白芨体细胞胚诱导及成苗方法与流程

文档序号:12598937阅读:来源:国知局

技术特征:

1.白芨体细胞胚诱导及成苗方法,其特征在于,具体方案包括以下步骤:

(1)种子准备:选用未开裂的白芨新鲜蒴果里的种子作为体细胞胚诱导体,蒴果用洗衣粉或肥皂洗净,洗干净后,将蒴果放于超净工作台上的烧杯中,烧杯中加入75%的乙醇浸泡5 min,浸泡结束后,用无菌水冲洗蒴果3~4遍,冲洗结束后,将蒴果放到灭菌的培养皿中进行吹风,待蒴果被吹干后,剖开蒴果,留取种子,得到白芨体细胞胚诱导体,备用;

(2)培养基准备:在容量为1 L的容量瓶中加入0.7 L蒸馏水,20000~30000 mg的硫代硫酸钠,100~150 mg的维生素C,1.0~5.0 mg的活性炭,1.0~10 mg的氯化钠和30000 mg的蔗糖,60~80 g的香蕉,100~120 mL的椰乳,最后再加蒸馏水使容量瓶的液体体积达到1 L,配制成培养基,培养基的pH值在5.4~5.8之间;将配好的培养基按250 mL/瓶分装至培养瓶中,放入高温灭菌锅中灭菌25 min,温度控制在121 ℃,备用;

(3)实验室培养:在超净工作台里按无菌操作要求打开(2)步骤中经过高温灭菌的培养瓶的瓶盖,用镊子夹取(1)步骤中得到种子并伸进培养瓶口,用镊子尖后部在瓶口轻轻敲击,使得种子均匀撒落在培养基上,盖好瓶盖,将培养瓶拿出超净工作台,将装有种子的培养瓶放于细胞振荡培养箱中进行振荡暗培养,振荡速度为100 r/min,培养的温度控制在20~25 ℃之间,培养到第5 d,种子吸水、种皮充胀,此时,向培养瓶中添加5 g/L的白砂糖溶液20~25 mL;此后,每间隔10 d向培养基中添加同量的白砂糖溶液;培养到种子的种皮胀裂时,向培养瓶中添加0.1~0.5 mg/L甲硫达嗪浸泡种皮,进行愈伤组织上分化出体细胞胚的诱导,即原球茎的诱导;此后进行光培养,光照强度为2500 lx,光照时间为12 h/d;培养到50 d,种皮破裂处可见大量的愈伤组织,愈伤组织上分化出体细胞胚,即原球茎;培养到60 d,原球茎胚芽开始萌发,可见胚芽生长点时,停止振荡培养,得到培养物;

(4)大棚炼苗培养:将实验室培养60 d的培养物和培养基倒入食物搅拌器中,低频搅拌打散20~30 min,转速控制在300 r/min,然后用孔径为0.3 cm × 0.3 cm的喷壶将搅拌后的培养物和培养基均匀喷撒于苗盘内进行培养,每间隔7 d,向喷撒有外植体的苗盘内喷晒0.01~0.1 mg/L的激动素,喷晒至基质潮湿;苗盘培养到30 d,可见白芨幼苗长出一对绿色真叶;苗盘培养到60~90 d,白芨幼苗长出3~4对真叶,此时将幼苗取出,按5 cm × 5 cm间距的间距移至大棚内进行栽种;大棚内栽种90 d,白芨幼苗茎壮根粗,此时可移栽到大田。

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