本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种羽裂唇柱苣苔的组织培养方法。
背景技术：
羽裂唇柱苣苔(Chirita pinnatifida(Hand.-Mazz.)B.L.Burtt)为苦苣苔科唇柱苣苔属的多年生草本植物。分布于广西、广东北部、贵州东南部、湖南南部、江西、福建西部、浙江南部和西部。生于海拔600-1500米的谷林中石上或溪边。全草可供药用，用于跌打损伤等症。此外，羽裂唇柱苣苔还具有极高的观赏价值，应用前景广阔。
羽裂唇柱苣苔栽培难度较大，对生长环境要求苛刻。需要高空气湿度、高土壤湿度，但是同时期根系对土壤水气化、含氧量有严格要求；忌阳光直射，喜弱酸至中性栽培基质；畏热；喜夏季较高的日夜温差，夏季日温最高温度最好不超过30℃。
目前，有关羽裂唇柱苣苔的研究极少，仅在资源调查中有少量涉及。羽裂唇柱苣苔可以采用种子繁殖或叶片扦插，而组织培养技术具有繁殖速度快、繁殖系数大，繁殖后代整齐一致，能保持原有品种的优良性状，不受季节的限制等优点，已广泛应用各种观赏植物中，目前尚未见有应用于羽裂唇柱苣苔上。
技术实现要素：
针对羽裂唇柱苣苔现有繁育技术的不足之处，本发明提供一种羽裂唇柱苣苔的组织培养方法，从而可以达到快速获得羽裂唇柱苣苔优质种苗的目的。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种羽裂唇柱苣苔的组织培养方法，包括如下步骤：
(1)外植体的消毒灭菌：春季取羽裂唇柱苣苔的幼嫩叶片，先用0.1-0.5％洗衣粉溶液浸泡25-30min后在流水下冲洗30min，并用软毛刷轻轻刷洗叶片，然后转入超净工作台进行灭菌操作，先用棉球蘸取75％酒精拭擦叶片表面，无菌水冲洗2次，将叶片在75％酒精中浸泡10s，无菌水冲洗3次，再用0.1％氯化汞溶液处理6min，无菌水冲洗3次，最后再用0.1％氯化汞溶液处理6min，无菌水冲洗3次，氯化汞灭菌过程中轻轻震荡使氯化汞充分接触叶片；叶片切成2cm×2cm大小，接种在MS培养基，得到无菌叶片；
(2)不定芽的诱导：将获得的无菌叶片切成1cm×1cm大小，并在叶片四周留有切口，接种在不定芽诱导培养基中，经过20-25d的培养，叶片四周的伤口诱导出不定芽；
(3)继代培养：将获得的不定芽切取下来，接种在继代培养基中培养25-30d，得到组培小苗；
(4)生根培养：选取高度为1.5-3.0cm的组培小苗，接种在生根培养基中培养18-20d，得到组培生根苗；
(5)炼苗移栽：将高度为2.5-4.0cm的生根苗移出培养室后揭去组培瓶盖在自然条件下炼苗4洗净培养基移栽到装有基质的50孔穴盘中；浇透定根水后，将移栽小苗置于有遮阳网的荫棚下，透光率为40-50％，并采用间歇性喷雾系统控制空气湿度，每2h喷雾1次，喷雾时间每次40s，确保空气湿度85％以上，早晚浇透水各1次，移栽后7-10d，即可成活。
作为优选，步骤(2)中的不定芽诱导培养基为MS+6-BA1.0-2.0mg/L+NAA0.01-0.1mg/L。
作为优选，步骤(3)中的继代培养基为MS+6-BA1.0-2.0mg/L+NAA0.05mg/L+活性炭0.1g/L。
作为优选，步骤(4)中的生根培养基为MS+IBA0.1-0.5mg/L+活性炭0.1g/L。
作为优选，步骤(5)中的基质是由泥炭和珍珠岩按照体积比为2:1组成。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明的羽裂唇柱苣苔的组织培养方法具有后代长势良好，不定芽多，繁殖速度快、繁殖系数大，繁殖后代整齐一致，生根率高，移栽成活率高的优点。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例1：
一种羽裂唇柱苣苔的组织培养方法，包括如下步骤：
(1)外植体的消毒灭菌：春季取羽裂唇柱苣苔的幼嫩叶片，先用0.1％洗衣粉溶液浸泡25min后在流水下冲洗干净30min，并用软毛刷轻轻刷洗叶片，然后转入超净工作台进行灭菌操作，先用棉球蘸取75％酒精拭擦叶片表面，无菌水冲洗2次，将叶片在75％酒精中浸泡10s，无菌水冲洗3次，再用0.1％氯化汞溶液处理6min，无菌水冲洗3次，最后再用0.1％氯化汞溶液处理6min，无菌水冲洗3次，氯化汞灭菌过程中轻轻震荡使氯化汞充分接触叶片；叶片切成2cm×2cm大小，接种在MS培养基，得到无菌叶片；
(2)不定芽的诱导：将获得的无菌叶片切成1cm×1cm大小，并在叶片四周留有切口，接种在不定芽诱导培养基中，经过21d的培养，叶片四周的伤口诱导出不定芽；所述的不定芽诱导培养基为MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.01mg/L；
(3)继代培养：将获得的不定芽切取下来，接种在继代培养基中培养25d，得到组培小苗；所述的继代培养基为MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.05mg/L+活性炭0.1g/L；
(4)生根培养：选取高度为1.5cm的组培小苗，接种在生根培养基中培养20d；所述的生根培养基为MS+IBA 0.1mg/L+活性炭0.1g/L；
(5)炼苗移栽：将高为2.5cm的生根苗移出培养室后揭盖在自然条件下炼苗4d；洗净培养基移栽到装有基质的50孔穴盘中；浇透定根水后，将移栽小苗置于有遮阳网的荫棚下，透光率为40％，并采用间歇性喷雾系统控制空气湿度，每2h喷雾1次，喷雾时间每次40s，确保空气湿度85％以上，早晚浇透水各1次，移栽后7d，即可成活；所述的基质是由泥炭和珍珠岩按照体积比为2:1组成。
实施例2：
一种羽裂唇柱苣苔的组织培养方法，包括如下步骤：
(1)外植体的消毒灭菌：春季取羽裂唇柱苣苔的幼嫩叶片，先用0.5％洗衣粉溶液浸泡30min后在流水下冲洗30min，并用软毛刷轻轻刷洗叶片，然后转入超净工作台进行灭菌操作，先用棉球蘸取75％酒精拭擦叶片表面，无菌水冲洗2次，将叶片在75％酒精中浸泡10s，无菌水冲洗3次，再用0.1％氯化汞溶液处理6min，无菌水冲洗3次，最后再用0.1％氯化汞溶液处理6min，无菌水冲洗3次，氯化汞灭菌过程中轻轻震荡使氯化汞充分接触叶片；叶片切成2cm×2cm大小，接入MS培养基，得到无菌叶片；
(2)不定芽的诱导：将获得的无菌叶片切成1cm×1cm大小，并在叶片四周留有切口，接种在不定芽诱导培养基中，经过20d的培养，叶片四周的伤口诱导出不定芽；所述的不定芽诱导培养基为MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.01mg/L；
(3)继代培养：将获得的不定芽切取下来，接种在继代培养基中培养30d，得到组培小苗；所述的继代培养基为MS+6-BA2.0mg/L+NAA 0.05mg/L+活性炭0.1g/L；
(4)生根培养：选取高度难为3.0cm的组培小苗，接种在生根培养基中培养18d；所述的生根培养基为MS+IBA 0.5mg/L+活性炭0.1g/L；
(5)炼苗移栽：将高为4.0cm的生根苗移出培养室后揭盖在自然条件下炼苗5d；洗净培养基移栽到装有基质的50孔穴盘中；浇透定根水后，将移栽小苗置于有遮阳网的荫棚下，透光率为50％，并采用间歇性喷雾系统控制空气湿度，每2h喷雾1次，喷雾时间每次40s，确保空气湿度85％以上，早晚浇透水各1次，移栽后10d，即可成活；所述的基质是由泥炭和珍珠岩按照体积比为2:1组成。
实施例3：
一种羽裂唇柱苣苔的组织培养方法，包括如下步骤：
(1)外植体的消毒灭菌：春季取羽裂唇柱苣苔的幼嫩叶片，先用0.2％洗衣粉溶液浸泡28min后在流水下冲洗干净30min，并用软毛刷轻轻刷洗叶片，然后转入超净工作台进行灭菌操作，先用棉球蘸取75％酒精拭擦叶片表面，无菌水冲洗2次，将叶片在75％酒精中浸泡10s，无菌水冲洗3次，再用0.1％氯化汞溶液处理6min，无菌水冲洗3次，最后再用0.1％氯化汞溶液处理6min，无菌水冲洗3次，氯化汞灭菌过程中轻轻震荡使氯化汞充分接触叶片；叶片切成2cm×2cm大小，接种在MS培养基，得到无菌叶片；
(2)不定芽的诱导：将获得的无菌叶片切成1cm×1cm大小，并在叶片四周留有切口，接种在不定芽诱导培养基中，经过25d的培养，叶片四周的伤口诱导出不定芽；所述的不定芽诱导培养基为MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L；
(3)继代培养：将获得的不定芽切取下来，接种在继代培养基中培养26d，得到组培小苗；所述的继代培养基为MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.05mg/L+活性炭0.1g/L；
(4)生根培养：选取高度为2.0cm的组培小苗，接种在生根培养基中培养19d；所述的生根培养基为MS+IBA 0.3mg/L+活性炭0.1g/L；
(5)炼苗移栽：将高为3.0cm的生根苗移出培养室后揭盖在自然条件下炼苗4d；洗净培养基移栽到装有基质的50孔穴盘中；浇透定根水后，将移栽小苗置于有遮阳网的荫棚下，透光率为45％，并采用间歇性喷雾系统控制空气湿度，每2h喷雾1次，喷雾时间每次40s，确保空气湿度85％以上，早晚浇透水各1次，移栽后8d，即可成活；所述的基质是由泥炭和珍珠岩按照体积比为2:1组成。
将上述实施例1-3得到的羽裂唇柱苣苔的组织培养方法中不定芽诱导、不定芽的继代增值、不定芽生根情况以及组培苗的移栽成活率进行调查统计，结果见表1。
表1本发明的羽裂唇柱苣苔的组织培养方法对不定芽诱导、不定芽的继代增值、不定芽生根情况的测定
由表1可知，本发明的羽裂唇柱苣苔的组织培养方法得到的不定芽长势良好，不定芽多；其诱导率和生根率均为100％，组培苗的移栽成活率为100％。可见，本发明的方法具有明显的技术优势，值得进一步推广和应用。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。