专利名称：巨瓣兜兰组培快繁方法
技术领域：
本发明涉及生物工程的植物组织培养繁育方法，特别是涉及一种巨瓣兜兰组培快繁方法。背景方法
兰科植物是自然界最大的家族之一，是有花植物中最为庞大和进化水平极高的类群之一，在被子植物当中仅次于菊科和禾本科位于第三大科。全 世界的兰科植物约有700属、20000种-30000种，广泛分布于从温带、亚热带到热带的广大区域。我国已发现并定名的兰花约170余属1300余种，其中2/3为附生兰，1/3为地生兰。目前，整个兰科植物已被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》附录I或II。贵州是一个喀斯特地貌广泛发育的高原省份，在地理环境上属于亚热带气候，具有独特复杂的地形地貌、植被类型多样和良好的水热条件，适宜多种植物繁衍生息，同时也孕育了较丰富的兰花资源。贵州省境内分布有兰科植物约76属320余种，包括大量的变种及品种。览兰属(Paphiopedilum Pfitz)植物是兰科植物最具欣赏价值的物种之一,览兰由于独特的花朵造型、绚丽的花朵色彩、持久的观赏花期而具有极高的观赏价值，是国际上栽培最广泛的兰花之一，我国近年来兜兰市场也在迅速扩大。我国是世界兜兰属的重要分布地和许多新种的模式产地。巨瓣5 兰〔Paphiopedilumbellatulum(Rchb. f. ) Stein)属兰科(Orchidaceae)3 兰属(Paphiopedilum)的多年生草本植物,分布广西、云南以及贵州等地,生于石灰岩地区，地生或石上附生植物，叶4-5枚，上面有深浅绿色相间的网格斑；花通常I朵，白色或奶油黄色，具紫褐色粗斑点，是兜兰属中罕见的种类，其兜状花大而色艳，姿态优雅，气味芳香，花期较长，具有较高的观赏价值。巨瓣兜兰被国际公约列为一级保护物种，是我国特有的备受国际关注的国家一级保护物种，是兜兰属植物中的上品，是园艺栽培中不可多得的种质资源，已处于濒危灭绝的边缘。由于巨瓣兜兰胚发育不完全，在自然状态下繁殖困难，存在种子萌发率极低，成苗率低的困难；传统的无性分株繁殖法，周期长，繁殖系数低，每年只能增殖I 3倍，常规繁殖难度大。因此如何运用植物生物促成方法快速繁殖巨瓣兜兰已成为兰科植物科研项目的重点。巨瓣兜兰的组培快繁方法就是采用兰花的无菌播种与试管快速成苗的方法，在短时间内以进行大规模种植以满足市场需求，在其科研与开发中具有极深远的现实意义。
发明内容
本发明的目的是开发一种巨瓣兜兰的组培快繁方法，在专门配制的培养基上，通过人工无菌播种的方法，经过无菌播种、种子萌发、壮苗培养和试管苗移栽等繁殖步骤，获得原球茎及芽混合体，利用无菌播种小苗进行增殖，在短时间内获得大量整齐划一的试管苗，通过壮苗生根培养能形成完整植株。通过发明人的努力，完成了巨瓣兜兰的组培快繁方法的研究工作。
本发明巨瓣兜兰的组培快繁方法，其过程包括以下步骤
(I)无菌培养物的建立，选取生长健壮的巨瓣兜兰母株，在开花时进行人工授粉，授粉后180天，将发育至基本成熟而未开裂的果实作为外植体。(2)原球茎萌发阶段选用饱满的果实用75%的酒精浸泡30秒，置于0.1%的升汞溶液中消毒20分种，无菌水冲洗4-5次，切开果实，用接种针将褐色粉末状胚接种到1/2MS添加α -萘乙酸(NAA) 2毫克/升上培养基上，培养60天左右，形成原球茎及芽。(3)增殖培养阶段为获得更多的种苗，将芽和原球茎混合组织接种在1/2MS附加6-苄基氨基嘌呤出-BA) 20毫克/升培养基上，经120天培养，长成丛生带短根的小苗。(4)壮苗生根阶段将长成的丛生植株分开，接种到1/4MS添加吲哚乙酸(IBA)O. 4毫克/升的培养基上，培养90天后长成具2-3条根、3-4片叶的完整植株。(5)练苗及移栽当试管苗长至3-4厘米时，出瓶前在温室中的自然光照下炼苗7·天，然后将其从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，移入碎树皮和水苔的混合基质中。温室保持15-28°C的温度、70%以上的湿度、78-80%的遮阴并通风，巨瓣兜兰即可正常生长，成苗的移栽成活率可达90%以上。通常15天左右浇一次有机肥(发酵的油枯水)或叶面肥，其浓度为稀释1000倍质量比，薄肥勤施，加强病虫害管护措施即可建立巨瓣兜兰种苗的产业化培育方法体系。本发明的有益效果是这项发明的巨瓣兜兰的组培繁殖方法，可以提高繁殖系数，是获得大量巨瓣兜兰种苗的高效率试管繁殖方法，具有萌发率高，成苗快，种苗品质好、生长势强等优势，能够得到整齐化一的种苗，并在短时间内提供大量的种苗，为兰花的种苗生产提供一条有效的途径，从而更好的保护野生资源。
具体实施例方式实施例I
(I)无菌培养物的建立，选择发育基本成熟而未开裂的果实作为外植体，进行无菌培养。(2)原球茎萌发阶段选用饱满的果实用75%的酒精浸泡30秒，置于0.1%的升汞溶液中消毒20分种，无菌水冲洗4-5次，切开果实，用接种针将褐色粉末状胚接种到1/2MS添加α -萘乙酸(NAA) 2毫克/升的培养基上，培养60天左右，形成原球茎及芽。(3)增殖培养阶段为获得更多的种苗，将芽和原球茎混合组织接种在1/2MS附加6-苄基氨基嘌呤出-BA) 20毫克/升培养基上，经120天培养，长成丛生带短根的小苗，繁殖系数可达3-4。(4)壮苗生根阶段将丛生植株分开，接种到1/4MS添加吲哚乙酸(IBA) O. 4毫克/升的培养基上，培养90天后可长成具2-3条根、3-4片叶的完整植株。(5)练苗及移栽当试管苗长至3-4厘米时，出瓶前在温室中的自然光照下炼苗7天，然后将其从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，移入碎树皮和水苔的混合基质中。温室保持15-28°C的温度、70%以上的湿度、78-80%的遮阴并通风，巨瓣兜兰即可正常生长，成苗的移栽成活率可达90%以上。通常15天左右浇一次有机肥(发酵的油枯水)或叶面肥(稀释1000倍)，薄肥勤施，加强病虫害管护措施即可建立巨瓣兜兰种苗的产业化培育方法体系，目前栽种巨瓣兜兰种苗3000余株。
权利要求
1.巨瓣兜兰的组培快繁方法，其特征是方法包括以下步骤 ①无菌培养物的建立，选取生长健壮的巨瓣兜兰母株，在开花时进行人工授粉，授粉后180天，将发育至基本成熟而未开裂的果实作为外植体； ②原球茎萌发阶段选用饱满的果实用75%的酒精浸泡30秒，置于O.1%的升汞溶液中消毒20分种，无菌水冲洗4-5次，切开果实，用接种针将褐色粉末状胚接种到1/2MS添加α -萘乙酸(NAA) 2毫克/升上培养基上，培养60天左右，形成原球茎及芽； ③增殖培养阶段为获得更多的种苗，将芽和原球茎混合组织接种在1/2MS附加6-苄基氨基嘌呤出-BA) 20毫克/升培养基上，经120天培养，长成丛生带短根的小苗； ④壮苗生根阶段将长成的丛生植株分开，接种到1/4MS添加吲哚乙酸(IBA)O. 4毫克/升的培养基上，培养90天后长成具2-3条根、3-4片叶的完整植株； ⑤练苗及移栽当试管苗长至3-4厘米时，出瓶前在温室中的自然光照下炼苗7天，然后将其从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，移入碎树皮和水苔的混合基质中；温室保持15-28°C的温度、70%以上的湿度、78-80%的遮阴并通风，巨瓣兜兰即可正常生长，成苗的移栽成活率可达90%以上；通常15天左右浇一次有机肥(发酵的油枯水)或叶面肥其浓度为稀释1000倍质量比，薄肥勤施，加强病虫害管护措施即可建立巨瓣兜兰种苗的产业化培育方法。
全文摘要
本发明公开了巨瓣兜兰组培快繁方法，方法包括以下步骤(1)外植体的建立，(2)原球茎萌发阶段，(3)增殖培养阶段，(4)壮苗生根阶段和(5)练苗及移栽；当巨瓣兜兰试管苗长至3-4厘米时，移栽前在温室中自然光照下炼苗10天左右后，温室保持15-25℃的温度、70%以上的湿度、78-80%的遮阴并通风，巨瓣兜兰即可正常生长，种苗的移栽成活率可达93％以上；本发明的有益效果是通过巨瓣兜兰组培快繁方法，可大大提高种苗的繁殖系数，获得品相高度一致的种苗，便于大规模的工厂化种植；对兰科植物研究和开发，注意对选用品种具体属性研究，选用具体方法，这在珍稀植物的保护开发及可持续利用方面具有十分重要的意义。
文档编号A01H4/00GK102884980SQ20121034362
公开日2013年1月23日 申请日期2012年9月17日 优先权日2012年9月17日
发明者王莲辉, 姜运力, 潘德权, 冯育才, 李丛瑞 申请人:贵州省林业科学研究院