本发明涉及一种植物组织培养方法，具体涉及一种利用抑菌培养基培育斑茅的组培方法，属生物
技术领域：
。
背景技术：
：斑茅(SaccharumarundinaceumRetz.)是甘蔗属(SaccharumLinn.)内的一个野生种，其分布区域广，具有抗旱、耐瘠、抗寒、植株高大、分蘖能力强等优良特性，是甘蔗育种中具有较大潜在利用价值的重要种质资源，在甘蔗育种中有着不可忽视的应用潜力。斑茅作为甘蔗育种中一种重要的种植资源，要保持其遗传典型性，一般以无性繁殖保存，即通过田间多年生宿根保育。然而这种保育种质的方式存在诸多问题，如占地面积大、不易管理；材料在田间易受恶劣环境和病、虫、鼠害的破坏，造成遗传资源流失；无性系之间容易混杂等等。随着生物技术的迅速发展，组织培养技术的日臻成熟，种质资源可以通过组织培养技术进行室内保育，既能避免上述问题的发生，又能节省人力、物力的投入。班茅与甘蔗通过体细胞杂交，可为甘蔗育种开辟广阔的前景。在进行体细胞杂交这一过程中，外植体的培养、愈伤组织的获得、分化再生苗等是不可缺少的组培环节。因此，无论是种植资源的保存还是利用，均需要进行组织培养。斑茅组织培养的成本主要包括组培苗生产所需的培养基、设施设备、供电成本、耗材和人工成本。常规的斑茅组织培养方法要求外植体接种在高温高压灭菌后的无菌培养基中才能正常生长，耗能大，人工操作成本高。如果能通过抑菌的方法来改造培养基，使培养基不需要进行高温高压灭菌，就能够使斑茅正常生长。这样，一方面可以降低斑茅组织培养对设施设备的要求，尤其不需要高温高压灭菌所需配置的高压锅设备，缩减了投资成本，电能消耗也将大幅度降低；另一方面，采用这种培养基开展斑茅组织培养，组培环节大为简化，人工操作的速度大幅提高，从而降低了人工成本。此外，由于改造后的培养基自身具有杀菌、抗菌或抑菌作用，能有效控制组织培养过程中的污染问题，又不会对斑茅生长产生毒害或抑制，即不影响斑茅的正常生长，从根本上简化了斑茅组织培养。技术实现要素：本发明的目的是提供一种利用抑菌培养基培育班茅的组培方法。本发明的目的是通过以下方法实现的。本发明的一种利用抑菌培养基培育班茅的组培方法，包括培养容器消毒、培养基配制、无菌水制备、诱导培养、分化及增殖培养、生根培养和瓶苗移栽，其特征在于：1.培养容器消毒：将培养瓶、瓶盖及接种用的塑料盘在100mg/L次氯酸钠+10mg/L环丝氨酸+0.5mg/L十二烷基磺酸钠的水溶液中浸泡不少于10h，保存备用；2.培养基配制：诱导培养基为MS+1～5mg/L2,4-D+40～100mg/L次氯酸钠+0.5～2.0mg/L环丝氨酸+10～50mg/L特美汀+0.1～0.5mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；分化及增殖培养基为：MS+0.1～2mg/LIBA+0.5～2mg/LKT+40～100mg/L次氯酸钠+0.5～2.0mg/L环丝氨酸+10～50mg/L特美汀+0.1～0.5mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；生根培养基为1/2MS+1～4mg/LIAA+40～100mg/L次氯酸钠+0.5～2.0mg/L环丝氨酸+10～50mg/L特美汀+0.1～0.5mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；所述MS，为1962年，Murashige和Skoog公开的MS培养基；所述IBA，指α-吲哚丁酸；所述KT，指6－糠氨基嘌呤；所述2,4-D，指2,4-二氯苯氧乙酸；所述IAA，指吲哚乙酸；配制培养基时，先称各培养基配方中的蔗糖和琼脂粉，加培养基总重量1/2的自来水，加热至琼脂粉完全溶解，再按各培养基配方配齐其他原料后，定容，然后用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl调pH值至5.8，分装到消毒过的培养容器中，封口，冷却凝固后备用；3.无菌水的制备：采用次氯酸钠、环丝氨酸、十二烷基磺酸钠和水配制无菌水，终浓度为100mg/L次氯酸钠、10mg/L环丝氨酸、0.5mg/L十二烷基磺酸钠，现配现用；4.诱导培养：取田间生长健壮且无病虫害的班茅无性系茎梢带叶鞘的部位，用体积比为75％的乙醇表面消毒，剥离外层叶鞘，取白色心叶的肥厚带中生长点以上5cm内的幼嫩心叶，将其切成不超过3mm厚度的圆片，接种于诱导培养基上，培养30d后诱导出愈伤组织；培养室温度为26℃，暗培养；5.分化及增殖培养：将诱导出的班茅愈伤组织转入分化培养基中，30d后逐步分化出幼芽；将幼芽接种到增殖培养基上，逐步发育成丛生苗，每15d转接一次，可以达到大量增殖的效果；培养室温度为26℃，光照12h，光照强度为1500Lx；6.生根培养：取高度为3～5cm苗，接种到生根培养基上，培养25d后成为完整植株；培养室温度为26℃，光照12h，光照强度为1800Lx；7.瓶苗移栽：将生根培养获得的完整植株取出，洗净根部的培养基，用800倍的多菌灵浸泡30min后，移栽至透水性好的基质中，大棚上层用遮光网遮盖，移栽的环境温度为22～28℃，所述透水性好的基质，如草木灰:沙子:耕作土＝1:1:1。本发明的应用效果：本发明的抑菌组培方法，利用化学试剂添加到各种培养基中，达到灭菌或抑菌的作用，配制的培养基无需高温高压灭菌。因此，在班茅诱导培养、增殖培养、生根培养各个阶段，除了要考虑常用的评价指标外，还要考虑污染率的问题。1.诱导培养：通过实验证实，本发明的一种利用抑菌培养基培育班茅的组培方法与常规的班茅组培方法比较，结果如表1所示，在诱导培养阶段，外植体诱导率无明显差异。表1本发明的抑菌组培方法对班茅诱导培养的影响组培方式外植体数外植体污染数诱导率(％)常规组培方法773258.4抑菌组培方法813359.32.增殖培养：本发明的抑菌组培方法与常规组培班茅的增殖倍数和污染率的比较，结果如表2所示，增殖倍数和污染率，二个指标都差异不显著。表2本发明的抑菌组培方法对班茅增殖倍数和污染率的影响组培方式增殖倍数平均污染率(％)常规组培方法2.50.3抑菌组培方法2.60.23.在组培苗生根过程中，本发明的抑菌组培方法与常规的班茅组培方法相比，由于不经过高温高压灭菌，激素和营养元素损失较少，班茅组培苗生根效果更好，结果如表3所示，生根率和污染率的差异不显著。表3本发明的班茅抑菌组培方法与常规的班茅组培方法瓶苗生根比较组培方式生根率(％)平均污染率(％)常规组培方法790.5抑菌组培方法800.44.成本分析：本发明的抑菌组培方法与常规组培的成本分析见表4。本发明组培省去了高压灭菌环节，简化了组培程序，提高了工作效率。从直接费用计算，每年可以节约5.5万元左右(以每天配制50L培养基计算)。常规组培还需要添置高压锅等设备及其维修，以及实验室安全等。表4本发明的班茅抑菌组培方法与常规组培的成本分析比较本发明具有如下有益效果：1.本发明的班茅抑菌组培方法中，培养容器和培养基都无需高温高压灭菌，减少了工作量和能源消耗，简化了班茅组培技术环节，降低了班茅组培成本。2.本发明的班茅抑菌组培方法，操作简单，只需按不同的培养基配方配制后即可，实用性强，推广性好。3.本发明的班茅抑菌组培方法与常规的班茅组培方法对比，可以降低成本10％以上。具体实施方式为了进一步阐明本发明而不是限制本发明，以下结合实施例加以说明。实施例一：一种利用抑菌培养基培育班茅的组培方法一种利用抑菌培养基培育班茅的组培方法，包括以下步骤：1.培养容器消毒：将培养瓶、瓶盖及接种用的塑料盘在100mg/L次氯酸钠+10mg/L环丝氨酸+0.5mg/L十二烷基磺酸钠的水溶液中浸泡不少于10h，保存备用；2.培养基配制：诱导培养基为MS+4.0mg/L2,4-D+60mg/L次氯酸钠+1.0mg/L环丝氨酸+30mg/L特美汀+0.3mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；分化及增殖培养基为：MS+1.0mg/LIBA+1.0mg/LKT+60mg/L次氯酸钠+1.0mg/L环丝氨酸+30mg/L特美汀+0.3mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；生根培养基为1/2MS+3.0mg/LIAA+60mg/L次氯酸钠+1.0mg/L环丝氨酸+30mg/L特美汀+0.3mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；配制培养基时，先称各培养基配方中的蔗糖和琼脂粉，加培养基总重量1/2的自来水，加热至琼脂粉完全溶解，再按各培养基配方配齐其他原料后，定容，然后用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl调pH值至5.8，分装到消毒过的培养容器中，封口，冷却凝固后备用；3.无菌水的制备：采用次氯酸钠、环丝氨酸、十二烷基磺酸钠和水配制无菌水，终浓度为100mg/L次氯酸钠、10mg/L环丝氨酸、0.5mg/L十二烷基磺酸钠，现配现用；4.诱导培养：取田间生长健壮且无病虫害的班茅无性系茎梢带叶鞘的部位，用体积比为75％的乙醇表面消毒，剥离外层叶鞘，留下3～4层的嫩叶鞘，取肥厚带中生长点以上5cm内的幼嫩心叶，将其切成不超过3mm厚度的圆片，接种于诱导培养基上，培养30d后诱导出愈伤组织；培养室温度为26℃，暗培养；5.分化及增殖培养：将诱导出的班茅愈伤组织转入分化培养基中，30d后逐步分化出幼芽；将幼芽接种到增殖培养基上，逐步发育成丛生苗，每15d转接一次，可以达到大量增殖的效果；培养室温度为26℃，光照12h，光照强度为1500Lx；6.生根培养：取高度为3～5cm苗，接种到生根培养基上，培养25d后成为完整植株；培养室温度为26℃，光照12h，光照强度为1800Lx；7.瓶苗移栽：将生根培养获得的完整植株取出，洗净根部的培养基，用800倍的多菌灵浸泡30min后，移栽至透水性好的基质中(草木灰:沙子:耕作土＝1:1:1)，大棚上层用遮光网遮盖，移栽的环境温度为22～28℃。当前第1页1 2 3