专利名称：一种Cdc42抑制剂及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种化合物，具体地涉及一种Cdc42抑制剂及其应用。
背景技术：
细胞分裂周期蛋白Cdc42是小G蛋白的Rho GTP酶家族的一个亚类，是许多细胞生物学功能的重要调控蛋白。首次在Saccharomyces cerevisiae中发现,参与细胞极化,随后认识到其在细胞骨架重组、细胞的胞吞运输途径、细胞周期调控和细胞转录中都发挥着重要作用。与多数GTP酶一样，通过⑶P交换为GTP结合实现信号转导，激活Cdc42。Rho GTP酶家族的这种核苷酸限制型构象之间的循环由3类重要蛋白调节鸟嘌呤交换因子(GEF)，催化⑶P的释放和GTP的结合；GTP酶激活蛋白(GAP)，作为负向调节因子加速Rho GTP酶的水解，使Rho GTP酶由活性状态变为无活性状态；OTP解离抑制因子(⑶I)，阻止⑶P从Rho GTP酶上分离，抑制Rho GTP酶活性。近年的研究揭示Cdc42的异常活性广泛参与了包括肿瘤和神经退行性疾病等人·类疾病的病理生理。有趣的是在人类肿瘤中没有发现Cdc42的突变基因，它的异常形式主要表现为在组织和依赖的微环境中失调或过表达，与肿瘤细胞的转化及转移密切相关。作为关键的神经元形态形成的调控器，Cdc42掌控着正常大脑发育的命运，Cdc42敲除的小鼠不能活至出生并表现明显的大脑畸形。既往不同的研究显示Cdc42的活化对上皮细胞间充质细胞转变(EMT)和因此发生的胞内物质运输十分重要，这对肿瘤细胞的侵袭是非常必要的。但是，在三大典型的Rho超家族亚类中，对于Cdc42的研究远滞后于RhoA和Racl。这部分是由于Cdc42的活化/失活形式的转换非常快速，也缺乏选择性的小分子研究工具来帮助直接了解这个过程。Rho GTP酶家族参与的信号通路调控细胞多种生化功能，诸如细胞膜的物质运输、细胞周期调控和细胞骨架的组织，这关乎细胞形态、细胞运动以及细胞命运。近年的研究显示很多疾病的病理发生和进程与Rho GTP酶家族功能蛋白的失常或失控有关，因此成为药物开发的重要靶点。同时，Rho GTP酶家族的小分子调节剂的应用也促进了对其中功能蛋白的研究。例如，新型脑、心血管活性药——法舒地尔和小分子化合物Y27632是公认的RhoA下游效应信号分子Rho/pieO-K强效抑制剂。作为Racl蛋白的选择性抑制剂，近来对靶向Racl-GEF连接的小分子化合物NSC23766的研究也大大促进了对Racl蛋白功能的认识。但是，却几乎没有有效的Cdc42选择性抑制剂。Secramine，天然产物加兰他敏的类似物，近来认为它通过Rho⑶Il可抑制依赖于Cdc42的高尔基体-细胞膜间物质转运。不同于广泛应用的Y27632(1903篇相关文献)和NSC23766(115篇相关文献)，Secramine的获得十分有限，研究甚少(仅有9篇相关文献)。Cdc42的失调在很多方面与肿瘤发生相关，包括肿瘤的转化和转移；另外神经元的发展与维持也严重依赖于正常的Cdc42活性。NSC23766是一个基于计算机模拟的结构筛选的化合物，与Racl分子的表面结构契合，而已知Racl对GEF的结合至关重要(Gao, Y., J. B. Dickerson, et al. (2004).Rational design and characterization of a Rac GTPase-specific small moleculeinhibitor. Proc Natl Acad Sci USA. 101(20) :7618-7623)。NSC23766 可以抑制血清中或生长因子诱导的Racl活化和Racl片状伪的形成。NSC23766作用于人类前列腺癌细胞株，能抑制细胞增殖，抑制非停泊性生长，并且降低细胞的侵袭表型，而肿瘤细胞的这些表型均依赖于内源性Racl的活性。此外，新的研究表明，NSC23766可以改善由Racl所介导的脊髓损伤(SCI)诱发的神经性疼痛(Tan, A.M.，S. Stambouli an, et al. (2008). Neuropathicpain memory is maintained by Raci-regulated dendritic spine remodeling afterspinal cord injury. J Neurosci. 28(49) : 13173-13183)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种化合物，其具有下式I的结构為式I，其名称为4-(3-(2-(4-Bromo-2-chlorophenoxy)acetyl)thioureido)-N-(4，6-dimethylpyrimidin-2-yl) benzene sulfonamide,即 4- (3- (2- (4-溴 ~2~ 氯-苯氧基)-乙酸基)-硫服基)_氮-(4，6_ 二甲基嘧啶-2-基)苯磺酰胺。为了简便起见，本申请文件中将其命名为ZCL278。本发明提供的ZCL278，能够抑制Cdc42参与的所有过程，有效抑制Cdc42的作用。因为Cdc42在细胞周期、运动、黏附、细胞凋亡和细胞内运输等中都具有重要的作用。同时在癌症的发展和侵袭，心血管系统和呼吸系统疾病，神经系统疾病，以及其它许多疾病中均有重要的作用。所以本发明提供的ZCL278可以制备用于治疗恶性肿瘤的药物，具体说，可以制备用于防治恶性肿瘤的发展和侵袭的药物。上述的化合物还可以制备用于治疗心血管系统疾病的药物。上述的化合物还可以制备用于治疗呼吸系统疾病的药物。上述的化合物还可以制备用于治疗神经系统疾病的药物。其中，上述的化合物可以通过抑制Cdc42的功能发挥上述作用。本发明的另一目的是提供一种Cdc42抑制剂，其包含上述式I所示的化合物。本发明提供的化合物ZCL278能够有效抑制GTP结合Cdc42的活性。在小鼠成纤维细胞Swiss 3T3中，化合物ZCL278影响Cdc42调控亚细胞结构的两个最主要的效应表现消除细胞微棘的形成，破坏GM130对接高尔基体的结构。相比Rac的选择性抑制剂NSC23766，ZCL278可减少细胞核外缘活性Cdc42的积聚。ZCL278抑制Cdc42介导的神经元分支及其生长锥动力学，同时发现其在不破坏细胞活率的条件下即可抑制转移性前列腺癌细胞PC-3的actin为基础的细胞运动及迁移。所以，ZCL278能够有效抑制Cdc42对细胞形态及行为学的调控，在癌症的发展和侵袭，心血管系统和呼吸系统疾病，以及神经系统等疾病中均能发挥重要的作用。为让本发明之上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。
图IA-图IC :ZCL靶向Cdc42_ITSN(交叉蛋白)连接的结构鉴定。其中，图IA为计算机模拟ZCL278结合Cdc42分子(实际试验中生成的为彩色图):灰色表面(如图中的箭头I)所示为蛋白质，绿色棒(如图中的箭头2)所示为配基。图IB为ZCL278与Cdc42氨基酸残基的结合绿色棒为ZCL278分子(如图中的箭头3)，灰色(如图中的箭头4)示意Cdc42结构，橙色线条(如图中的箭头5)示意两分子间形成氢键。图IC表示将Cdc42-ZCL278复合物与GMP-PCP蛋白质分子(蛋白质数据库2QRZ)的结构进行叠合绿色棒为ZCL278分子，灰色示意Cdc42结构，青色棒示意GMP-PCP结构(GMP-PCP是GTP类似物，￠, Y-亚甲基二磷酸鸟苷酸)。图2A-图2C表示ZCL278的活性特性。其中图2A表示ZCL278抑制Cdc42介导的细胞微棘形成。图2B表示ZCL278抑制内生型Rac/Cdc42的活化。图2C表示ZCL278抑制刺激型Cdc42的活化。图3A-图3C表示活化Cdc42/磷酸化RhoA的免疫荧光染色。图4表示ZCL278破坏细胞内GM130蛋白对接高尔基体的组织。图5A-图5C表示ZCL278阻碍细胞迁移，但不影响细胞活率。图6A-图6C表示ZCL278抑制神经元分支和生长锥动力学。
具体实施例方式实施例I :Cdc42抑制剂的虚拟筛选分析Cdc42_ITSN复合物的三维结构可发现介于两分子之间一个主要的结合域，ITSN分子中Glnl380残基和Argl384残基之间以及Cdc42上Asn39和Phe37之间的氢键，ITSN 分子中 Leul376、Metl379 残基和 Thrl383 残基之间以及 Cdc42 上 Phe56、Tyr64、Leu67和Leu70之间的两个疏水簇。为筛选Cdc42抑制剂，推定Cdc42分子上结合口袋为ITSN蛋白表面与Cdc42结合的半径距离在7A内的氨基酸残基形成的结构。这其中含有Cdc42蛋白分子中Thr35，Val36，Asn39，Phe56和Asp57等16个氨基酸残基，如图IA-图IC所示。用Glide程序筛选SPECS数据库中能破坏Cdc42与ITSN连接的小分子化合物。Cdc42-ITSN复合物的晶体结构来源于蛋白质数据库，ID号1KI1.占据Cdc42结合位点的ISTN中氨基酸残基为Leu376, Met379, Glnl380, Thrl383, Argl384.距离这五个氨基酸中心在7A内的Cdc42氨基酸残基形成Cdc42的结合口袋。运用蛋白准备模块ProteinPreparation Wizard 处理模型的初始结构，使用 Glide/Receptor Grid Generation 模块分子对接，使用配体准备模块Ligprep将对Specs数据库中197000个化合物进行进行高通量虚拟筛选，按照以下标准筛选出来的排名前100位的化合物将入选ITSN样的结合态，可占据ITSN上Leul376, Glnl380, Argl384, Metl379和Thrl383残基的空间结构；至少形成3个氢键；与Cdc42分子中保守的Asn39或Phe37残基能形成氢键；分子骨架的多样性。排名前50000个分子再进行标准精度计算排出前100个分子，最后选出30个化合物测试它们对Cdc42的活性和/或功能的影响。Cdc42分子上ZCL278键合的电脑模拟模式如图IA所示，ZCL278嵌合Cdc42蛋白中 Thr35, Val36, Asp38, Asn39, Phe56, Tyr64, Leu67 和 Leu70 残基顺序形成的口袋结构。如图IB所示，两分子之间还发现外延的良性相互作用。与涉及Thr35，Asn39和Asp57残基在内的氨基酸残基形成5个氢键，同时与Val36和Phe56残基形成有疏水作用的结构。如图IC所示，分子中的溴苯环插入到⑶P/GTP的结合口袋里。电脑模拟的ZCL278与Cdc42的结合可破坏Cdc42-ISTN的⑶P/GTP转换态结合。实施例2 :化合物ZCL278的合成ZCL278可以通过下述合成方法合成，以下合成方法仅用于示例，而非对本发明的限制，本领域的技术人员可以理解并想到可采用其它合成方法来合成ZCL278，其也属于本发明的保护范围。反应试剂和条件(a)K2CO3, DMF (N，N- 二甲基甲酰胺)，70 °C ; (b)NaOH，dioxane ( 二氧杂环乙焼)/H2O ； (c) SOCl2 ( 二氯亚砜),DMF, reflux (回流);(d) NaSCN (硫氰酸钠)，acetone (丙酮)，0 V -rt ； (e) 4-amino-N- (4,6-dimethylpyrimidin-2-yl)benzene-sulfonamide (4-氨基-N_(4,6- 二甲基 _2_ 卩密唳基)苯横酸胺)，0°C -r. t.反应式如下
权利要求
1.一种化合物，其特征在于，具有下式I的结构 Is OOl 式I。
2.权利要求I所述的化合物在制备用于治疗恶性肿瘤的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物用于防治恶性肿瘤的发展和侵
4.权利要求I所述的化合物在制备用于治疗心血管系统疾病的药物中的应用。
5.权利要求I所述的化合物在制备用于治疗呼吸系统疾病的药物中的应用。
6.权利要求I所述的化合物在制备用于治疗神经系统疾病的药物中的应用。
7.根据权利要求2至7中任一项所述的应用，其特征在于，所述的化合物抑制Cdc42的功能。
8.—种Cdc42抑制剂，其特征在于，包含权利要求I所述的化合物。
全文摘要
本发明涉及一种具有式I结构的化合物，该化合物能够用于制备Cdc42抑制剂。丝状伪足的形态学分析，Western blot Cdc42磷酸化及下游效应蛋白WASP的分析，以及细胞伤口愈合试验和生长锥的形成试验，均表明本发明提供的化合物能够抑制Cdc42参与的所有过程，有效抑制Cdc42的作用。有效抑制actin参与的细胞功能，如高尔基体组织和细胞运动。
文档编号C07D239/69GK102796050SQ20121015827
公开日2012年11月28日 申请日期2012年5月21日 优先权日2011年5月23日
发明者陆群, 周虎臣, 陈燕华 申请人:昂科生物医学技术(苏州)有限公司