本发明涉及一种植物组织培养方法，具体涉及一种利用抑菌培养基培育茶树幼胚的组培方法，属生物
技术领域：
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背景技术：
：茶树(Camelliasinensis(L.)O.Kuntze)为山茶科山茶属多年生常绿乔木或灌木，具有悠久的栽培历史，是我国重要的经济作物之一。常规茶树育种技术具有局限性，如远缘杂交困难，有益突变频率低、选育优良品种耗时长、花期不遇等，制约了茶树优质资源的利用，使得茶树品种选育工作难以取得突破性的进展虽然传统育种方法已培育出了高产优质的茶树品种，但生产上仍缺少高茶氨酸、高茶多酚和低咖啡碱等符合人们消费需求的特异品种。这主要是因为茶树基因的高度杂合性，传统的茶树育种年限长、难度较大。植物离体再生技术的日益成熟和基因工程技术的不断发展，为茶树品种创新开辟了新的途径。基因工程技术的应用需要建立高频率的遗传转化体系，而高频率的遗传转化体系又依赖于高频率的再生体系，所以茶树未成熟胚组织培养再生体系是为遗传转化、品种改良打下基础。茶树幼胚组织培养的成本主要包括组培苗生产所需的培养基、设施设备、供电成本、耗材和人工成本。常规的茶树幼胚组织培养方法，要求外植体接种在高温高压灭菌后的无菌培养基中才能正常生长，耗能大，人工操作成本高。如果能通过药物抑菌的方法来改造培养基，使培养基无需经过高温高压灭菌，就能够获得茶树的正常生长。然而，针对不同的植物品种难以筛选到一种合适的抗菌剂，往往是当培养基抗菌时，植物组织的生长就受到抑制；而植物组织正常生长，就无法获得满意的抗菌效果。其原因，一是还没有一种抗生素对所有的菌类都有效，而且抗生素药效期短；二是有些抗菌素、防腐剂在有效的浓度下，其杀菌、抗菌离子对植物组织直接产生伤害，有些则产生盐害。必须选择与植物组织亲和、药效期长(至少一个生长周期)，不产生盐害并具有杀菌、抗菌活性的物质作为抗菌剂。因此，筛选合适的抗菌药剂是抑菌组培技术得以应用的关键。本发明就是为茶树幼胚组织培养提供一种抑菌的培养方法。一方面可以降低茶树幼胚组织培养对设施设备的要求，尤其不需要高温高压灭菌所需配置的高压锅设备，缩减了投资成本，电能消耗大幅度降低；另一方面，采用这种培养基开展茶树幼胚组织培养，组培环节大为简化，人工操作的速度大幅提高，从而降低了人工成本。此外，由于改造后的培养基自身具有杀菌、抗菌或抑菌作用，能有效控制组织培养过程中的污染问题，又不会对茶树生长产生毒害或抑制，即不影响茶树的正常生长，从根本上简化了茶树幼胚组织培养。技术实现要素：本发明的目的是提供一种利用抑菌培养基培育茶树幼胚的组培方法。本发明的目的是通过以下方法实现的。本发明的一种利用抑菌培养基培育茶树幼胚的组培方法，包括培养容器消毒、培养基配制、无菌水制备、诱导培养、分化培养、生根培养和瓶苗移栽，其特征在于：1.培养容器消毒：将培养瓶、瓶盖及接种用的塑料盘在100mg/L次氯酸钠+10mg/L环丝氨酸+0.5mg/L十二烷基磺酸钠的水溶液中浸泡不少于10h，保存备用；2.培养基配制：诱导培养基为：MS+0.1～2mg/L2,4-D+40～100mg/L次氯酸钠+1～5mg/L环丝氨酸+0.1～0.5mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；分化培养基为：MS+1～3mg/L6-BA+0.1～0.5mg/LIBA+0.5～2mg/LGA3+40～100mg/L次氯酸钠+1～5mg/L环丝氨酸+0.1～0.5mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；生根培养基为：1/2MS+1～3mg/LIBA+40～100mg/L次氯酸钠+1～5mg/L环丝氨酸+0.1～0.5mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；所述MS，为1962年，Murashige和Skoog公开的MS培养基；所述6-BA，指6-苄氨基嘌呤；所述GA3，指赤霉素；所述IBA，指α-吲哚丁酸；所述2,4-D，指2,4-二氯苯氧乙酸；配制培养基时，先称各培养基配方中的蔗糖和琼脂粉，加培养基总重量1/2的自来水，加热至琼脂粉完全溶解，再按各培养基配方配齐其他原料后，定容，然后用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl调pH值至5.8，分装到消毒过的培养容器中，封口，冷却凝固，备用；3.无菌水的制备：采用次氯酸钠、环丝氨酸、十二烷基磺酸钠和水配制无菌水，终浓度为100mg/L次氯酸钠、10mg/L环丝氨酸、0.5mg/L十二烷基磺酸钠，现配现用；4.诱导培养：采取未成熟的果实，用洗衣粉浸泡冲洗15min后，去除果壳，用体积比为75％酒精消毒30s，再用重量体积比为0.1％升汞浸泡消毒12min，无菌水反复冲洗不少于3次；消毒后的种子在无菌条件下剥开种壳，取出幼嫩的子叶型胚，接种于诱导培养基上，培养30d后长出各种类型的胚状体或愈伤组织；培养室温度为26℃，暗培养；5.分化培养：将诱导出的出各种类型的胚状体或愈伤组织转入分化培养基中，30d后逐步分化出芽；多次继代培养可以获得更多的芽苗；培养室温度为26℃，光照12h，光照强度为1400Lx；6.生根培养：取高度为3～5cm芽苗，接种到生根培养基上，培养25d后成为完整植株；培养室温度为25℃，光照12h，光照强度为1500Lx；7.瓶苗移栽：将生根培养获得的完整植株取出，洗净根部的培养基，用800倍的多菌灵浸泡30min后，移栽至透水性好的微酸性土壤中，大棚上层用遮光网遮盖，移栽的环境温度为22～28℃。本发明的应用效果：本发明的抑菌组培方法，利用化学试剂添加到各种培养基中，达到灭菌或抑菌的作用，配制的培养基是无需高温高压灭菌。因此，在茶树幼胚诱导培养、分化培养、生根培养各个阶段，除了要考虑常用的评价指标外，还要考虑污染率的问题。1.诱导培养：通过实验证实，本发明的一种利用抑菌培养基培育茶树幼胚的组培方法与常规的茶树幼胚组培方法相比，结果如表1所示，在诱导培养阶段的外植体培养的成活率差异不显著。表1本发明的抑菌组培方法对茶树幼胚诱导培养的影响组培方式外植体数外植体污染数成活率(％)常规组培方法300100抑菌组培方法3001002.分化培养：本发明的抑菌组培方法与常规组培茶树幼胚的分化率和污染率的比较，结果如表2所示，分化率和污染率二个指标都差异不显著。从瓶苗的生长状况看，本发明的抑菌组培方法的培养基，由于不经过高温高压灭菌，激素和营养元素损失较少，其茶树幼胚组培苗更壮，叶色更绿。表2本发明的抑菌组培方法对茶树体胚分化率和污染率的影响3本发明的抑菌组培方法对茶树幼胚生根率和污染率的影响：在组培苗生根过程中，本发明的抑菌组培方法与常规的茶树幼胚组培方法相比，结果如表3所示，生根率和污染率的差异不显著。表3本发明的抑菌组培方法的茶树幼胚瓶苗生根情况组培方式平均生根率(％)平均污染率(％)常规组培方法870.8抑菌组培方法860.54.成本分析：本发明的抑菌组培方法与常规组培的成本分析见表4。本发明抑菌组培省去了高压灭菌环节，简化了组培程序，提高了工作效率。从直接费用计算，每年可以节约5.5万元左右(以每天配制50L培养基计算)。常规组培需要添置高压锅等设备及日常维护，此外，常规组培还存在实验室安全等问题。表4本发明的茶树幼胚简便组培方法与常规组培的成本分析表本发明具有如下有益效果：1.本发明的茶树幼胚抑菌组培方法中，培养容器和培养基都无需高温高压灭菌，减少了工作量和能源消耗，简化了茶树幼胚组培技术环节，降低了茶树幼胚组培成本。2.本发明的茶树幼胚抑菌组培方法，操作简单，只需按不同的培养基配方配制后即可，实用性强，推广性好。3.本发明的茶树幼胚抑菌组培方法与常规的茶树幼胚组培方法对比，可以降低成本10％以上。具体实施方式为了进一步阐明本发明而不是限制本发明，以下结合实施例加以说明。实施例一：一种利用抑菌培养基培育茶树幼胚的组培方法一种利用抑菌培养基培育茶树幼胚的组培方法，包括以下步骤：1.培养容器消毒：将培养瓶、瓶盖及接种用的塑料盘在100mg/L次氯酸钠+10mg/L环丝氨酸+0.5mg/L十二烷基磺酸钠的水溶液中浸泡不少于10h，保存备用；2.培养基配制：诱导培养基为：MS+0.5mg/L2,4-D+60mg/L次氯酸钠+3mg/L环丝氨酸+0.3mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；分化培养基为：MS+2mg/L6-BA+0.3mg/LIBA+1mg/LGA3+60mg/L次氯酸钠+3mg/L环丝氨酸+0.3mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；生根培养基为：1/2MS+2mg/LIBA+60mg/L次氯酸钠+3mg/L环丝氨酸+0.3mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；配制培养基时，先称各培养基配方中的蔗糖和琼脂粉，加培养基总重量1/2的自来水，加热至琼脂粉完全溶解，再按各培养基配方配齐其他原料后，定容，然后用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl调pH值至5.8，分装到消毒过的培养容器中，封口，冷却凝固后备用；3.无菌水的制备：采用次氯酸钠、环丝氨酸、十二烷基磺酸钠和水配制无菌水，终浓度为100mg/L次氯酸钠、10mg/L环丝氨酸、0.5mg/L十二烷基磺酸钠，现配现用；4.诱导培养：采取未成熟的果实，用洗衣粉浸泡冲洗15min后，去除果壳，用体积比为75％酒精消毒30s，再用重量体积比为0.1％升汞浸泡消毒12min，无菌水反复冲洗3次。消毒后的种子在无菌条件下剥开种壳，取出幼嫩的子叶型胚，接种于诱导培养基上，培养30d后长出各种类型的胚状体或愈伤组织；培养室温度为26℃，暗培养；5.分化培养：将诱导出的出各种类型的胚状体或愈伤组织转入分化培养基中，30d后逐步分化出芽。多次继代培养后可以获得更多的芽苗；培养室温度为26℃，光照12h，光照强度为1400Lx；6.生根培养：取高度为3～5cm芽苗，接种到生根培养基上，培养25d后成为完整植株；培养室温度为25℃，光照12h，光照强度为1500Lx；7.瓶苗移栽：将生根培养获得的完整植株取出，洗净根部的培养基，用800倍的多菌灵浸泡30min后，移栽至透水性好的微酸性土壤中，大棚上层用遮光网遮盖，移栽的环境温度为22～28℃。当前第1页1 2 3