本发明涉及牛大力悬浮细胞培养技术领域。更具体地说，本发明涉及一种牛大力悬浮细胞培养的快速繁殖方法。
背景技术：
牛大力为豆科崖豆藤属植物美丽崖豆藤(Millettia speciosa Champ.)，又名大力薯、山莲藕，始载于《生草药性备要》，是《广西中药材标准》(1990年版)收载的地方药材。牛大力以根入药，味甘，平。归肺、肾经。具有补虚润肺、强筋活络的功效，临床证明其对腰肌劳损、风湿性关节炎、肺虚咳嗽、肺结核、慢性支气管炎、慢性肝炎等慢性疾病有较好的疗效。壮族民间常用于腰腿痛，发旺(风湿骨痛)，肺结核，慢性肝炎，慢性胃炎的治疗。
现代研究发现，牛大力含有多糖、生物碱、香豆素和多种微量元素等成分，其中牛大力多糖是其主要活性成分，具有调节免疫系统、抗氧化、抗炎、抗肿瘤活性，尤其是抗肿瘤方面疗效明确，目前临床研究显示其对鼻咽癌、卵巢癌、肺癌、以及结肠癌具有良好的治疗效果。同时牛大力多糖也是理想的免疫增强剂；生物碱和香豆素具有保肝、祛痰、镇咳、镇痛、镇静、解痉的作用，且对正常细胞均没有毒副作用，在开发抗肿瘤、抗病毒、抗衰老等药物方面有着特殊的优势，已成为提取企业竞相开发的新目标，市场需求量巨大。自20世纪70年代起，作为主要原料被制药企业加工成壮腰健肾丸、强力健身胶囊、桂龙药膏、活络止痛丸、强力追风透骨丸、舒筋健腰丸、益智康脑丸、抗风湿液等中成药，在全国广泛应用。近年来，牛大力又成为提取企业竞相开发的新目标，提取多糖、高丽槐素等成分。
随着牛大力需求量的不断增加，野生资源已经枯竭，原材料严重供不应求。为了解决供需矛盾，人们尝试采用人工栽培的方法扩大药源，目前已发现有一些成功的研究报道，但仍存在着许多问题制约其规模化生产，具体表现在种子苗不结薯或薯块产量很不稳定，扦插苗成活率低，组培苗生根非常困难等方面。而且牛大力生长周期长(一般5年才形成产量)，以常规方法育种或育苗，需要花费很长时间，因繁殖系数小、耗种量大，导致发展速度很慢且生产成本增加，并且因病虫害危害严重导致退化，严重影响了产量和品质。于是，如何利用高新技术研究获得大量牛大力多糖等有效成分满足临床所需，并实现资源的可持续利用已迫在眉睫。我们针对牛大力开发后出现的资源可持续发展问题，在成功突破牛大力组培快繁技术的基础上开展牛大力悬浮细胞培养体系的研究，以期探索出利用牛大力悬浮细胞直接生产有效成分的新途径，有利于牛大力有效成分的开发和利用，同时为牛大力进一步利用体细胞杂交、遗传转化和突变体诱导等生物技术方法创造新的种质资源提供了新的途径和方法。
技术实现要素：
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种牛大力悬浮细胞培养的快速繁殖方法，可以得到质量好、增殖产量高的稳定的牛大力悬浮细胞，为牛大力有效成分的开发和利用，以及为牛大力进一步利用体细胞杂交、遗传转化和突变体诱导等生物技术方法创造新的种质资源提供了新的途径和方法。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种牛大力悬浮细胞培养的快速繁殖方法，以开花后50～60天的牛大力果荚中取出的幼嫩子叶为培养材料，经诱导培养和继代培养获得继代愈伤组织，再经悬浮细胞培养获得稳定的牛大力悬浮细胞培养液。
优选的是，所述的牛大力悬浮细胞培养的快速繁殖方法，培养材料的获得方法如下：选取开花后50～60天的牛大力果荚，在超净工作台上用棉花蘸取体积浓度为75％乙醇擦拭果荚，对果荚进行表面灭菌，然后小心剥开果荚，用灭菌的镊子夹取果荚里面的未成熟种子，置于无菌碟子或无菌滤纸上，再用无菌解剖刀切开种皮，用无菌镊子夹取子叶即得培养材料。
优选的是，所述的牛大力悬浮细胞培养的快速繁殖方法，所述诱导培养的方法如下：将培养材料接种至诱导培养基上于黑暗条件、24-28℃下诱导培养20-30天得到诱导愈伤组织；
所述诱导培养基的配方为：MS+20mg/L 2,4-D+0.5mg/L KT+0.5mg/L TDZ+0.2mg/L NAA+300mg/L PVP+500mg/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+5g/L琼脂。
优选的是，所述的牛大力悬浮细胞培养的快速繁殖方法，所述继代培养的方法如下：将诱导愈伤组织转接至增殖培养基上于黑暗条件下进行继代培养2-4次，至获得继代愈伤组织，每次继代培养的时间为7-10天，培养温度为24-28℃；
所述增殖培养基的配方为：MS+1.0mg/L TDZ+0.5mg/L KT+0.2mg/L NAA+300mg/L PVP+200mg/L芦荟汁+30g/L蔗糖+5g/L琼脂。
优选的是，所述的牛大力悬浮细胞培养的快速繁殖方法，所述悬浮细胞培养的方法如下：将2-5g继代愈伤组织接种至含有100-150ml液体培养基的三角瓶中，将三角瓶置于转动频率为90-100r/min、温度为28℃的恒温摇床上进行悬浮细胞培养，每10-15天转接培养一次，转接培养3-6次后，得到稳定的牛大力悬浮细胞培养液；
所述转接培养即将三角瓶中的悬浮液用灭菌后的150目尼龙网过滤，将滤液转接至含有100-150ml新的液体培养基的三角瓶中置于恒温摇床上继续培养；
所述液体培养基为MS培养基调整得到，其将MS培养基中的硝酸铵、硝酸钾、无水氯化钙、七水硫酸镁和四水硫酸锰的含量调整为硝酸铵300～500mg/L、硝酸钾2000～2500mg/L、无水氯化钙50～80mg/L、七水硫酸镁400～500mg/L、四水硫酸锰10～25mg/L，将磷酸二氢钾更换为磷酸氢二钠150～200mg/L，其余组分不变，然后再添加2,4-D 1～5mg/L、KT0.5～0.75mg/L、TDZ 0.5～1mg/L、NAA 0.2～0.5mg/L、PVP200～300mg/L、葡萄糖25～30g/L、椰子汁100～150mg/L、茉莉酸甲酯10～200μmol/L，pH 5.8。
优选的是，所述的牛大力悬浮细胞培养的快速繁殖方法，将得到的稳定的牛大力悬浮细胞培养液取2ml置于100-150ml新的液体培养基中培养10-15天进行扩繁培养，获得增殖后的悬浮细胞培养液。
优选的是，所述的牛大力悬浮细胞培养的快速繁殖方法，所述液体培养基中茉莉酸甲酯的浓度为80-100μmol/L。
优选的是，所述的牛大力悬浮细胞培养的快速繁殖方法，培养材料经诱导培养之前，先经过如下前处理：将培养材料采用经剪裁的玉米苞叶全包覆，并用细线固定，将玉米苞叶连同培养材料一起采用灭菌过的针扎2-4个孔，再将其置入装有前处理溶液的玻璃容器中，置于200-300高斯磁场中磁化处理2h，且在磁化处理的同时，播放轻音乐，且每播放30min之后暂停10min，播放音量控制在30-90db之间，磁化处理之后取出培养材料，用厨房纸擦干备用；
所述前处理溶液以磁化水为溶剂，配方为：0.5mg/L纳米氧化锌+0.1mg/L油菜素内酯+5g/L奶粉+1.5g/Lβ-葡聚糖+10mg/L生姜提取物。
本发明至少包括以下有益效果：
1)本发明提供的整套方法操作简便，生产成本低，增殖速度快，增值率高；
2)本发明通过以开花后50～60天的牛大力果荚中幼嫩子叶为培养材料，经特定的诱导培养和继代培养，得到浅绿色、颗粒状、外观湿润、质地疏松的继代愈伤组织，以进一步悬浮培养得到稳定的牛大力悬浮细胞液；
3)本发明通过在诱导培养之前对培养材料进行前处理，通过刺伤、特定的前处理溶液浸泡(纳米氧化锌具有抗菌抑菌的作用，与奶粉、β-葡聚糖一起在对牛大力培养材料表面形成一层膜，促进油菜素内酯和生姜提取物对牛大力培养材料的定向诱导)，并在磁化处理和轻音乐诱导的协同作用下，以进一步得到质量更好、产量多的愈伤组织，从而间接提高悬浮细胞的质量和产量。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：
一种牛大力悬浮细胞培养的快速繁殖方法，以开花后50～60天的牛大力果荚中取出的幼嫩子叶为培养材料，经诱导培养和继代培养获得继代愈伤组织，再经悬浮细胞培养获得稳定的牛大力悬浮细胞培养液。
其中，培养材料的获得方法如下：选取开花后50～60天的牛大力果荚，在超净工作台上用棉花蘸取体积浓度为75％乙醇擦拭果荚，对果荚进行表面灭菌，然后小心剥开果荚，用灭菌的镊子夹取果荚里面的未成熟种子，置于无菌碟子或无菌滤纸上，再用无菌解剖刀切开种皮，用无菌镊子夹取子叶即得培养材料。
其中，所述诱导培养的方法如下：将培养材料接种至诱导培养基上于黑暗条件、24℃下诱导培养20天得到诱导愈伤组织；
所述诱导培养基的配方为：MS+20mg/L 2,4-D+0.5mg/L KT+0.5mg/L TDZ+0.2mg/L NAA+300mg/L PVP+500mg/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+5g/L琼脂。
其中，所述继代培养的方法如下：将诱导愈伤组织转接至增殖培养基上于黑暗条件下进行继代培养2次，至获得继代愈伤组织，每次继代培养的时间为7天，培养温度为24℃，所得继代愈伤组织为浅绿色、颗粒状、外观湿润、质地疏松，能满足悬浮细胞培养的需要；
所述增殖培养基的配方为：MS+1.0mg/L TDZ+0.5mg/L KT+0.2mg/L NAA+300mg/L PVP+200mg/L芦荟汁+30g/L蔗糖+5g/L琼脂。
其中，所述悬浮细胞培养的方法如下：将2g继代愈伤组织接种至含有100ml液体培养基的三角瓶中，将三角瓶置于转动频率为90r/min、温度为28℃的恒温摇床上进行悬浮细胞培养，每10天转接培养一次，转接培养3次后，得到稳定的牛大力悬浮细胞培养液；
所述转接培养即将三角瓶中的悬浮液用灭菌后的150目尼龙网过滤，将滤液转接至含有100ml新的液体培养基的三角瓶中置于恒温摇床上继续培养；
所述液体培养基为MS培养基调整得到，其将MS培养基中的硝酸铵、硝酸钾、无水氯化钙、七水硫酸镁和四水硫酸锰的含量调整为硝酸铵300mg/L、硝酸钾2000mg/L、无水氯化钙50mg/L、七水硫酸镁400mg/L、四水硫酸锰10mg/L，将磷酸二氢钾更换为磷酸氢二钠150mg/L，其余组分不变，然后再添加2,4-D 1mg/L、KT0.5mg/L、TDZ 0.5mg/L、NAA 0.2mg/L、PVP200mg/L、葡萄糖25g/L、椰子汁100mg/L、茉莉酸甲酯10μmol/L，pH 5.8。MS培养基为常规培养常用的MS基本培养基，除了硝酸铵、硝酸钾、无水氯化钙、七水硫酸镁和四水硫酸锰的含量调整，以及将磷酸二氢钾的170mg/L浓度更换为磷酸氢二钠150mg/L，以及额外增加的2,4-D 1mg/L、KT0.5mg/L、TDZ 0.5mg/L、NAA 0.2mg/L、PVP200mg/L、葡萄糖25g/L、椰子汁100mg/L、茉莉酸甲酯10μmol/L的成分外，其他均与MS基本培养基中的成分以及组成相同。
本发明中诱导愈伤组织与继代愈伤组织的命名是为了区分分别从诱导培养得到的愈伤组织和继代培养得到的愈伤组织，继代培养过程是对诱导得到的愈伤组织不仅仅是扩繁增殖，更重要的是进一步筛选出适合于悬浮细胞培养的愈伤组织的过程。
实施例2：
一种牛大力悬浮细胞培养的快速繁殖方法，以开花后50～60天的牛大力果荚中取出的幼嫩子叶为培养材料，经诱导培养和继代培养获得继代愈伤组织，再经悬浮细胞培养获得稳定的牛大力悬浮细胞培养液。
其中，培养材料的获得方法如下：选取开花后50～60天的牛大力果荚，在超净工作台上用棉花蘸取体积浓度为75％乙醇擦拭果荚，对果荚进行表面灭菌，然后小心剥开果荚，用灭菌的镊子夹取果荚里面的未成熟种子，置于无菌碟子或无菌滤纸上，再用无菌解剖刀切开种皮，用无菌镊子夹取子叶即得培养材料。
其中，所述诱导培养的方法如下：将培养材料接种至诱导培养基上于黑暗条件、28℃下诱导培养30天得到诱导愈伤组织；
所述诱导培养基的配方为：MS+20mg/L 2,4-D+0.5mg/L KT+0.5mg/L TDZ+0.2mg/L NAA+300mg/L PVP+500mg/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+5g/L琼脂。
其中，所述继代培养的方法如下：将诱导愈伤组织转接至增殖培养基上于黑暗条件下进行继代培养4次，至获得继代愈伤组织，每次继代培养的时间为10天，培养温度为28℃，所得继代愈伤组织为浅绿色、颗粒状、外观湿润、质地疏松，能满足悬浮细胞培养的需要；
所述增殖培养基的配方为：MS+1.0mg/L TDZ+0.5mg/L KT+0.2mg/L NAA+300mg/L PVP+200mg/L芦荟汁+30g/L蔗糖+5g/L琼脂。
其中，所述悬浮细胞培养的方法如下：将5g继代愈伤组织接种至含有150ml液体培养基的三角瓶中，将三角瓶置于转动频率为100r/min、温度为28℃的恒温摇床上进行悬浮细胞培养，每15天转接培养一次，转接培养6次后，得到稳定的牛大力悬浮细胞培养液；
所述转接培养即将三角瓶中的悬浮液用灭菌后的150目尼龙网过滤，将滤液转接至含有100-150ml新的液体培养基的三角瓶中置于恒温摇床上继续培养；
所述液体培养基为MS培养基调整得到，其将MS培养基中的硝酸铵、硝酸钾、无水氯化钙、七水硫酸镁和四水硫酸锰的含量调整为硝酸铵500mg/L、硝酸钾2500mg/L、无水氯化钙80mg/L、七水硫酸镁500mg/L、四水硫酸锰25mg/L，将磷酸二氢钾更换为磷酸氢二钠200mg/L，其余组分不变，然后再添加2,4-D 5mg/L、KT0.75mg/L、TDZ 1mg/L、NAA0.5mg/L、PVP300mg/L、葡萄糖30g/L、椰子汁150mg/L、茉莉酸甲酯200μmol/L，pH 5.8。
实施例3：
一种牛大力悬浮细胞培养的快速繁殖方法，以开花后50～60天的牛大力果荚中取出的幼嫩子叶为培养材料，经诱导培养和继代培养获得继代愈伤组织，再经悬浮细胞培养获得稳定的牛大力悬浮细胞培养液。
其中，培养材料的获得方法如下：选取开花后50～60天的牛大力果荚，在超净工作台上用棉花蘸取体积浓度为75％乙醇擦拭果荚，对果荚进行表面灭菌，然后小心剥开果荚，用灭菌的镊子夹取果荚里面的未成熟种子，置于无菌碟子或无菌滤纸上，再用无菌解剖刀切开种皮，用无菌镊子夹取子叶即得培养材料。
其中，所述诱导培养的方法如下：将培养材料接种至诱导培养基上于黑暗条件、26℃下诱导培养25天得到诱导愈伤组织；
所述诱导培养基的配方为：MS+20mg/L 2,4-D+0.5mg/L KT+0.5mg/L TDZ+0.2mg/L NAA+300mg/L PVP+500mg/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+5g/L琼脂。
其中，所述继代培养的方法如下：将诱导愈伤组织转接至增殖培养基上于黑暗条件下进行继代培养3次，至获得继代愈伤组织，每次继代培养的时间为7-10天，培养温度为24-28℃，所得继代愈伤组织为浅绿色、颗粒状、外观湿润、质地疏松，能满足悬浮细胞培养的需要；
所述增殖培养基的配方为：MS+1.0mg/L TDZ+0.5mg/L KT+0.2mg/L NAA+300mg/L PVP+200mg/L芦荟汁+30g/L蔗糖+5g/L琼脂。
其中，所述悬浮细胞培养的方法如下：将3g继代愈伤组织接种至含有120ml液体培养基的三角瓶中，将三角瓶置于转动频率为90r/min、温度为28℃的恒温摇床上进行悬浮细胞培养，每12天转接培养一次，转接培养4次后，得到稳定的牛大力悬浮细胞培养液；
所述转接培养即将三角瓶中的悬浮液用灭菌后的150目尼龙网过滤，将滤液转接至含有120ml新的液体培养基的三角瓶中置于恒温摇床上继续培养；
所述液体培养基为MS培养基调整得到，其将MS培养基中的硝酸铵、硝酸钾、无水氯化钙、七水硫酸镁和四水硫酸锰的含量调整为硝酸铵400mg/L、硝酸钾2200mg/L、无水氯化钙65mg/L、七水硫酸镁450mg/L、四水硫酸锰18mg/L，将磷酸二氢钾更换为磷酸氢二钠175mg/L，其余组分不变，然后再添加2,4-D 3mg/L、KT 0.65mg/L、TDZ 0.8mg/L、NAA 0.35mg/L、PVP250mg/L、葡萄糖28g/L、椰子汁125mg/L、茉莉酸甲酯100μmol/L，pH 5.8。
实施例4：
在实施例3的基础上，所述的牛大力悬浮细胞培养的快速繁殖方法，将得到的稳定的牛大力悬浮细胞培养液取2ml置于100ml新的液体培养基中培养10天进行扩繁培养，获得增殖后的悬浮细胞培养液。
实施例5：
在实施例3的基础上，所述的牛大力悬浮细胞培养的快速繁殖方法，将得到的稳定的牛大力悬浮细胞培养液取2ml置于150ml新的液体培养基中培养15天进行扩繁培养，获得增殖后的悬浮细胞培养液。
实施例6：
在实施例5的基础上，所述的牛大力悬浮细胞培养的快速繁殖方法，培养材料经诱导培养之前，先经过如下前处理：将培养材料采用经剪裁的玉米苞叶全包覆，并用细线固定，将玉米苞叶连同培养材料一起采用灭菌过的针扎2-4个孔，再将其置入装有前处理溶液的玻璃容器中，置于200-300高斯磁场中磁化处理2h，且在磁化处理的同时，播放轻音乐，且每播放30min之后暂停10min，播放音量控制在30-90db之间，磁化处理之后取出培养材料，用厨房纸擦干备用；
所述前处理溶液以磁化水为溶剂，配方为：0.5mg/L纳米氧化锌+0.1mg/L油菜素内酯+5g/L奶粉+1.5g/Lβ-葡聚糖+10mg/L生姜提取物。其中生姜提取物为市售。
为了说明本发明的牛大力悬浮细胞培养的快速繁殖方法的技术效果，本发明的申请人针对实施例3的方法进行牛大力悬浮细胞培养，将实施例3中液体培养基中茉莉酸甲酯的浓度设置为10、40、80、100、130、170、200μmol/L，并同时针对实施例6的方法进行牛大力悬浮细胞培养，均成功诱导出符合悬浮细胞培养需要的继代愈伤组织，且得到的愈伤组织增殖快、质量好，并获得稳定的悬浮细胞培养液，再将得到的稳定的牛大力悬浮细胞培养液通过实施例5的方法进行一次扩繁增殖处理，然后将其采用灭菌后的150目尼龙网过滤后于60℃下干燥12h得到干燥后的悬浮细胞，得到一次扩繁后的牛大力悬浮细胞的干样品重量为0.19～0.45μg/每毫升培养物(这里的培养物是指扩繁增殖后的牛大力悬浮细胞培养液)，具体见下表。
表1不同实施方案下扩繁一次得到的牛大力悬浮细胞液的干样品重
上述实施方案说明本发明的方法不仅能获得稳定的牛大力悬浮细胞培养液，并且悬浮细胞增殖倍数高，另外，由表1可以看出，在悬浮细胞培养时，液体培养基中茉莉酸甲酯的浓度为80-170μmol/L时，得到的牛大力悬浮细胞的产量更多，其中以茉莉酸甲酯浓度为80-100μmol/L更为适宜，并且，实施例6相对实施例3来说，增加了牛大力培养材料的前处理，从结果可以看出，前处理的不同，直接导致了牛大力悬浮细胞的产量增加。
对比例1：
一种牛大力悬浮细胞培养的快速繁殖方法，在实施例3的基础上，以嫩叶或带芽茎段为培养材料，接种到诱导培养基中进行诱导培养，所述愈伤组织诱导培养基的配方和诱导培养方法同实施例3。
本对比例1的方法诱导出的愈伤组织属于致密型，经继代培养后无法获得质地疏松的愈伤组织，无法进一步进行悬浮细胞培养，说明并不是任意牛大力的组织部分就能诱导出悬浮细胞的。
对比例2：
一种牛大力悬浮细胞培养的快速繁殖方法，在实施例3的基础上，将所述诱导培养基的配方替换为：MS、0.5mg/LKT、0.5mg/L TDZ、0.2mg/L NAA。除诱导培养基的配方外，其他方法与实施例3相同。
本对比例2的方法能仅能诱导出少量黄白色致密型的愈伤组织，经继代培养后无法获得较多质地疏松的愈伤组织，无法培养得到质量好、产量高的悬浮细胞。
对比例3：
一种牛大力悬浮细胞培养的快速繁殖方法，在实施例3的基础上，所述悬浮细胞培养液体培养基的配方替换为：MS、2,4-D 1～5mg/L、KT0.5～0.75mg/L、TDZ 0.5～1mg/L、NAA 0.2～0.5mg/L、PVP200～300mg/L、葡萄糖25～30g/L。
除悬浮细胞培养液体培养基的配方外，其他与实施例3相同。
本对比例3的方法培养一段时间后悬浮细胞开始出现褐变死亡的现象，经转接培养多次无效，无法得到稳定量多的悬浮细胞培养液。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。