本发明涉及农业生物
技术领域：
，具体的是一种通过细胞工程的手段直接繁殖桃儿七试管小根茎的方法。
背景技术：
：桃儿七(SinopodophyllumhexandrumRoyle)是小檗科桃儿七属草本植物，国家三级保护植物，主要分布在我国西部。由于自然资源已面临匮乏与濒危，被收录入《中华珍稀濒危植物名录》和《中国植物红皮书》。桃儿七在民间主要用于痛疖肿毒、风湿性骨痛、气管炎等症，现代药学研究表明，其根及根茎中主要含有木脂素类、黄酮类、皂苷、多糖等成分，其中木脂素类的鬼臼毒素含量最高。鬼臼毒素具有广泛的药学活性，如0.5%鬼臼毒素酊在治疗尖锐湿疣方面具有起效快、治愈率高、安全性好等特点，1990年世界卫生组织推荐其为一线药物，1994年我国《国家基本药物》皮肤类抗病毒唯一入选药物。鬼臼毒素还是合成抗癌药物GP7、VP-16、VM-26、NK611等及抗艾滋病药物的前体物质。自然条件下，桃儿七以种子繁殖为主，种子休眠期长(6～8个月)，发芽后生长极为缓慢，5～6年才能完成性成熟，而且对生长环境的要求非常苛刻。为了缓解桃儿七资源危机，生产主要的活性成分鬼臼毒素，国内外学者利用愈伤组织培养、细胞悬浮培养进行鬼臼毒素的生产，但存在愈伤组织易褐化、增殖缓慢及鬼臼毒素含量低的问题；关于桃儿七离体胚培养、芽增殖培养、试管苗的炼苗移栽技术已有报道，虽然在一定程度上解决了资源的繁殖问题，但仍存在繁殖系数低、试管苗练苗操作繁琐、耗时长、生产成本高等问题。桃儿七在生长过程中，在叶柄基部与根上部区域能形成类似扁平球形的变态器官根茎，根茎作为一种宿生器官，具有不同发育时期的芽原基，能发芽、生根，并且方便运输、移栽，抗性强。在组培过程中，叶柄基部也有类似的小根茎形成。目前针对桃儿七的组培工作，尚没有通过小根茎进行繁殖的技术出现。技术实现要素：本发明的目的是针对以上技术问题，提供一种桃儿七试管小根茎繁殖方法。本方法繁殖系数高、成本低廉、能够有效提高从试管到大田的繁殖效率，对桃儿七资源保护及种苗生产具有重要意义。本发明的内容，是提供一种高效的桃儿七小根茎繁殖方法，包括以下步骤：（1）获取无菌种胚将新鲜采集的桃儿七种子，除去虫蛀和霉烂种子，清洗干净后水选，用少许浓硫酸表面消毒、腐蚀种皮，0.5%的碳酸钠室温浸泡20小时除去油质、蜡质等疏水成分，80mg/L的赤霉素（GA4+7）4℃浸泡28小时，0.2%的升汞表面消毒6分钟。用无菌水反复冲洗，用灭过菌的滤纸吸干种子表面水分，将种子切开，取带胚的半粒种子待用。作为优选，用灭过菌的尖嘴钳将种胚从种脐部的萌发孔中挤出待用。（2）丛生芽的诱导将上述种胚接种于丛生芽诱导培养基，在红蓝光比例（3:1），光照强度600-1200lux，光周期为14小时光照/10小时黑暗，相应的培养温度23/18℃，培养35天左右，至明显看到不定芽芽点，获得外植体。诱导培养基配方如下:MS基本培养液、蔗糖50g/L、酸水解酪蛋白1g/L、琼脂5g/L、吲哚乙酸（IAA）0.1-0.5mg/L、6-苄基腺嘌呤（6-BA）0.5mg/L、玉米素(ZT)0.5-2mg/L。作为优选，吲哚乙酸（IAA）浓度为0.3mg/L，玉米素(ZT)浓度为1.5mg/L。作为优选，诱导培养基中的玉米素(ZT)可用噻苯隆（TDZ）0.05-0.2mg/L替代。作为优选，噻苯隆（TDZ）浓度为0.1mg/L。（3）丛生芽的成熟与分割将上述外植体转接入继代培养基，在红蓝光比例（3:1），光照强度600-1200lux，光周期为14小时光照/10小时黑暗，相应的培养温度23/18℃，培养10-20天，至每外植体长出4-6个叶芽，以1-2个叶芽为分割单元进行分割。继代培养基配方如下:MS基本培养液、蔗糖50g/L、酸水解酪蛋白1g/L、琼脂5g/L、萘乙酸（NAA）0.6mg/L、噻苯隆（TDZ）0.01-0.06mg/L、脱落酸（ABA）0.5-2mg/L。作为优选，噻苯隆（TDZ）浓度为0.03mg/L、脱落酸浓度为（ABA）1mg/L。（4）幼苗的生长将分割后的叶芽转入幼苗生长培养基，在红蓝光比例（3:1），光照强度600-1200lux，光周期为14小时光照/10小时黑暗，相应的培养温度23/18℃，培养40天至幼苗长高、长壮，并且有根原基形成。幼苗生长培养基配方如下:MS基本培养液、蔗糖50g/L、酸水解酪蛋白1g/L、聚乙烯吡烙烷酮1g/L、琼脂5g/L、赤霉素(GA4+7)0.2mg/L、油菜素内酯（BR）0.01-0.1mg/L、激动素（KT）0.5-2mg/L。作为优选，油菜素内酯（BR）浓度为0.03mg/L、激动素（KT）浓度为1.5mg/L。（5）小根茎的形成将幼苗转入小根茎诱导培养基中，在26℃，黑暗条件下培养60天，待幼苗逐渐枯萎后收获小根茎。小根茎诱导培养基配方如下:MS基本培养液、蔗糖80g/L、酵母提取物1g/L、活性炭1g/L、琼脂5g/L、吲哚丁酸（IBA）0.5mg/L、烯效唑(S-3307)2-6mg/L、茉莉酸甲酯（MEJA）1-4mg/L、6-苄基腺嘌呤（6-BA）1.5mg/L。作为优选，小根茎诱导培养基中烯效唑浓度为(S-3307)4mg/L、茉莉酸甲酯（MEJA）浓度为2mg/L。作为优选，小根茎诱导培养基中6-苄基腺嘌呤（6-BA）可用氯吡苯脲(CPPU)0.5-3mg/L替代。作为优选，氯吡苯脲(CPPU)浓度为1mg/L。（6）小根茎的贮藏将小根茎清洗干净后，沙藏于4℃，两个月左右取出后，100mg/L赤霉素(GA4+7)浸泡1小时，晾干表面水分即可播种。本发明的有益效果是：将种胚从种皮中挤出的方式降低了切种造成的种子损失、种胚伤害、种胚褐化、保证了种胚的完整性，提高了种子的利用率，并且降低了胚乳中内生菌对培养过程的污染及胚乳中萌发抑制物对种胚萌发的抑制；小根茎繁殖方法的建立将桃儿七丛生芽的诱导和试管小根茎诱导相结合，此法诱导的试管小根茎可作为繁殖材料大田栽培，与传统的组培方法相比，此法具有繁殖效率高、繁殖系数大、培养周期短、方便栽培贮藏、方便运输、操作简便、成本低的优点，改进了桃儿七组培技术，为桃儿七的进一步扩大栽种提供了保障。具体实施方式下面的实施例可以进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制，在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。以下实验所使用的桃儿七种子，均采自兰州市兴隆山海拔2300米以上，经鉴定为桃儿七种子，均为新鲜种子。实施例1：无菌种胚的获得。将新鲜桃儿七种子，除去虫蛀和霉烂种子，水洗后用少许浓硫酸腐蚀种皮至颜色发黑，用0.5%的碳酸钠室温浸泡20小时除去油质、蜡质等疏水成分，80mg/L的赤霉素（GA4+7）4℃浸泡28小时，0.2%的升汞表面消毒6分钟。实验组将上述预处理的种子，用灭过菌的滤纸吸干种子表面水分，用灭过菌的尖嘴钳将种胚从种脐部的萌发孔中挤出，接种于MS培养基；对照组种子预处理方式与前述相同，仅去种胚采用如下方法：用解剖刀将种子切开，将带有胚的半粒种子接种于MS培养基。两组共同培养，观察萌发、污染、褐化情况。实验结果如下，实验组：种子的萌发率可以达到80%以上，没有发现褐化和污染现象，操作简单，种子损失少，操作速度快；对照组：种子的发芽率达到70%左右，操作过程中常发生种胚切断的问题，造成种子损失较为严重，培养过程中由于种胚的损伤及胚乳内生菌的问题造成一定程度的褐化和污染，胚乳中萌发抑制物的存在对发芽率也存在一定的抑制作用。实验结果表明，实验组所采用的方法，即将种胚从萌发孔中挤出的方法为优选方法。实施例2：不同激素对丛生芽诱导的影响。以种胚为外植体，在红蓝光比例（3:1），光照强度800lux，光周期为14小时光照/10小时黑暗，相应的培养温度23/18℃的条件下，接种于基础培养基（MS、蔗糖50g/L、琼脂5g/L、酸水解酪蛋白1000mg/L）并添加不同激素进行培养，不同激素的配比参见下表，培养基的pH值为6.5。激素6-BA（mg/L）IAA（mg/L）ZT（mg/L）实验结果1#0.50.1120天左右外植体明显膨大，诱导率92%2#0.50.3113天左右外植体明显膨大，诱导率92%，IAA最佳浓度3#0.50.5120天左右外植体明显膨大，诱导率92%4#0.50.30.513天左右外植体明显膨大，诱导率90%5#0.50.31.513天左右外植体明显膨大，诱导率96%，ZT最佳浓度6#0.50.3213天左右外植体明显膨大，诱导率94%，质地松散易碎上述处理都能诱导出丛生芽，随着IAA浓度0.1-0.5mg/L的变化，丛生芽的诱导时间不同，2#诱导速度最快，1#和3#诱导速度没有明显差异，2#为优选浓度。ZT能提高诱导率，随着ZT浓度0.5-2mg/L的变化，诱导率增加，但高浓度的ZT（6#）诱导的丛生芽，质地松散易碎，不宜进行后续操作步骤。5#为ZT优选浓度。通过以上实验，得到诱导培养基配方Ⅰ配方：MS基本培养液、蔗糖50g/L、酸水解酪蛋白1g/L、琼脂5g/L、吲哚乙酸（IAA）0.1-0.5mg/L、6-苄基腺嘌呤（6-BA）0.5mg/L、玉米素(ZT)0.5-2mg/L。优选诱导培养基配方Ⅰ配方：MS基本培养液、蔗糖50g/L、酸水解酪蛋白1g/L、琼脂5g/L、吲哚乙酸（IAA）0.3mg/L、6-苄基腺嘌呤（6-BA）0.5mg/L、玉米素(ZT)1.5mg/L。实验方法同上，改换不同的激素进行处理，得到如下结果：激素6-BA（mg/L）IAA（mg/L）TDZ（mg/L）实验结果1#0.50.10.1520天左右外植体明显膨大，诱导率96%2#0.50.30.1513天左右外植体明显膨大，诱导率96%，IAA最佳浓度3#0.50.50.1520天左右外植体明显膨大，诱导率96%4#0.50.30.0513天左右外植体明显膨大，诱导率91%，质地坚硬5#0.50.30.113天左右外植体明显膨大，诱导率98%，质地坚硬，TDZ最佳浓度6#0.50.30.213天左右外植体明显膨大，诱导率96%，有愈伤化趋势上述处理都能诱导出丛生芽，随着IAA浓度0.1-0.5mg/L的变化，丛生芽的诱导时间不同，2#诱导速度最快，1#和3#诱导速度没有明显差异，2#为优选浓度。TDZ能提高诱导率，随着TDZ浓度0.05-0.2的变化，诱导率增加，但高浓度的TDZ（6#）有诱导愈伤组织的趋势，不宜进行后续操作步骤，5#为TDZ优选浓度。通过以上实验，得到诱导培养基配方Ⅱ配方：MS基本培养液、蔗糖50g/L、酸水解酪蛋白1g/L、琼脂5g/L、吲哚乙酸（IAA）0.1-0.5mg/L、6-苄基腺嘌呤（6-BA）0.5mg/L、噻苯隆（TDZ）0.05-0.2mg/L。优选诱导培养基配方Ⅱ配方：MS基本培养液、蔗糖50g/L、酸水解酪蛋白1g/L、琼脂5g/L、吲哚乙酸（IAA）0.3mg/L、6-苄基腺嘌呤（6-BA）0.5mg/L、噻苯隆（TDZ）0.1mg/L。实施例3:光照对丛生芽诱导的影响。采用实施例2中确定的优选的诱导培养基对种胚进行培养，变换红蓝光比例及光照强度，其余培养条件不变，进行丛生芽诱导实验，结果如下：激素6-BA（mg/L）IAA（mg/L）ZT（mg/L）TDZ（mg/L）红蓝光比例光强（lux）实验结果1#0.50.31.503:1600培养后期有徒长现象2#0.50.31.503:1800培养后期生长健壮，叶色浓绿3#0.50.31.503:11000培养后期生长健壮，叶色浓绿4#0.50.31.503:11200培养后期外植体有干枯、发褐的氧化损伤迹象5#0.50.300.13:1600培养后期有徒长现象6#0.50.300.13:1800培养后期生长健壮，叶色浓绿7#0.50.300.13:11000培养后期生长健壮，叶色浓绿8#0.50.300.13:11200培养后期外植体有干枯、发褐的氧化损伤迹象9#0.50.31.501:1800培养后期外植体有干枯、发褐的氧化损伤迹象10#0.50.300.11:1800培养后期外植体有干枯、发褐的氧化损伤迹象在红蓝光比例（3:1）的光质条件下，随着光照强度的增加（600-1200lux），芽点更加浓绿、生长更加迅速、800lux和1000lux的效果最好，考虑到成本，800lux为最佳处理，随着光照度的继续增加，1200lux外植体有干枯、颜色发褐的趋势。在9#和10#红蓝光比例（1:1）的光质条件下，随着培养时间的延长，外植体干枯、颜色发黑、表现出氧化损伤的迹象。所以确定光照培养条件为红蓝光比例（3:1），光照强度800lux。实施例4：丛生芽的成熟与分割。上述已诱导丛生芽的外植体，在红蓝光比例（3:1），光照强度800lux，光周期为14小时光照/10小时黑暗，相应的培养温度23/18℃的条件下，接种于基础培养基（MS、蔗糖50g/L、琼脂5g/L、酸水解酪蛋白1000mg/L）并添加不同激素进行培养，不同激素的配比参见下表，培养基的pH值为6.5。明显看到叶芽后，以1-2个叶芽为分割单元进行分割。激素NAA（mg/L）TDZ（mg/L）ABA（mg/L）实验结果1#0.60.011.5丛生芽的继代和繁殖较慢，每外植体平均4个叶芽2#0.60.031.5丛生芽的继代和繁殖较快，每外植体平均5个叶芽，TDZ最佳浓度3#0.60.061.5丛生芽的继代和繁殖较快，每外植体平均6个叶芽，但畸形芽增加4#0.60.030.5丛生芽的继代和繁殖较快，每外植体平均5个叶芽，但有少量畸形芽5#0.60.031丛生芽的继代和繁殖最快，每外植体平均6个叶芽，并且畸形芽少，ABA最佳浓度6#0.60.032丛生芽的继代和繁殖较快，每外植体平均5个叶芽，畸形芽少，但褐化现象增加以上处理都能促进丛生芽的成熟，随着TDZ浓度的增加（0.01-0.06mg/L），丛生芽生长、繁殖加快，但高浓度的TDZ（0.06mg/L）畸形芽增多，综合考虑TDZ（0.03mg/L）为最佳浓度。随着ABA浓度的增加（0.5-2mg/L），可以促进芽的成熟、抑制畸形的发生，但高浓度（2mg/L），芽生长速度减慢，并且有褐化的趋势，综合考虑，ABA（1mg/L）为最佳处理。根据以上实验，得到继代培养基配方如下:MS基本培养液、蔗糖50g/L、酸水解酪蛋白1g/L、琼脂5g/L、萘乙酸（NAA）0.6mg/L、噻苯隆（TDZ）0.01-0.06mg/L、脱落酸（ABA）0.5-2mg/L。优选继代培养基配方：MS基本培养液、蔗糖50g/L、酸水解酪蛋白1g/L、琼脂5g/L、萘乙酸（NAA）0.6mg/L、噻苯隆（TDZ）0.03mg/L、脱落酸（ABA）1mg/L。实施例5：幼苗的生长。上述分割的外植体，在红蓝光比例（3:1），光照强度800lux，光周期为14小时光照/10小时黑暗，相应的培养温度23/18℃的条件下，接种于基础培养基（MS、蔗糖50g/L、琼脂5g/L、酸水解酪蛋白1000mg/L、聚乙烯吡烙烷酮1g/L）并添加不同激素进行培养，不同激素的配比参见下表，培养基的pH值为6.5。当幼苗的高度长到5cm左右，并且根长1cm左右时，转入小根茎诱导培养基。激素GA4+7（mg/L）BR（mg/L）KT（mg/L）实验结果1#0.20.011幼苗伸长速度较快，生根较好2#0.20.031幼苗伸长速度最快，生根较好，BR最佳浓度3#0.20.061幼苗伸长速度最快，生根较好，叶片、叶柄有增大、增粗的趋势4#0.20.11幼苗伸长速度较快，生根较好，叶片、叶柄有增大、增粗的趋势5#0.20.030.5幼苗伸长速度最快、叶色浓绿、新鲜，有促进生根迹象6#0.20.031.2幼苗伸长速度最快、叶色浓绿、新鲜，生根较好7#0.20.031.5幼苗伸长速度最快、叶色浓绿、新鲜，生根效果最好，KT最佳浓度8#0.20.032幼苗伸长速度最快、叶色浓绿、新鲜，生根效果最好上述处理都能促进幼苗的生长，随着BR浓度的增加（0.01-0.1mg/L），幼苗伸长速度表现出先增加后稍有降低的趋势，但随着浓度增加，叶片、叶柄有增大、增粗的趋势。BR（0.03mg/L）为最佳浓度。随着KT浓度的增加（0.5-2mg/L），幼苗叶色更加浓绿、新鲜，并且有促进生根的趋势，7#和8#处理没有明显差异，考虑到成本，KT（1.5mg/L）为最佳浓度。通过上述实验，得到幼苗生长培养基配方如下:MS基本培养液、蔗糖50g/L、酸水解酪蛋白1g/L、聚乙烯吡烙烷酮1g/L、琼脂5g/L、赤霉素(GA4+7)0.2mg/L、油菜素内酯（BR）0.01-0.1mg/L、激动素（KT）0.5-2mg/L。优选幼苗生长培养基配方如下：MS基本培养液、蔗糖50g/L、酸水解酪蛋白1g/L、聚乙烯吡烙烷酮1g/L、琼脂5g/L、赤霉素(GA4+7)0.2mg/L、油菜素内酯（BR）0.03mg/L、激动素（KT）1.5mg/L。实施例6：小根茎的诱导。上述幼苗，在26℃的黑暗条件下，接种于基础培养基（MS、蔗糖80g/L、琼脂5g/L、酵母提取物1000mg/L、活性炭1g/L）并添加不同激素进行培养，不同激素的配比参见下表，培养基的pH值为6.5。上述处理都能诱导小根茎的发生与膨大，随着MEJA浓度的增加（1-4mg/L），诱导速度和小根茎个数逐渐增高，但高浓度MEJA（4mg/L）褐化现象增多，2#和3#没有明显的差异，考虑到成本MEJA（2mg/L）为最佳浓度。随着S-3307浓度的增加（2-6mg/L），小根茎逐渐增大，但高浓度的S-3307（6mg/L）畸形现象增加，综合考虑，最佳S-3307浓度为4mg/L。通过以上实验，得到小根茎诱导培养基配方Ⅰ如下:MS基本培养液、蔗糖80g/L、酵母提取物1g/L、活性炭1g/L、琼脂5g/L、吲哚丁酸（IBA）0.5mg/L、烯效唑(S-3307)2-6mg/L、茉莉酸甲酯（MEJA）1-4mg/L、6-苄基腺嘌呤（6-BA）1.5mg/L。优选小根茎诱导培养基配方Ⅰ如下：S基本培养液、蔗糖80g/L、酵母提取物1g/L、活性炭1g/L、琼脂5g/L、吲哚丁酸（IBA）0.5mg/L、烯效唑(S-3307)4mg/L、茉莉酸甲酯（MEJA）2mg/L、6-苄基腺嘌呤（6-BA）1.5mg/L。实验方法同上，改换不同的激素进行处理，得到如下结果：上述处理都能诱导小根茎的发生与膨大，随着CPPU浓度的增加（0.5-3mg/L），小根茎的诱导效率和大小逐渐增加，但高浓度的CPPU（3mg/L）会增加小根茎畸形，2#和3#没有明显差异，考虑到成本，最佳CPPU浓度为1mg/L。通过以上实验，得到小根茎诱导培养基配方Ⅱ如下:MS基本培养液、蔗糖80g/L、酵母提取物1g/L、活性炭1g/L、琼脂5g/L、吲哚丁酸（IBA）0.5mg/L、烯效唑(S-3307)2-6mg/L、茉莉酸甲酯（MEJA）1-4mg/L、氯吡苯脲(CPPU)0.5-3mg/L。优选小根茎诱导培养基配方Ⅱ如下:MS基本培养液、蔗糖80g/L、酵母提取物1g/L、活性炭1g/L、琼脂5g/L、吲哚丁酸（IBA）0.5mg/L、烯效唑(S-3307)4mg/L、茉莉酸甲酯（MEJA）2mg/L、氯吡苯脲(CPPU)1mg/L。实施例7：小根茎的贮藏。上述小根茎倒苗后，除去残叶，清洗干净培养基，沙藏于4℃，两个月左右取出，100mg/L赤霉素(GA4+7)浸泡1小时，晾干表面水分即可播种。沙藏中有部分小根茎腐烂，正常的小根茎播种于草炭土：珍珠岩：蛭石（3：1：1）的混合基质，在18℃条件下培养，40天左右长出幼苗。当前第1页1 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