一种亨利兜兰的组织培养快速繁殖方法与流程

本发明涉及植物组织培养技术领域，具体而言，本发明涉及一种亨利兜兰组织培养快速繁殖的方法、一种适于亨利兜兰组织培养快速繁殖的培养基体系以及一种确定亨利兜兰果荚最佳采集期的方法。

背景技术：

兜兰属(Paphiopedilum)是兰科观赏价值最高的属之一，是继蝴蝶兰、大花蕙兰、文心兰之后的一个新兴兰花。近年来在各类花展中，兜兰属花卉频繁出现并多次获得大奖。兜兰在花卉市场上作为高档盆花也为越来越多的人所喜爱。兜兰原生种主要分布于西南和南部的热带与亚热带地区，以云南、广西和贵州分布最多。

亨利兜兰(Paphiopedilum henryanum)原产我国广西、贵州等地，叶片翠绿，花可爱秀美，观赏价值高。由于近年来日益恶劣的生态环境、自身特殊的生物学特性以及人们的过度性采挖，野生亨利兜兰已经难觅踪迹。据发明人2012年-2016年间多次进行的野外考察，仅在云南文山和越南交界的地方见到原始居群。因此应加强亨利兜兰的保护工作，尤其要开展亨利兜兰的繁殖技术研究，以利益促保护，减少野外采挖破坏。

由于传统的分株等方法繁殖系数低，费时费力，种子发育不全且没有胚乳，兰花多采用组培快繁的方法进行繁殖。兜兰的组织培养技术难度极大(王代谷等，“贵州兜兰属植物的现状及展望”,《安徽农业科学》,2009,37(6):2469-2470)，是兰科中最难的属之一。杨燕萍等以亨利兜兰的侧芽为材料进行诱导和离体快繁实验，茎尖诱导培养基以Heller+2mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+0.5g/L活性炭，在继代培养中，试管苗在培养基1/2MS+0.2mg/L 6-BA+2mg/L NAA+10％椰子汁+2g/L活性炭中丛生芽增殖为佳，增殖倍数为3.50，增殖系数有待提高(杨燕萍等，“亨利兜兰茎尖诱导与离体快繁试验”，《农业科技通讯》，2011，53-55)。曾宋君等(曾宋君等，“兜兰无菌播种和组织培养研究进展”,《园艺学报》,2007,34(3):793-796)以人工授粉后300天的兜兰种子进行无菌播种实验，发现播种于VW+1mg/L NAA+100ml/L椰子汁+1g/L活性炭培养基，萌发快，萌发率最高约50％。但是随后停止生长并有大量原球茎死亡，需转至另一种培养基继代培养，文中未提到增殖倍数。Lee等从亨利兜兰授粉后60天开始取果荚，每隔30天取一次，一直到270天，发现授粉150天的果荚种子萌发率最高，达40％左右(YI Lee,“Asymbiotic Seed Germination of Six Paphiopedilum Species in Relation to the Time of Seed Collection and Seed Pretreatment”,Acta Horticulturae,2007,755(755):381-386)。可见，目前亨利兜兰的组培快繁殖技术还不是很成熟。

因此，为了保护亨利兜兰的野生资源同时满足消费者的需求，有必要提供一种亨利兜兰的快速繁殖体系，以缩短其培养周期、提高种苗成活率和幼苗质量、降低成本，从而满足市场对这一观赏花卉不断增长的需求。

技术实现要素：

为了解决上述问题和克服现有技术中的缺陷，本发明提供了一种亨利兜兰组织培养快速繁殖的方法、一种适于亨利兜兰组织培养快速繁殖的培养基体系以及提供了亨利兜兰果荚的最佳采集期。

本发明的第一方面提供了一种亨利兜兰组织培养快速繁殖的方法，包括以下步骤：

(1)自交授粉：选择花大色艳的亨利兜兰进行异花授粉；

(2)果荚采摘：在亨利兜兰自交后270-390天左右采集果荚；

(3)无菌播种：以采集的果荚为外植体进行消毒，切开果荚将种子接种在萌发培养基中，暗培养大约4周开始有原球茎萌发，大约8周有芽长出，然后转为光照周期为12h培养；

(4)增殖继代培养：将步骤(3)中产生的幼苗接种到增殖培养基中，每4周继代一次，增值率达3倍；

(5)生根壮苗培养：将步骤(4)中增殖培养大约8周的、生长健壮的2cm左右的幼苗转接到生根壮苗培养基中进行培养；

(6)生根苗移栽：在步骤(5)中的幼苗培养大约4周后，将根系生长良好的植株转移到自然光下炼苗，然后将其移栽至基质中进行培养。

在一个实施方式中，在本发明的方法中使用的所述萌发培养基为1/2MS+100ml/L椰汁+1.0mg/L NAA+1.0g/L活性炭+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶；或者所述萌发培养基为1/2MS+100ml/L椰汁+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶。

在一个实施方式中，在本发明的方法中使用的所述增殖培养基为1/2MS+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+100ml/L椰乳+1.5g/L活性炭20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶。

在一个实施方式中，在本发明的方法中使用的所述生根壮苗培养基为1/2MS+0.3mg/L NAA+100ml/L椰汁+1.5g/L活性炭+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶。

在一个优选的实施方式中，在亨利兜兰自交后第260天左右、第270天左右、第300天左右、第330天左右、第360天左右、第390天左右或上述任意时间点之间的任意时间点采集果荚。例如，可以在亨利兜兰自交后第260天左右、第270天左右、第280天左右、第290天左右、第300天左右、第310天左右、第320天左右、第330天左右、第340天左右、第350天左右、第360天左右、第370天左右、第380天左右、第390天左右或上述任意时间点之间的任意时间点采集果荚。优选地，在亨利兜兰自交后第270-330天左右、第330-360天左右或第360-390天左右采摘果荚，更优选地在亨利兜兰自交后第270-300天左右、第300-330天左右或第330-360天左右采摘果荚，甚至更优选地在亨利兜兰自交后第330-330天左右采摘果荚。优选地，在亨利兜兰自交后第270天左右、第300天左右或第330天左右采摘果荚。

在一个实施方式中，在本发明的方法中，培养室培养的温度为24±2℃，光照强度为1000-15001x，光照周期为12h；黑暗培养温度为24±2℃。

本发明的第二方面提供了一种用于亨利兜兰组织培养快速繁殖的萌发培养基，所述萌发培养基为1/2MS+100ml/L椰汁+1.0mg/L NAA+1.0g/L活性炭+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶。

本发明的第三方面提供了一种用于亨利兜兰组织培养快速繁殖的培养基体系，其包含萌发培养基、增殖培养基和生根壮苗培养基，其中所述萌发培养基为1/2MS+100ml/L椰汁+1.0mg/L NAA+1.0g/L活性炭+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶或者所述萌发培养基为1/2MS+100ml/L椰汁+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶。

在一个实施方式中，本发明的培养基体系中的所述增殖培养基为1/2MS+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+100ml/L椰乳+1.5g/L活性炭20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶。

在一个优选的实施方式中，本发明的培养基体系中的所述生根壮苗培养基为1/2MS+0.3mg/L NAA+100ml/L椰汁+1.5g/L活性炭+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶。

在一个优选的实施方式中，本发明的培养基体系是下面表1所示的培养基体系，表1列出了本发明培养基体系中的各种培养基的成分及其用量。

表1.亨利兜兰的离体培养基体系

注：表1中的生根壮苗培养基，既可作为一般生根壮苗培养基，也是本发明所指的可用来做长期继代的培养基。

定义

为了便于对本发明的理解，对上述各个方面中所用的培养基、培养基中所用到的植物激素进行定义。

本发明所使用的MS基本培养基是根据Murashige T.等(Murashige T.and F.Skoog.Physiol.Plant,1962,15:473-497)配制的，其成分及各成分含量如下表2所示。1/2MS为MS基本培养基中大量元素减半，其他元素用量不变；1/5MS为MS基本培养基中大量元素减至五分之一，其他元素用量不变。

本文中培养基中的成分“NAA”是指萘乙酸。

本文中所述的“6-BA”是指6-苄氨基嘌呤。

表2.MS培养基各成分及含量

本发明的有益技术效果

本发明产生的积极效果是：

(a)本发明所采用的外植体可在某固定时间段大量集中获得并进行组织培养，打破了外植体不易获得且污染率高的限制；

(b)本发明确立了亨利兜兰无菌播种的最佳果荚成熟期，此时播种缩短了果荚生长时间，且种子萌发早，萌发率高、幼苗的增殖效果好；

(c)本发明还提供了适于亨利兜兰离体快繁的培养基体系，包括萌发培养基、增殖培养基和生根壮苗培养基，培养基配方简单，离体快繁的操作流程简洁易操作，生产低成本，可进行商业化大规模生产。

前述内容仅仅是示意性的并且决不旨在是限制性的。除了上述示意性方面、实施方式和特征，通过参考下述详细说明，进一步的方面、实施方式和特征将更容易被理解。

附图简述

通过参考下述附图，本发明的进一步的方面、特征将更容易被理解。本领域技术人员应该理解，这些附图仅示意性地阐述了根据本发明的一些实施方式，而不应将其视为是对本发明范围的限制。

图1示出了亨利兜兰授粉过程的示意图。

图2示出了授粉后150天和330天采集的种子的图像，其中在授粉后150天采集的亨利兜兰的种子为白色，330天采集的为褐色。

图3示出了在亨利兜兰授粉后240天、270天、330天和390天采集的种子萌发165天生长情况。

图4示出了不同时期(从授粉后210天到420天)采摘的果荚在培养基(1)和培养基(2)中分别培养8周和16周后种子的萌发率，其中培养基(1)为1/2MS+100ml/L椰汁+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶，培养基(2)为1/2MS+100ml/L椰汁+1.0mg/L NAA+1.0g/L活性炭+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶。

图5示出了根据本发明一个方面的亨利兜兰组培快繁技术体系的流程图。

图6示出了根据本发明一个方面的亨利兜兰的组织培养过程图。

图7示出了亨利兜兰的出瓶炼苗情况。

具体实施方式

在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此，附图和描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。

实施例1.亨利兜兰自交授粉和果荚最佳采摘期的确定

实验材料：亨利兜兰获取自中国农业科学院蔬菜花卉研究所温室；本发明所有实施例中使用的各种试剂或培养基成分均经商购获得。

选择花大色艳的亨利兜兰进行人工异花授粉，如图1所示，授粉后生长得到果荚。

授粉后，分别在第120天、第150天、第180天、第210天、第240天、第270天、第330天、第360天、第390天以及第420天收集果荚。

将上述果荚分别用自来水洗净后，置于75％酒精浸泡30s，再以0.1％升汞灭菌15min，最后用无菌水清洗3遍。将洗净的果荚切开，将种子接种于萌发培养基(培养基(1)和培养基(2))上，暗培养大约4周后原球茎萌发，大约8周有芽长出，然后转为光照周期为12h培养。

培养基(1)为1/2MS+100ml/L椰汁+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶，培养基(2)为1/2MS+100ml/L椰汁+1.0mg/L NAA+1.0g/L活性炭20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶。培养条件为：培养室培养的温度为24±2℃，光照强度为1000-15001x，光照周期为12h；黑暗培养温度为24±2℃。

结果发现，在授粉后150天-270天采集的亨利兜兰的种子为白色，授粉后300天之后采集的种子为褐色(见图2)。亨利兜兰种子暗培养大约4周开始有原球茎萌发，大约8周有芽长出，转入光培养后，大概10周转绿。授粉后120天到210天采集的种子没有萌发率，表明采取果荚的时间尚早，种胚发育不完全。授粉后270天采集的果荚在培养基(2)上培养8周后发芽率最高，达62.15％，16周时由于褐化等原因萌发率稍有降低。授粉后360天的果荚在播种16周时，培养基(2)上的萌发率达到56.33％。可见成熟度高的种子萌发稍慢，但是成活率稍高(见图2-4)。

实施例2.亨利兜兰种子的组织培养快速繁殖

如附图5-7所示，本发明的亨利兜兰种子的组织培养快速繁殖方法包括如下步骤：

1、自交授粉：选择花大色艳的亨利兜兰进行异花授粉；

2、果荚采摘：在亨利兜兰自交后270天左右采集果荚；

3、无菌播种：按照实施例1中所述的方法以采集的果荚为外植体进行消毒，切开果荚将种子接种在萌发培养基(实施例1中的培养基(2))中进行暗培养40天左右，有原球茎萌发后转为光照周期为12h培养，8周时，种子萌发率可达62.15％；

4、增殖继代培养：将步骤3中产生的幼苗接种到增殖培养基中，每4周继代一次，其中增殖培养基为1/2MS+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+100ml/L椰乳+1.5g/L活性炭20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶；

5、生根壮苗培养：将步骤4中增殖培养8周的、生长健壮的2cm左右的幼苗转接到生根壮苗培养基中进行培养，其中生根壮苗培养基为1/2MS+0.3mg/L NAA+100ml/L椰汁+1.5g/L活性炭+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉胶；

6、生根苗移栽：在步骤5中的幼苗培养4周后，将根系生长良好的植株转移到自然光下炼苗，然后将其移栽至基质中进行培养，成活率可达95％。

实施例3.亨利兜兰种子的组织培养快速繁殖

如附图6-7所示，本发明的亨利兜兰种子的组织培养快速繁殖方法包括如下步骤：

1、自交授粉：选择花大色艳的亨利兜兰进行异花授粉；

2、果荚采摘：在带叶兜兰自交后330天左右采集果荚；

3、无菌播种：采用上述培养基(1)按照实施例2所述的方法进行无菌播种，种子萌发率达55.22％；

4、增殖继代培养：按照实施例2所述的方法进行增殖继代培养；

5、生根壮苗培养：按照实施例2所述的方法进行生根壮苗培养；

6、生根苗移栽：在步骤5中的幼苗培养4周后，将根系生长良好的植株转移到自然光下炼苗，然后将其移栽至基质中进行培养，成活率可达95％。

实施例4.亨利兜兰种子的组织培养快速繁殖

如附图6-7所示，本发明的亨利兜兰种子的组织培养快速繁殖方法包括如下步骤：

1、自交授粉：选择花大色艳的亨利兜兰进行异花授粉；

2、果荚采摘：在带叶兜兰自交后360天左右采集果荚；

3、无菌播种：采用上述培养基(2)按照实施例2所述的方法进行无菌播种，种子萌发率达56.33％；

4、增殖继代培养：按照实施例2所述的方法进行增殖继代培养；

5、生根壮苗培养：按照实施例2所述的方法进行生根壮苗培养；

6、生根苗移栽：在步骤5中的幼苗培养4周后，将根系生长良好的植株转移到自然光下炼苗，然后将其移栽至基质中进行培养，成活率可达95％。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到其各种变化或替换，这些都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。