抗菌肽。
[0028] ①超滤：将金枪鱼肝脏粗蛋白酶解产物采用5 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分 子量小于5 kDa部分，得超滤酶解液； ②AB-8大孔树脂纯化：将得到的超滤酶解液制成浓度为15 mg/mL溶液，以3 mL/min 加入到大孔树脂层析柱，然后用60%乙醇进行洗脱，洗脱液于50 °C以下低压旋蒸除去乙醇 后，冷冻干燥得大孔树脂精制多肽。
[0029] ③葡聚糖凝胶G-25层析：将上述大孔树脂精制多肽溶于双蒸水配成浓度为20 mg/mL的溶液，经过凝胶柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据215 nm下的吸光度曲线收集 洗脱组分，其中，对大肠杆菌（fecAericAia coJi)和巨大芽孢杆菌（ 抑制率最高组分为凝胶层析酶解物（F3)。
[0030] ④高效液相色谱制备：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成80 μ g/mL的溶液， 利用反相高效液相色谱（RP-HPLC)进行纯化（RP-HPLC条件：进样量20 yL ;色谱柱为 Zorbax C18 ;流动相：40%乙腈；洗脱速度0. 8 mL/min ;紫外检测波长215 nm)，根据对大肠 杆菌（fecAericAia coJi)和巨大芽抱杆菌抑制率得1个高活性抗 菌肽。
[0031] ⑤结构测定：高活性抗菌肽经检测为单一峰，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨 基酸序列为 Thr-Gln-Ala-Ala-Phe-Gln-Lys-Phe-Leu-Ala-Val-Ala-Thr-Ser-Gln-Leu-Gly -Lys-Gln-Tyr-His-Tyr-Trp，MALDI-T0F-MS 检测分子量为 2686. 66 Da。
[0032] 表 1 抗菌肽（TQAAFQKFLAVATSQLGKQYHYW)的抑菌谱（η = 3)
注：灭菌打孔器（直径=4mm)打孔，每孔加入抗菌液20 μ L ;表中数据为抑菌圈直径 平均值土标准差（η=3)。
[0033] ⑥抑菌活性测定：如表1所示：抗菌肽对革兰氏阴性菌（G )(大肠杆菌 {Escherichia coif)、1制爲Pseudomonas fluorescens)Pseudomonas aeri/giflasa ))和革兰氏阳性菌（G+)(金黄色葡萄球（ayrei/6·)、巨大芽孢杆 菌（ifeciWiA? a?e^a ter/ω??)、藤黄八叠球菌（5krci/?a知iea))均有抑菌作用，具有广谱抑菌 性，其中对G菌抑菌效果总体强于G +菌。
[0034] 最后，尚需注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不 限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接 导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种金枪鱼肝脏抗菌肽，其特征在于该金枪鱼肝脏抗菌肽的氨基酸序列为Thr-Gln -Ala-Ala-Phe-Gln-Lys-Phe-Leu-Ala-Val-Ala-Thr-Ser-Gln-Leu-Gly-Lys-Gln-Tyr-His-Tyr-Trp ;所述的金枪鱼肝脏抗菌肽MALDI-TOF-MS检测分子量为2686. 66 Da。2. -种权利要求1所述的金枪鱼肝脏抗菌肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 金枪鱼肝脏的预处理：金枪鱼肝脏从冰冻金枪鱼中取出后，按照固液比I g :3~5mL 加入沸腾的乙酸溶液中5~8 min，然后用高速组织捣碎机匀浆； 2) 金枪鱼肝脏粗蛋白的提取：将匀浆加热至20~30°C，在功率为200~300W，频率为 50~80kHz超声波发生器内超声提取30~45 min，9 000 r/min离心15~25 min，取上 清液，冷冻干燥，得金枪鱼肝脏粗蛋白； 3) 金枪鱼肝脏粗蛋白的酶解：将金枪鱼肝脏粗蛋白按照固液比I g :3~5mL加入磷酸 盐缓冲液，按照肝脏粗蛋白质量的1. 5~2. 5%加入蛋白酶，于温度55~65°C下酶解2~4 h，得酶解产物； 4) 金枪鱼肝脏抗菌肽的制备：将制备的金枪鱼肝脏粗蛋白酶解产物依次经超滤和层 析，得到金枪鱼肝脏抗菌肽。3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤3)中的蛋白酶为中性蛋白 酶，酶活力彡2. OX IO4 U/g ;所述的磷酸盐缓冲液为0? 02 mol/L，pH 6. 5~7. 5。4. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤4)的超滤和层析的具体过程 为： 超滤：将金枪鱼肝脏粗蛋白酶解产物采用5 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小 于5 kDa部分，得超滤酶解液； 大孔树脂纯化：将得到的超滤酶解液制成浓度为10~20 mg/mL溶液，以3~5 mL/min 加入到大孔树脂层析柱，然后用60%乙醇进行洗脱，洗脱液于50 °C以下低压旋蒸除去乙醇 后，冷冻干燥得大孔树脂精制多肽； 凝胶层析：将上述大孔树脂精制多肽溶于双蒸水配成浓度为10~20 mg/mL的溶液，经 过凝胶柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据215 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中， 对大肠杆菌和巨大芽孢杆菌抑制率最高组分为凝胶层析酶解物； 高效液相色谱制备：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成80~100 y g/mL的溶液，利 用反相高效液相色谱进行纯化，根据对大肠杆菌和巨大芽孢杆菌抑制率得1个高活性抗菌 肽 Thr-Gln-Ala-Ala-Phe-Gln-Lys-Phe-Leu-Ala-Val-Ala-Thr-Ser-Gln-Leu-Gly-Lys-Gln -Tyr-His-Tyr-Trp 05. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述大孔树脂为AB-8。6. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述凝胶为葡聚糖凝胶G-25 ;所述 RP-HPLC条件为：进样量20~25 y L ;色谱柱为Zorbax C18 ;流动相：40%乙腈；洗脱速度 0? 8~L 0 mL/min ;紫外检测波长215 nm。7. 权利要求1所述的一种金枪鱼肝脏蛋白抗菌肽用于制备抗菌药物的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种金枪鱼肝脏抗菌肽及其制备方法，该抗菌肽的氨基酸序列为Thr-Gln-Ala-Ala-Phe-Gln-Lys-Phe-Leu-Ala-Val-Ala-Thr-Ser-Gln-Leu-Gly-Lys-Gln-Tyr-His-Tyr-Trp，MALDI-TOF-MS检测分子量为2686.66Da。制备时以金枪鱼肝脏作为原料，经肝脏预处理、粗蛋白抽提、酶解、超滤和色谱制备，得抗菌肽。该抗菌肽对革兰氏阴性菌（G-）和革兰氏阳性菌（G+）均有抑制作用，具有广谱抑菌性，可用于制备抗菌药物。
【IPC分类】A61K38/17, C07K14/46, C07K1/34, C12P21/06, A61P31/04
【公开号】CN105061575
【申请号】CN201510055130
【发明人】迟长凤, 王斌, 陈荫, 罗红宇
【申请人】浙江海洋学院
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年2月3日