重组Cytohesin拮抗多肽TAT-Sec7及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程和生物制药领域，具体涉及一类重组Cytohesin拮抗多肽的 制备及其应用。
【背景技术】
[0002] 肿瘤是机体的细胞异常增殖形成的新生物，常表现为机体局部的异常组织团块。 肿瘤分为良性肿瘤和恶性肿瘤，所谓的癌症即指恶性肿瘤。恶性肿瘤作为全球较大的公共 卫生问题之一，极大地危害人类的健康，并将成为新世纪人类的第一杀手。恶性肿瘤的治疗 方法主要有手术治疗、放射治疗和化学治疗等，但是癌细胞的转移给这3种治疗方式增加 了极大的困难，肿瘤转移已经成为癌症患者死亡的主要原因，而市场上罕有抑制肿瘤转移 的药物。因此开发能够抑制肿瘤转移的药物成为减少癌症死亡率，提高患者生存率的重要 途径。
[0003] ADP核糖基化因子（ADP-ribosylation factors，ARFs)是真核细胞中广泛表达且 高度保守的GTP结合蛋白，是Ras超家族成员之一。ARFs家族共有6个成员，分别属于3个 亚型。其中I型包含ARF1、ARF2和ARF3 ; II型包含ARF4和ARF5 ;111型仅含有ARF6。ARF6 作为一种特殊亚型，定位于细胞膜和胞内体。ARF6的生物学功能主要包括，调节细胞内吞、 质膜运输和细胞骨架重排。近年来发现ARF6还具有促进黑色素瘤细胞迀移、乳腺癌细胞侵 袭和胶质瘤细胞增殖的功能。像其他小GTP酶一样，ARF6在有活性的GTP和无活性的GDP 两种结合构象之间转换，其中ARF6 ·⑶P到ARF6 *GTP的转换需要鸟苷酸交换因子（guanine nucleotide exchange factors, GEFs)的催化。近年来研究表明，GEF蛋白家族中能催化 ARF6的⑶P/GTP的转化的交换因子有三种，分别是Cytohesin、EFA6和BRAG。三种蛋白都 包含Sec7结构域。Sec7是一个大约有200个氨基酸长度的催化结构域，与ARF6的GTP酶 活性密切相关。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种新型的重组Cytohesin诘抗多肽TAT_Sec7及其制备方 法，该重组多肽具有拮抗ARNO/Cytohesin与ARF6的结合或催化，从而抑制ARF6的活化特 性。该重组多肽融合蛋白可用于制备治疗肿瘤转移的药物。
[0005] 本发明所提供的重组Cytohesin诘抗多肽TAT_Sec7,其氨基酸序列如Seq ID No. 1所示。
[0006] 本发明所提供编码所述重组Cytohesin拮抗多肽TAT_Sec7的基因如Seq ID No. 2 所示。
[0007] 本发明含有编码所述重组Cytohesin拮抗多肽基因的载体，为含有T7启动子的原 核表达载体pET_20b。
[0008] 本发明含有编码所述重组Cytohesin拮抗多肽的工程菌，为大肠杆菌BL21 (DE3)。
[0009] 本发明所述重组Cytohesin诘抗多肽的制备方法，是通过在编码所述Cytohesin 基因 Sec7片段的5'端添加穿膜肽的基因序列，从而形成融合基因，将该融合基因克隆至原 核表达载体并在大肠杆菌细胞中进行诱导表达，然后进行蛋白质分离纯化获得融合蛋白。
[0010] 应当理解，本领域技术人员可以根据密码子的兼并性以及在不同物种中的表达偏 好，合成相应的核苷酸序列，并将其克隆到适当的表达载体中，并转化相应的宿主。
[0011] 本发明实验方案，以pET-20b为表达载体，BL21(DE3)作为宿主，制备重组 Cytohesin诘抗多肽的具体步骤如下：
[0012] 1)设计引物，以K562细胞cDNA为模板，扩增出Sec7序列。
[0013] 2)构建重组表达载体：通过PCR方法扩增融合基因，亚克隆至原核表达载体 pET_20b中，转化大肠杆菌DH5a，挑选重组子，通过测序验证重组表达质粒。
[0014] 3)培养转化后的宿主细胞，诱导表达重组Cytohesin拮抗多肽：将重组表达质粒 转化至大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，氨苄青霉素抗性平板筛选阳性转化子，将筛选的 阳性重组菌BL21 (DE3)/pET-20b-Sec7单菌落，接种到LB培养基中，37°C振荡培养16h。然 后按5%比例转接到新鲜LB培养基中，进行温度、IPTG浓度和诱导时间等表达条件的优化， 经研究证实，OD值为0. 6时，ImM IPTG在37°C诱导3h，超声波（100w，超声2s，间隔2s)破 菌，适于重组Cytohesin诘抗多肽的高表达。
[0015] 4)分离纯化重组Cytohesin诘抗多肽：收集菌体，破碎后离心，收集上清，进行亲 和层析，再经洗涤、脱盐，即得重组Cytohesin拮抗多肽融合蛋白。
[0016] 本发明中所述载体、宿主菌等均可由商业途径获得，如pET-20b和BL21(DE3)购自 Novagen 公司。
[0017] 本发明中涉及的基因的克隆，表达载体的构建，DNA序列分析及鉴定，以及表达 产物的分离和纯化等操作，可按照本领域已知的技术进行（参见Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Mannual，Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor，NY，1989)。
[0018] 在本研究中，我们根据Cytohesin中Sec7结构域能调控ARF6-GTP复合物形成的 特点，制备重组多肽来拮抗ARNO/Cytohesin与ARF6的结合或催化，从而抑制ARF6的活化。 为了使多肽能够穿过细胞膜，在设计上，我们在多肽的N端融合了一种TAT穿膜肽序列；为 了保证重组融合多肽的分离纯化和鉴定，组氨酸标签（6His)被添加在C端。合成的基因序 列克隆至原核表达载体pET-20b中，通过IPTG诱导重组多肽表达，利用Ni-NTA亲和层析纯 化，最终获得纯度超过95%能够用于体内实验的重组多肽。利用该融合蛋白可用于制备靶 向肿瘤细胞的药物，去治疗重组Cytohesin表达过高或ARFs活性过强的肿瘤（如大肠癌、 胶质瘤、乳腺癌等），通过抑制肿瘤细胞增殖和迀移，起到抑制肿瘤生长、侵袭和转移的作 用。
【附图说明】
[0019] 图1为重组Cytohesin诘抗多肽融合基因设计模式图；
[0020] 图2为重组Cytohesin诘抗多肽原核表达载体的鉴定图；
[0021] 图3为SDS-PAGE电泳检测重组Cytohesin拮抗多肽的诱导表达与可溶性分析图；
[0022] 图4为SDS-PAGE电泳检测重组Cytohesin拮抗多肽的蛋白纯化图；
[0023] 图5为重组Cytohesin诘抗多肽的Western Blot检测图；
[0024] 图6为CCK实验检测重组Cytohesin拮抗多肽对肿瘤细胞系的抑制作用图。
【具体实施方式】
[0025] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0026] 实施例1
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