一种芥菜型油菜的组织培养快速育苗方法与流程

本发明涉及一种芥菜型油菜组织培养与快速育苗的方法,属于植物组织培养快速繁殖技术领域。

技术背景

油菜是世界的重要油料作物之一,包括白菜型油菜(基因组AA)、芥菜型油菜(基因组AABB)和甘蓝型油菜(基因组AACC)三个栽培种。植物组织培养技术至今已经有100余年的历史，且技术日趋成熟和完善，在农作物的遗传改良中发挥了重要的作用。随着当分子生物学的发展，油菜的组织培养技术已经越来越广泛的应用到生产和研究工作当中。例如，油菜遗传育种中通过组织培养进行单倍体育种和快速繁育；基因功能验研究中通过组织培养获得遗传转化阳性植株等。在油菜组织培养过程中，茎、花序轴、带柄子叶，下胚轴、叶片和小孢子等等，都可以作为外植体进行离体诱导获得再生植株。但是在具体的实施过程中发现在不同基因型品种、不同类型的油菜外植体的分化效率差异非常大，获得再生苗技术体系的重复性差。目前芥菜型油菜的组织培养过程中,由于不同基因型品种、外植体类型以及组织培养体系中各种激素比例的影响，获得再生苗的效率差异仍然非常大。并没有一个成熟可靠的芥菜型油菜组织培养技术体系来获得大量的芥菜型油菜植株再生苗。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种芥菜型油菜的组织培养快速育苗方法，以解决现在生产中存在的上述问题，本发明所提供的方法操作简便，能获得大量性状优良的植株，其投入少，成苗快速，种苗壮，为深入进行油菜的遗传转化和性状改良提供研究平台。

为了实现上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种芥菜型油菜的组织培养快速育苗方法，包括：

(1)无菌外植体的获取：选择芥菜型油菜成实饱满的种子，在超净工作台上灭菌，将灭菌后的种子播种到种子萌发培养基，然后将伸长的下胚轴在无菌的条件下切成7mm-12mm的小段外植体；；

所述的种子萌发培养基包括：MS培养基+琼脂粉6.0～8.0g/L，pH值为5.8～6.0；播种后，暗培养。

优选的，种子的灭菌是用75％酒精浸泡处理3min后，放入无菌水中冲洗1min，然后放入0.1％升汞中浸泡10min后，无菌水冲洗6-7次；

(2)诱导外植体脱分化形成愈伤组织：在无菌的条件下，将切好的外植体放入愈伤诱导培养基中，诱导外植体形成愈伤组织；

愈伤诱导培养基的配方包括：MS培养基+蔗糖28～32g/L+甘露醇16～20g/L+2,4-D0.8～1.2mg/L+Kinetin 0.25～0.35mg/L+琼脂粉6g/L，pH值为5.8～6.0。

(3)诱导愈伤组织再分化形成不定芽点：在无菌的条件下，将步骤(2)中所获得的愈伤组织插入不定芽点诱导培养基中，诱导形愈伤组织形成不定芽点；

不定芽点诱导培养基的配方包括：MS培养基+蔗糖28～32g/L+TDZ1.2～1.8g/L+NAA0.08～1.2g/L+硝酸银4.8～5.2mg/L+琼脂粉7.0～7.4g/L，pH值为5.8～6.0；

(4)不定芽的生长培养：在无菌条件下，将步骤(3)中获得的带有不定芽点的愈伤组织转移到不定芽生长培养基中，进行不定芽的生长培养；

不定芽生长培养基的配方包括：MS培养基+葡萄糖8.0～12g/L+木糖0.23～0.27g/L+MES 0.5～0.7g/L+反式-Zeatin 1.8～2.2mg/L+IAA 0.08～0.12mg/L+琼脂粉5.8～6.2g/L，pH值为5.8～6.0；

(5)生根培养：在无菌条件下，将步骤(4)获得的不定芽切割成单株，接种到生根培养基上进行生根培养；

生根培养基的配方包括：MS培养基+蔗糖8～12g/L+琼脂粉8～12g/L，pH值为5.8～6.0；

(6)增殖培养：接种到生根培养基上的不定芽长成具有多个侧枝生长点的完整植株，将该植株切成2-3段带有侧枝生长点的茎段后，接种到增值培养基中进行增值培养，扩繁植株；两周继代一次。

所述的增殖培养基的配方与生根培养基相同；

以上所述方法，步骤(2)-(6)的培养温度为20～24℃，光照度2000-2500lx，光照15～18小时/天。

(7)小苗炼苗移栽：将步骤(6)中获得的已生根的小苗进行炼苗，然后按常规技术移栽到大田或温室里。

已公开的所有芥菜型油菜品系均能用上述方法进行育苗。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

(1)本发明利用油菜的下胚轴作为外植体，可以在使用较少种子的情况下获得大量的优良植株。

(2)本发明使用不定芽诱导培养基来诱导不定芽点的形成，大大提高了愈伤组织再分化的效率，愈伤组织的分化率达到35％以上。

(3)本发明使用不定芽生长培养基来培养已诱导经形成的不定芽点生长成为正常的不定芽，这大大提高了含有生长点的不定芽的生长效率。

(4)本发明操作简便，具有投入少，产出高的特点。繁殖周期短，获得的苗子壮，根系较多，移栽成活率高达98％以上。

(5)一个长1cm的下胚轴小段经过2周的培养，能行成一块面积为0.3cm²的愈伤组织，经过2周的培养，可以形成1-3个不定芽点，再经3-4周的培养，每个不定芽丛可获得一个以上可以转移到生根培养基中的不定芽。不定芽在生根培养基中培养两周后，可获得2-3段带有侧枝生长点的茎段，接种到生根培养基中进行生根培养。经过4-5周的生根培养，可获得2-3颗已生根的小苗，增殖倍数为2-3倍，一年一个不定芽可繁殖数千万棵以上幼苗。以一个芽14d继代一次，每次的增殖倍数为3计算。

附图说明

图1为外植体脱分化为愈伤组织。

图2为诱导愈伤组织分化为不定芽点(箭头所示为不定芽点)。

图3为在不定芽生长培养基上培养两周后不定芽点的生长状况。

图4生根培养基中小苗生长状况。

图5为瓶底观察生根情况。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术。所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

芥菜型油菜品系J248(Xu et al.2014)的组织培养快速育苗方法：

(1)外植体的获得：选择芥菜型油菜品系J248成实饱满的种子，在超净工作台上用75％酒精浸泡3min后，放入无菌水中冲洗1min。然后放入0.1％升汞中浸泡10min后，无菌水冲洗6-7次。将灭菌后的种子播种到种子萌发培养基，播种后，暗培养7d。然后将伸长的下胚轴在无菌的条件下切成1cm左右的小段外植体。

所述的种子萌发培养基为：MS培养基+7g/L琼脂粉，pH值为5.9。

(2)诱导外植体脱分化形成愈伤组织：在无菌的条件下，将切好的外植体放入愈伤诱导培养基中，12d后，99％以上的外植体开始形成愈伤组织。

所述的愈伤诱导培养基包括：MS培养基+30g/L蔗糖+18g/L甘露醇+1mg/L 2,4-D+0.3mg/L Kinetin+6g/L琼脂粉，pH值为5.9。

(3)诱导愈伤组织再分化形成不定芽点：切好的外植体放入愈伤诱导培养基14天后，在无菌的条件下，将获得的愈伤组织插入不定芽点诱导培养基中，10天后，44％的愈伤组织开始形成不定芽点。

所述的不定芽点诱导培养基包括：MS培养基+30g/L蔗糖+1.5g/L TDZ+0.1g/L NAA+5.0mg/L硝酸银+7g/L琼脂粉，pH值为5.9。

(4)不定芽的生长培养：在无菌条件下，将步骤(3)中获得的带有不定芽点的愈伤组织转移到不定芽生长培养基中，进行生长培养。还未生长出不定芽点的外植体，则继续放到不定芽点诱导培养基中进行诱导培养，待长出不定芽点后，转移到不定芽生长培养基中。

不定芽生长培养基包括：MS培养基+10g/L葡萄糖+0.25g/L木糖+0.6g/L MES+2.0mg/L反式-Zeatin+0.1mg/L IAA+6g/L琼脂粉，pH值为5.9。

(5)生根培养：在无菌条件下，将步骤(4)中获得的不定芽切割成单株，接种到生根培养基上进行30天的生根培养。生根率为100％。

所述生根培养基包括：MS培养基+10g/L蔗糖+10g/L琼脂粉，pH值为5.9。

(6)增殖培养：接接种到生根培养基上的不定芽长成具有多个侧枝生长点的完整植株，将该植株切成带有侧枝生长点的茎段后，接种到增值培养基中进行增值培养，扩繁植株；两周继代一次。

所述的增殖培养基的配方与生根培养基相同；

以上所述方法，步骤(2)-(6)的培养温度为22℃，光照度2200lx，光照16小时/天。

(7)小苗炼苗移栽：将步骤(6)中获得的已生根的50颗小苗进行炼苗，然后按常规技术移栽到温室里，小苗移栽的成活率在98％。在本实施例中，平均每个完整植株可切割成2-3个带有侧枝生长点的茎段。

实施例2：

芥菜型油菜品系J163-4(Xu et al.2014)的组织培养快速育苗方法：

(1)外植体的获得：选择芥菜型油菜成实饱满的种子，在超净工作台上用75％酒精清洗3min后，放入无菌水中冲洗1min。然后放入0.1％升汞中清洗10min后，无菌水冲洗6-7次。将灭菌后的种子播种到种子萌发培养基，播种后，暗培养7d。然后将伸长的下胚轴在无菌的条件下切成1-2cm的小段外植体。

所述的种子萌发培养基包括：MS培养基+7g/L琼脂粉，pH值为5.9。

(2)诱导外植体脱分化形成愈伤组织：在无菌的条件下，将切好的外植体放入愈伤诱导培养基中，12d后，99％以上的外植体开始形成愈伤组织。

所述的愈伤诱导培养基包括：MS培养基+30g/L蔗糖+18g/L甘露醇+1.0mg/L 2,4-D+0.3mg/L Kinetin+6g/L琼脂粉，pH值为5.9。

(3)诱导愈伤组织再分化形成不定芽点：切好的外植体放入愈伤诱导培养基14天后，在无菌的条件下，将获得的愈伤组织插入不定芽点诱导培养基中，10天后，36％的愈伤组织开始形成不定芽点。

所述的不定芽点诱导培养基包括：MS培养基+30g/L蔗糖+1.5g/L TDZ+0.1g/L NAA+5.0mg/L硝酸银+7.0g/L琼脂粉，pH值为5.9。

(4)不定芽的生长培养：在无菌条件下，将步骤(3)中获得的带有不定芽点的愈伤组织转移到不定芽生长培养基中，进行生长培养。还未生长出不定芽点的外植体，则继续放到不定芽点诱导培养基中进行诱导培养，待长出不定芽点后，转移到不定芽生长培养基中。

不定芽生长培养基包括：MS培养基+10g/L葡萄糖+0.25g/L木糖+0.6g/L MES+2.0mg/L反式-Zeatin+0.1mg/L IAA+6g/L琼脂粉，pH值为5.9。

(5)生根培养：在无菌条件下，将步骤(5)中获得的不定芽切割成单株，接种到生根培养基上进行32天的生根培养。生根率为100％。

所述生根培养基包括：MS培养基+10g/L蔗糖+10g/L琼脂粉，pH值为5.9。

(6)增殖培养：接种到生根培养基上的不定芽长成具有多个侧枝生长点的完整植株，将该植株切成2-3段带有侧枝生长点的茎段后，接种到增值培养基中进行增值培养，扩繁植株；两周继代一次。

所述的增殖培养基的配方与生根培养基相同；

以上所述方法，步骤(2)-(6)的培养温度为22℃，光照度2200lx，光照16小时/天。

(7)小苗炼苗移栽：将步骤(6)中获得的已生根的124颗小苗进行炼苗，然后按常规技术移栽到温室里，小苗移栽的成活率99％。