培养基，培养基的pH值在5.4~5.8之间；将配好的培养基按250 mL/瓶分装至培养瓶中，放入高温灭菌锅中灭菌25 min，温度控制在121 ℃，备用；
（3）实验室培养：在超净工作台里按无菌操作要求打开（2）步骤中经过高温灭菌的培养瓶的瓶盖，用镊子夹取（1）步骤中得到种子并伸进培养瓶口，用镊子尖后部在瓶口轻轻敲击，使得种子均匀撒落在培养基上，盖好瓶盖，将培养瓶拿出超净工作台，将装有种子的培养瓶放于细胞振荡培养箱中进行振荡暗培养，振荡速度为100 r/min，培养的温度控制在20~25 ℃之间，培养到第5 d，种子吸水、种皮充胀，此时，向培养瓶中添加5 g/L的白砂糖溶液20~25 mL；此后，每间隔10 d向培养基中添加同量的白砂糖溶液；培养到种子的种皮胀裂时，向培养瓶中添加0.1~0.5 mg/L甲硫达嗪浸泡种皮，进行愈伤组织上分化出体细胞胚的诱导，即原球茎的诱导；此后进行光培养，光照强度为2500 lx，光照时间为12 h/d；培养到50 d，种皮破裂处可见大量的愈伤组织，愈伤组织上分化出体细胞胚，即原球茎；培养到60 d，原球茎胚芽开始萌发，可见胚芽生长点时，停止振荡培养，得到培养物；
（4）大棚炼苗培养：将实验室培养60 d的培养物和培养基倒入食物搅拌器中，低频搅拌打散20~30 min，转速控制在300 r/min，然后用孔径为0.3 cm × 0.3 cm的喷壶将搅拌后的培养物和培养基均匀喷撒于苗盘内进行培养，每间隔7 d，向喷撒有外植体的苗盘内喷晒0.01~0.1 mg/L的激动素，喷晒至基质潮湿；苗盘培养到30 d，可见白芨幼苗长出一对绿色真叶；苗盘培养到60~90 d，白芨幼苗长出3~4对真叶，此时将幼苗取出，按5 cm × 5 cm间距的间距移至大棚内进行栽种；大棚内栽种90 d，白芨幼苗茎壮根粗，此时可移栽到大田。
采用本技术方案的有益效果是：
1、白芨的培养基中含有硫代硫酸钠、维生素C、活性炭、氯化钠、蔗糖、香蕉、椰乳、蒸馏水，其营养成份搭配比例合理，营养价值高，符合白芨生长的需要，同时，白芨的原球茎培养物在实验室内培养和大棚内炼苗培养的过程中，分别定期追加了白砂糖、甲硫达嗪和激动素，大大促进了白芨胚性愈伤组织的生长、分裂和体细胞胚形成效率，提高了繁殖效率；
2、一般白芨的组织培养育苗到大田移栽需要24个月，培养周期较长，生产成本较高，本发明利用种子的种皮破裂处产生的胚性愈伤组织形成体细胞胚，即原球茎，培养白芨种苗，从繁殖到大棚内炼苗培养只需8个月，有效缩短了培养周期，降低了生产成本，幼苗的培养成本低至0.2~0.3元；
3、本发明培养工序较为简单，且培养的白芨幼苗为无性第一代，克服了利用地下假鳞茎和地上茎等外植进行组培育苗时容易滋生真菌和积累病毒的问题，培养出来的种苗适应性及抗逆性极强，幼苗成活率可达到100%，降低了组培苗污染率，提高了品种种性的稳定性。
具体实施方式
实施例1：一种白芨体细胞胚诱导及成苗方法，包括以下步骤：
（1）种子准备：选用未开裂的白芨新鲜蒴果里的种子作为体细胞胚诱导体，蒴果用洗衣粉或肥皂洗净，洗干净后，将蒴果放于超净工作台上的烧杯中，烧杯中加入75%的乙醇浸泡5 min，浸泡结束后，用无菌水冲洗蒴果3遍，冲洗结束后，将蒴果放到灭菌的培养皿中进行吹风，待蒴果被吹干后，剖开蒴果，留取种子，得到白芨体细胞胚诱导体，备用；
（2）培养基准备：在容量为1 L的容量瓶中加入0.7 L蒸馏水，20000 mg的硫代硫酸钠，100 mg的维生素C，1.0 mg的活性炭，1.0 mg的氯化钠和30000 mg的蔗糖，60 g的香蕉，100 mL的椰乳，最后再加蒸馏水使容量瓶的液体体积达到1 L，配制成培养基，培养基的pH值为5.4；将配好的培养基按250 mL/瓶分装至培养瓶中，放入高温灭菌锅中灭菌25 min，温度控制在121 ℃，备用；
（3）实验室培养：在超净工作台里按无菌操作要求打开（2）步骤中经过高温灭菌的培养瓶的瓶盖，每瓶培养瓶中加入的种子量为5个蒴果里面的种子量，加入种子时，用镊子夹取（1）步骤中得到的种子并伸进培养瓶口，用镊子尖后部在瓶口轻轻敲击，使得种子均匀撒落在培养基上，盖好瓶盖，将培养瓶拿出超净工作台，将装有种子的培养瓶放于细胞振荡培养箱中进行振荡暗培养，振荡速度为100 r/min，培养的温度控制在20 ℃之间，培养到第5 d，种子吸水、种皮充胀，此时，向培养瓶中添加5 g/L的白砂糖溶液20 mL；此后，每间隔10 d向培养基中添加同量的白砂糖溶液；培养到种子的种皮胀裂时，向培养瓶中添加0.1 mg/L甲硫达嗪浸泡种皮，进行愈伤组织上分化出体细胞胚的诱导，即原球茎的诱导；此后进行光培养，光照强度为2500 lx，光照时间为12 h/d；培养到50 d，种皮破裂处可见大量的愈伤组织，愈伤组织上分化出体细胞胚，即原球茎；培养到60 d，原球茎胚芽开始萌发，可见胚芽生长点时，停止振荡培养，得到培养物；
（4）大棚炼苗培养：将实验室培养60 d的培养物和培养基倒入食物搅拌器中，低频搅拌打散20 min，转速控制在300 r/min，然后用孔径为0.3 cm × 0.3 cm的喷壶将搅拌后的培养物和培养基均匀喷撒于苗盘内进行培养，每间隔7 d，向喷撒有外植体的苗盘内喷晒0.01 mg/L的激动素，喷晒至基质潮湿；苗盘培养到30 d，可见白芨幼苗长出一对绿色真叶；苗盘培养到60 d，白芨幼苗长出3对真叶，此时将幼苗取出，按5 cm × 5 cm间距的间距移至大棚内进行栽种；大棚内栽种90 d，白芨幼苗茎壮根粗，此时可移栽到大田。
实施例2：一种白芨体细胞胚诱导及成苗方法，具体方案包括以下步骤：
（1）种子准备：选用未开裂的白芨新鲜蒴果里的种子作为体细胞胚诱导体，蒴果用洗衣粉或肥皂洗净，洗干净后，将蒴果放于超净工作台上的烧杯中，烧杯中加入75%的乙醇浸泡5 min，浸泡结束后，用无菌水冲洗蒴果4遍，冲洗结束后，将蒴果放到灭菌的培养皿中进行吹风，待蒴果被吹干后，剖开蒴果，留取种子，得到白芨体细胞胚诱导体，备用；
（2）培养基准备：在容量为1 L的容量瓶中加入0.7 L蒸馏水，30000 mg的硫代硫酸钠，150 mg的维生素C，5.0 mg的活性炭10 mg的氯化钠和30000 mg的蔗糖，80 g的香蕉，120 mL的椰乳，最后再加蒸馏水使容量瓶的液体体积达到1 L，配制成培养基，培养基的pH值在5.8之间；将配好的培养基按250 mL/瓶分装至培养瓶中，放入高温灭菌锅中灭菌25 min，温度控制在121 ℃，备用；
（3）实验室培养：在超净工作台里按无菌操作要求打开（2）步骤中经过高温灭菌的培养瓶的瓶盖，每瓶培养瓶中加入的种子量为5个蒴果里面的种子量，加入种子时，用镊子夹取（1）步骤中得到种子并伸进培养瓶口，用镊子尖后部在瓶口轻轻敲击，使得种子均匀撒落在培养基上，盖好瓶盖，将培养瓶拿出超净工作台，将装有种子的培养瓶放于细胞振荡培养箱中进行振荡暗培养，振荡速度为100 r/min，培养的温度控制在25 ℃，培养到第5 d，种子吸水、种皮充胀，此时，向培养瓶中添加5 g/L的白砂糖溶液20 mL；此后，每间隔10 d向培养基中添加同量的白砂糖溶液；培养到种子的种皮胀裂时，向培养瓶中添加0.5 mg/L甲硫达嗪浸泡种皮，进行愈伤组织上分化出体细胞胚的诱导，即原球茎的诱导；此后进行光培养，光照强度为2500 lx，光照时间为12 h/d；培养到50 d，种皮破裂处可见大量的愈伤组织，愈伤组织上分化出体细胞胚，即原球茎；培养到60 d，原球茎胚芽开始萌发，可见胚芽生长点时，停止振荡培养，得到培养物；
（4）大棚炼苗培养：将实验室培养60 d的培养物和培养基倒入食物搅拌器中，低频搅拌打散30 min，转速控制在300 r/min，然后用孔径为0.3 cm × 0.3 cm的喷壶将搅拌后的培养物和培养基均匀喷撒于苗盘内进行培养，每间隔7 d，向喷撒有外植体的苗盘内喷晒0.1 mg/L的激动素，喷晒至基质潮湿；苗盘培养到30 d，可见白芨幼苗长出一对绿色真叶；苗盘培养到90 d，白芨幼苗长出4对真叶，此时将幼苗取出，按5 cm × 5 cm间距的间距移至大棚内进行栽种；大棚内栽种90 d，白芨幼苗茎壮根粗，此时可移栽到大田。