本发明属于植物细胞工程技术领域，涉及一种植物的繁殖方法，尤其是一种珠芽类魔芋组织培养快繁方法。
背景技术：
魔芋是天南星科（Araceae）魔芋属（Amorphophallus）多年生草本植物，是迄今发现的唯一能大量合成葡甘聚糖（konjac glucomannan,KGM）的植物种群，主要分布在亚洲和非洲的热带及亚热带地区，仅少数亚洲国家有栽培，中国、日本较普遍。它是我国西南地区重要的特色经济作物，已有两千多年的栽培和食用历史，其主要成分葡甘聚糖是优异的纯天然膳食纤维，具极高的经济价值，已在食品、保健品、医药、化工、石油、纺织等领域得到广泛应用，带动了一大批相关产业的发展，其开发利用已显现出经济效益高、社会效益明显、生态效益好的优势。随着市场需求急剧增加，魔芋种植业得到了迅猛发展，现已成为西南山区农民脱贫致富的一条重要途径。
珠芽类魔芋是一类繁殖方式独特的野生驯化魔芋种，因其地上植株会产生无性繁殖的“珠芽”小球茎而得名，这样就显著增加了珠芽魔芋的繁殖系数，是一种独特的魔芋种质资源，目前珠芽类魔芋品种：“红魔芋”在云南德宏州、西双版纳州及附近地区有大量种植。而金魔芋是在云南西双版纳州热带雨林中新发现的一个特有珠芽魔芋类品种，其葡甘聚糖含量远高于花魔芋、白魔芋及其它珠芽类魔芋品种如红魔芋等，具有很好的加工价值，并高抗魔芋软腐病和白绢病等魔芋生产中的主要病害，是不可多得的种质资源。
但目前在金魔芋栽培中还是存在用种量大，种球繁殖系数较低，且切块繁殖易于传播魔芋病害，种子量少、变异较低的缺点，随着魔芋产业的发展，十分迫切需要大量的优质魔芋种苗。虽然在实验室条件下，已经有通过组织培养繁殖珠芽魔芋（指红魔芋品种）的繁育方法，但尚未有对金魔芋品种组织快繁技术的相关研究。并且，上述方法存在对珠芽魔芋（红魔芋）快繁需要进行生根、炼苗、移栽等多步程序，并且存在获得珠芽魔芋种球的周期长，生长慢、不耐储藏和运输的问题。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术之不足，而提供一种珠芽类魔芋组织培养快繁方法。
为达到上述目的，本发明的技术方案是：一种关于珠芽魔芋组织培养的繁殖方法，包括无菌苗培养、胚状体诱导、种球诱导、种球成熟培养步骤：
1)无菌苗培养：将珠芽类魔芋植株的幼嫩叶片、叶柄以及丛生芽常规灭菌后，将叶片切成0.5-1.0cm2，叶柄切成0.8-1cm长，接种到常规灭菌的苗培养基上，在2000lux光下培养，11h/d，培养温度28±1℃，得到脱毒无菌苗；苗培养基组分及配比为：MS基本培养基+0.2mg/L NAA +0.5mg/L 6-BA+活性炭0-3.0g/L，蔗糖30g/L，琼脂6-8g/L，调pH至5.8-6.2；
2)胚状体诱导：将步骤1)获得的脱毒无菌苗，取叶片切成0.5-1.0cm2，叶柄切成0.8-1.0cm，接到常规灭菌的胚状体诱导培养基上，在2000lux光下培养，11h/d，培养温度28±1℃，获得珠芽类魔芋胚状体；胚状体诱导培养基组分及配比为：MS基本培养基+0.2mg/L NAA +0.5mg/L 6-BA +0.1mg/L IAA+0.1-0.2mg/L ABA+30g/L聚乙二醇，蔗糖30g/L，琼脂6-8g/L，调pH至5.8-6.2，或MS基本培养基+0.2mg/L NAA +0.5mg/L 6-BA，蔗糖30g/L，琼脂6-8g/L，调pH至5.8-6.2；
3)种球诱导：将未产生新芽之前的珠芽类魔芋胚状体，转移至常规灭菌的诱导培养基上，在2000lux光下培养，11h/d，培养温度28±1℃，得到珠芽类魔芋幼小种球；种球诱导培养基的组分及配比为：MS基本培养基+0.1mg/L NAA +3.0g/L活性炭+15g/L聚乙二醇，蔗糖30g/L，琼脂6-8g/L，调pH至5.8-6.2；
4)种球成熟培养：将步骤3)得到的珠芽类魔芋幼小种球转移至常规灭菌的种球成熟培养基上，在2000lux光下培养，11h/d，培养温度28±1℃，当珠芽类魔芋种球上端中间有芽点，直径大小为5mm以上，种球的外观颜色略带褐色时得到成熟分离的珠芽类魔芋种球；种球成熟培养基组分及其配比为：MS基本培养基+0.2mg/L NAA +0.5mg/L 6-BA +0.2-1.0mg/LABA或30-50g/L聚乙二醇，蔗糖30-50g/L，琼脂6-8g/L，调pH至5.8-6.2。
采用上述技术方案时，1.本发明的珠芽类魔芋人工种球培养至成熟仅需65-85天，生命力与抗逆性强，含水量降至65-78％时即耐贮藏，不需要经过特殊驯化就能直接用于播种，适合工厂规模化常年生产。
2.本发明的珠芽类魔芋人工种球单粒直径更大，发育更成熟，萌发率高达95％。
3.本发明的珠芽类魔芋有性繁殖系数高、繁殖周期短、品质不易退化、组培苗移栽程序简单、离体块茎不易感病、易萌发，为工厂化快速生产珠芽类魔芋种球提供了实用技术。
进一步改进，所述灭菌是在121-126℃下湿热蒸汽灭菌30min。蒸汽灭菌能够有效提高培养过程中的成活率和萌发率，有助于培养繁殖。
进一步改进，将成熟分离的珠芽类魔芋种球直接播种于基质上，所述基质为泥炭与珍珠岩按重量比2:1的比例配置，置于半阴生长环境条件，温度18～30℃，萌发成苗率达95％。
进一步改进，所述4)球成熟培养中，将培养基固定包裹在可降解的塑料袋中。通过包裹在塑料袋中，能够锁住营养物质，有助于培养。并且可降解的塑料袋提供一个相对封闭的环境，比较受到环境的影响。再者可降解的塑料袋降解能够自然进行，无需进行特殊的处理。
进一步改进，所述培养基放置在摇床上振荡培养。进行振荡培养能够模拟繁殖的环境，并且有助于整体的效果提升。
在MS基本培养基中，同时添加6-BA和PIC。加6-BA，PIC和水解酪蛋白，不需添加香其它复杂有机物，且不需光照节省了能源。之后将原培养基转到光下，原球茎就能发育生苗。
以MS基本培养基为基础，添加2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）3mg/L，6-苄基腺嘌呤（6-BA）2mg/L。
本发明通过组培技术，改变外植体的诱导发育、生长途径，通过添加相应的生长调节物质，引导生长发育途径由器官发生途径转向胚状体发生途径，直接通过离体培养获得大量成熟的珠芽魔芋（包括金魔芋和其它珠芽类魔芋品种，如红魔芋）种球，用于播种进一步生长膨大，来收获并提高珠芽魔芋产量。
具体实施方式
实施例1：
一种关于珠芽魔芋组织培养的繁殖方法，包括无菌苗培养、胚状体诱导、种球诱导、种球成熟培养步骤：
1)无菌苗培养：将珠芽类魔芋植株的幼嫩叶片、叶柄以及丛生芽常规灭菌后，将叶片切成0.5-1.0cm2，叶柄切成0.8-1cm长，接种到常规灭菌的苗培养基上，在2000lux光下培养，11h/d，培养温度28±1℃，得到脱毒无菌苗；苗培养基组分及配比为：MS基本培养基+0.2mg/L NAA +0.5mg/L 6-BA+活性炭0-3.0g/L，蔗糖30g/L，琼脂6-8g/L，调pH至5.8-6.2；
2)胚状体诱导：将步骤1)获得的脱毒无菌苗，取叶片切成0.5-1.0cm2，叶柄切成0.8-1.0cm，接到常规灭菌的胚状体诱导培养基上，在2000lux光下培养，11h/d，培养温度28±1℃，获得珠芽类魔芋胚状体；胚状体诱导培养基组分及配比为：MS基本培养基+0.2mg/L NAA +0.5mg/L 6-BA +0.1mg/L IAA+0.1-0.2mg/L ABA+30g/L聚乙二醇，蔗糖30g/L，琼脂6-8g/L，调pH至5.8-6.2，或MS基本培养基+0.2mg/L NAA +0.5mg/L 6-BA，蔗糖30g/L，琼脂6-8g/L，调pH至5.8-6.2；
3)种球诱导：将未产生新芽之前的珠芽类魔芋胚状体，转移至常规灭菌的诱导培养基上，在2000lux光下培养，11h/d，培养温度28±1℃，得到珠芽类魔芋幼小种球；种球诱导培养基的组分及配比为：MS基本培养基+0.1mg/L NAA +3.0g/L活性炭+15g/L聚乙二醇，蔗糖30g/L，琼脂6-8g/L，调pH至5.8-6.2；
4)种球成熟培养：将步骤3)得到的珠芽类魔芋幼小种球转移至常规灭菌的种球成熟培养基上，在2000lux光下培养，11h/d，培养温度28±1℃，当珠芽类魔芋种球上端中间有芽点，直径大小为5mm以上，种球的外观颜色略带褐色时得到成熟分离的珠芽类魔芋种球；种球成熟培养基组分及其配比为：MS基本培养基+0.2mg/L NAA +0.5mg/L 6-BA +0.2-1.0mg/LABA或30-50g/L聚乙二醇，蔗糖30-50g/L，琼脂6-8g/L，调pH至5.8-6.2。在球成熟培养中，将培养基固定包裹在可降解的塑料袋中。通过包裹在塑料袋中，能够锁住营养物质，有助于培养。并且可降解的塑料袋提供一个相对封闭的环境，比较受到环境的影响。再者可降解的塑料袋降解能够自然进行，无需进行特殊的处理。
灭菌是在121-126℃下湿热蒸汽灭菌30min。蒸汽灭菌能够有效提高培养过程中的成活率和萌发率，有助于培养繁殖。
将成熟分离的珠芽类魔芋种球直接播种于基质上，所述基质为泥炭与珍珠岩按重量比2:1的比例配置，置于半阴生长环境条件，温度18～30℃，萌发成苗率达95％。
1.本发明的珠芽类魔芋人工种球培养至成熟仅需65-85天，生命力与抗逆性强，含水量降至65-78％时即耐贮藏，不需要经过特殊驯化就能直接用于播种，适合工厂规模化常年生产。
2.本发明的珠芽类魔芋人工种球单粒直径更大，发育更成熟，萌发率高达95％。
3.本发明的珠芽类魔芋有性繁殖系数高、繁殖周期短、品质不易退化、组培苗移栽程序简单、离体块茎不易感病、易萌发，为工厂化快速生产珠芽类魔芋种球提供了实用技术。
培养基放置在摇床上振荡培养。进行振荡培养能够模拟繁殖的环境，并且有助于整体的效果提升。
实施例2：
一种关于珠芽魔芋组织培养的繁殖方法，包括无菌苗培养、胚状体诱导、种球诱导、种球成熟培养步骤：
1)无菌苗培养：将珠芽类魔芋植株的幼嫩叶片、叶柄以及丛生芽常规灭菌后，将叶片切成0.5-1.0cm2，叶柄切成0.8-1cm长，接种到常规灭菌的苗培养基上，在2000lux光下培养，11h/d，培养温度28±1℃，得到脱毒无菌苗；苗培养基组分及配比为：MS基本培养基+0.2mg/L NAA +0.5mg/L 6-BA+活性炭0-3.0g/L，蔗糖30g/L，琼脂6-8g/L，调pH至5.8-6.2；
2)胚状体诱导：将步骤1)获得的脱毒无菌苗，取叶片切成0.5-1.0cm2，叶柄切成0.8-1.0cm，接到常规灭菌的胚状体诱导培养基上，在2000lux光下培养，11h/d，培养温度28±1℃，获得珠芽类魔芋胚状体；胚状体诱导培养基组分及配比为：MS基本培养基+0.2mg/L NAA +0.5mg/L 6-BA +0.1mg/L IAA+0.1-0.2mg/L ABA+30g/L聚乙二醇，蔗糖30g/L，琼脂6-8g/L，调pH至5.8-6.2，或MS基本培养基+0.2mg/L NAA +0.5mg/L 6-BA，蔗糖30g/L，琼脂6-8g/L，调pH至5.8-6.2；
3)种球诱导：将未产生新芽之前的珠芽类魔芋胚状体，转移至常规灭菌的诱导培养基上，在2000lux光下培养，11h/d，培养温度28±1℃，得到珠芽类魔芋幼小种球；种球诱导培养基的组分及配比为：MS基本培养基+0.1mg/L NAA +3.0g/L活性炭+15g/L聚乙二醇，蔗糖30g/L，琼脂6-8g/L，调pH至5.8-6.2；
4)种球成熟培养：将步骤3)得到的珠芽类魔芋幼小种球转移至常规灭菌的种球成熟培养基上，在2000lux光下培养，11h/d，培养温度28±1℃，当珠芽类魔芋种球上端中间有芽点，直径大小为5mm以上，种球的外观颜色略带褐色时得到成熟分离的珠芽类魔芋种球；种球成熟培养基组分及其配比为：MS基本培养基+0.2mg/L NAA +0.5mg/L 6-BA +0.2-1.0mg/LABA或30-50g/L聚乙二醇，蔗糖30-50g/L，琼脂6-8g/L，调pH至5.8-6.2。在球成熟培养中，将培养基固定包裹在可降解的塑料袋中。通过包裹在塑料袋中，能够锁住营养物质，有助于培养。并且可降解的塑料袋提供一个相对封闭的环境，比较受到环境的影响。再者可降解的塑料袋降解能够自然进行，无需进行特殊的处理。
灭菌是在121-126℃下湿热蒸汽灭菌30min。蒸汽灭菌能够有效提高培养过程中的成活率和萌发率，有助于培养繁殖。
将成熟分离的珠芽类魔芋种球直接播种于基质上，所述基质为泥炭与珍珠岩按重量比2:1的比例配置，置于半阴生长环境条件，温度18～30℃，萌发成苗率达95％。
在MS基本培养基中，同时添加6-BA和PIC。加6-BA，PIC和水解酪蛋白，不需添加香其它复杂有机物，且不需光照节省了能源。之后将原培养基转到光下，原球茎就能发育生苗。
1.本发明的珠芽类魔芋人工种球培养至成熟仅需65-85天，生命力与抗逆性强，含水量降至65-78％时即耐贮藏，不需要经过特殊驯化就能直接用于播种，适合工厂规模化常年生产。
2.本发明的珠芽类魔芋人工种球单粒直径更大，发育更成熟，萌发率高达95％。
3.本发明的珠芽类魔芋有性繁殖系数高、繁殖周期短、品质不易退化、组培苗移栽程序简单、离体块茎不易感病、易萌发，为工厂化快速生产珠芽类魔芋种球提供了实用技术。
培养基放置在摇床上振荡培养。进行振荡培养能够模拟繁殖的环境，并且有助于整体的效果提升。
实施例3：
一种关于珠芽魔芋组织培养的繁殖方法，包括无菌苗培养、胚状体诱导、种球诱导、种球成熟培养步骤：
1)无菌苗培养：将珠芽类魔芋植株的幼嫩叶片、叶柄以及丛生芽常规灭菌后，将叶片切成0.5-1.0cm2，叶柄切成0.8-1cm长，接种到常规灭菌的苗培养基上，在2000lux光下培养，11h/d，培养温度28±1℃，得到脱毒无菌苗；苗培养基组分及配比为：MS基本培养基+0.2mg/L NAA +0.5mg/L 6-BA+活性炭0-3.0g/L，蔗糖30g/L，琼脂6-8g/L，调pH至5.8-6.2；
2)胚状体诱导：将步骤1)获得的脱毒无菌苗，取叶片切成0.5-1.0cm2，叶柄切成0.8-1.0cm，接到常规灭菌的胚状体诱导培养基上，在2000lux光下培养，11h/d，培养温度28±1℃，获得珠芽类魔芋胚状体；胚状体诱导培养基组分及配比为：MS基本培养基+0.2mg/L NAA +0.5mg/L 6-BA +0.1mg/L IAA+0.1-0.2mg/L ABA+30g/L聚乙二醇，蔗糖30g/L，琼脂6-8g/L，调pH至5.8-6.2，或MS基本培养基+0.2mg/L NAA +0.5mg/L 6-BA，蔗糖30g/L，琼脂6-8g/L，调pH至5.8-6.2；
3)种球诱导：将未产生新芽之前的珠芽类魔芋胚状体，转移至常规灭菌的诱导培养基上，在2000lux光下培养，11h/d，培养温度28±1℃，得到珠芽类魔芋幼小种球；种球诱导培养基的组分及配比为：MS基本培养基+0.1mg/L NAA +3.0g/L活性炭+15g/L聚乙二醇，蔗糖30g/L，琼脂6-8g/L，调pH至5.8-6.2；
4)种球成熟培养：将步骤3)得到的珠芽类魔芋幼小种球转移至常规灭菌的种球成熟培养基上，在2000lux光下培养，11h/d，培养温度28±1℃，当珠芽类魔芋种球上端中间有芽点，直径大小为5mm以上，种球的外观颜色略带褐色时得到成熟分离的珠芽类魔芋种球；种球成熟培养基组分及其配比为：MS基本培养基+0.2mg/L NAA +0.5mg/L 6-BA +0.2-1.0mg/LABA或30-50g/L聚乙二醇，蔗糖30-50g/L，琼脂6-8g/L，调pH至5.8-6.2。在球成熟培养中，将培养基固定包裹在可降解的塑料袋中。通过包裹在塑料袋中，能够锁住营养物质，有助于培养。并且可降解的塑料袋提供一个相对封闭的环境，比较受到环境的影响。再者可降解的塑料袋降解能够自然进行，无需进行特殊的处理。
灭菌是在121-126℃下湿热蒸汽灭菌30min。蒸汽灭菌能够有效提高培养过程中的成活率和萌发率，有助于培养繁殖。
将成熟分离的珠芽类魔芋种球直接播种于基质上，所述基质为泥炭与珍珠岩按重量比2:1的比例配置，置于半阴生长环境条件，温度18～30℃，萌发成苗率达95％。
以MS基本培养基为基础，添加2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）3mg/L，6-苄基腺嘌呤（6-BA）2mg/L。
1.本发明的珠芽类魔芋人工种球培养至成熟仅需65-85天，生命力与抗逆性强，含水量降至65-78％时即耐贮藏，不需要经过特殊驯化就能直接用于播种，适合工厂规模化常年生产。
2.本发明的珠芽类魔芋人工种球单粒直径更大，发育更成熟，萌发率高达95％。
3.本发明的珠芽类魔芋有性繁殖系数高、繁殖周期短、品质不易退化、组培苗移栽程序简单、离体块茎不易感病、易萌发，为工厂化快速生产珠芽类魔芋种球提供了实用技术。
培养基放置在摇床上振荡培养。进行振荡培养能够模拟繁殖的环境，并且有助于整体的效果提升。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本发明所省略描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。