专利名称：从中药决明子中提取蒽醌类化合物的方法
技术领域：
本发明涉及一种从中药决明子(Cassia obtusifolia L.)中提取蒽醌类化合物的方法。即从中药决明子中提取大黄素-1-O-β-龙胆二糖甙、大黄酚-1-O-β-龙胆二糖甙、大黄素甲醚-8-O-β-龙胆二糖甙和大黄酚-1-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖甙四种蒽醌类化合物。
背景技术：
决明子为豆科植物决明Cassia obtusifolia L.或小决明Cassia tora L.的干燥成熟种子，为临床常用中药。大量的研究表明决明子水煎剂以及乙醇、正酊醇、乙酸乙酯等有机溶剂的提取物、决明子浸膏等均有明显的降脂作用。进一步的研究认为决明子降脂的主要成分有蒽醌类、决明子苷B、蛋白质等。但其降脂的有效成分却仍不清楚，尚未见有具体化学结构的降脂成分报道。
决明子的化学成分主要有蒽醌类、萘骈一吡酮类、蛋白质及氨基酸、脂肪酸、非皂化物质、糖和无机元素等。蒽醌类是决明子主要的药用成分之一，其含量约占1.2％左右。目前已从决明子中分离鉴定了20多种蒽醌类化合物。决明子的蒽醌苷元中主要是大黄酚，含量为2.7‰(王清华，纪玲，丛保忠，宋伟静.高效液相色谱法测定决明子中大黄酚的含量。中医药学报，1996，548-49)。郝延军等首次从中国产决明中分得大黄酚、大黄素甲醚、大黄素、芦荟大黄素、橙黄决明素、大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷6个蒽醌类化合物(郝延军，桑育黎，赵余庆.决明子蒽醌类化学成分研究，中草药，2003，3418-19)。
决明子的化学成分非常复杂，目前常用的分离方法主要有浸出法、萃取法、色谱法等。使用这些方法很难把决明子中的化学成分完全分离出来，而且较难得到单体化合物。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种从中药决明子中提取蒽醌类化合物单体的方法，通过该方法可以获得大黄素-1-O-β-龙胆二糖甙、大黄酚-1-O-β-龙胆二糖甙、大黄素甲醚-8-O-β-龙胆二糖甙、大黄酚-1-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖甙四种蒽醌类化合物，这对决明子在降脂作用中的进一步开发利用具有重要的意义。
为了达到本发明的目的，本方法采用溶剂分部提取、大孔树脂吸附以及硅胶层析对中药决明子进行分离，并通过理化性质分析和波谱解析鉴定了4个化合物，其中大黄素-1-O-β-龙胆二糖甙为新的蒽醌类化合物，大黄酚-1-O-β-龙胆二糖甙和大黄酚-1-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖甙系首次从决明子中分离得到。
具体的讲，本发明方法包括如下步骤(1)将中药决明子磨成粉末，采用溶剂分部提取法，按照极性由小至大依次以溶剂环己烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇、水在索氏提取仪中各回流提取4-6次，每次所用的溶剂体积为中药粉末体积的1.5-2.5倍，每次提取时间为40-80min，温度为60±5℃；合并每一分步骤中的提取液，回收溶剂，得到水提物；(2)将步骤(1)得到的水提物溶于5.0-10.0倍体积的蒸馏水中，过滤去除不溶物，溶于水部分用正丁醇萃取4-8次，每次萃取所用体积为水溶液体积的0.5-1.5倍，每次萃取时间为20-40min，合并萃取液，挥干溶剂，得到的混合物用3.0-8.0倍体积的95％乙醇溶解，分离出不溶于95％乙醇的混合物；(3)将步骤(2)得到的不溶于95％乙醇的混合物溶于3-5倍体积的蒸馏水中，滤去难溶的杂质，溶液部分流经大孔吸附树脂柱；吸附在柱上的有效部分依次采用95％的乙醇、水进行洗脱至无色，收集乙醇洗脱液，浓缩得乙醇洗脱物；(4)用100～200目硅胶柱分离步骤(3)得到的乙醇洗脱物，采用氯仿—甲醇—水洗脱系统；调整洗脱系统中氯仿∶甲醇＝4∶1的体积，得到的混合物经硅胶层析，采用乙酸乙酯∶95％乙醇＝4∶1.5的体积洗脱，得到的混合物进一步经聚酰胺柱层析，甲醇∶水＝2∶3的体积洗脱得到蒽醌类化合物II和蒽醌类化合物III；调整洗脱系统中氯仿∶甲醇＝3∶1的体积，得到的混合物经硅胶柱反复层析，采用乙酸乙酯∶95％乙醇＝3-5∶1.0-2.0的体积洗脱，得到蒽醌类化合物I；调整洗脱系统中氯仿∶甲醇∶水＝3∶1∶0.1的体积，得到的混合物经聚酰胺柱层析，用甲醇∶水＝2∶3的体积洗脱得到的混合物进一步经凝胶柱层析、水洗脱得到蒽醌类化合物IV。
通过本领域通用的理化性质分析和波谱(MS，IR，UV，NMR)解析鉴定，确认所述蒽醌类化合物I为大黄素-1-O-β-龙胆二糖甙、蒽醌类化合物II为大黄酚-1-O-β-龙胆二糖甙、蒽醌类化合物III为大黄素甲醚-8-O-β-龙胆二糖甙蒽醌类化合物IV为大黄酚-1-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖甙。
在步骤(1)中，本发明所用决明子可以从普通中药房购得，使用时先磨成粉末，过100-200目筛。在所有溶剂中，每次提取时间最好为55-65min，每次提取溶剂的体积以药品体积的2.0倍为佳。每换另一种溶剂提取时，残渣均必须挥干溶剂。
在步骤(2)中，正酊醇的萃取在室温下进行，每次萃取体积以样品溶液体积的0.5倍为佳，每次萃取时间以25min为佳；加入95％乙醇后最好充分摇匀、放置20min，沉淀析出部分即为不溶于95％乙醇的混合物，命名为混合物C。
在步骤(3)、(4)、(5)中大孔吸附树脂介质依次用丙酮—乙醇—水冲洗干净后，再装柱。分离纯化所用的溶剂以分析纯为佳，大孔树脂、硅胶、聚酰胺以及凝胶的用量均视样品的量而定。
在本发明所获得的四种蒽醌类化合物中，大黄素-1-O-β-龙胆二糖甙为新化合物，大黄酚-1-O-β-龙胆二糖甙和大黄酚-1-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖甙系首次从决明子中分离得到。经鉴定，大黄素-1-O-β-龙胆二糖甙的分子式为C27H30O15；其它三种化合物鉴定的分子式分别为C27H30O14(II)、C28H32O15(III)及C33H40O19(IV)。四种蒽醌类化合物的平面结构图为 化合物IR1＝glc(1→6)glc，R2＝OH，R3＝H化合物II R1＝R2＝H，R3＝glc(1→6)glc化合物III R1＝H，R2＝OCH3，R3＝glc(1→6)glc化合物IV R1＝glc(1→3)glc(1→6)glc，R2＝R3＝H本发明与现有技术相比具有如下优点(1)采用溶剂分部法提取决明子降脂有效成分；(2)首次从决明子中分离得到新化合物大黄素-1-O-β-龙胆二糖甙；大黄酚-1-O-β-龙胆二糖甙和大黄酚-1-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖甙系首次从决明子中分离得到。
图1为本发明方法的总流程图；图2为本发明步骤(1)流程图；
图3为本发明步骤(2)流程4为本发明步骤(3)、(4)和(5)流程图。
具体的实施方式图1为本发明提取分离决明子蒽醌类化合物的总流程图，从图中可以看出，本发明包括(1)分部提取、(2)不溶于95％乙醇的混合物的制备、(3)大孔树脂分离纯化不溶于95％乙醇的混合物、(4)硅胶柱分离纯化乙醇洗脱物和蒽醌类化合物的分离、纯化。
实施例1图2为本发明步骤(1)——决明子溶剂分部提取程序图。本例中所用决明子购于药房，安徽产。取决明子500g，磨成粉末，过100-200目筛。采用溶剂分部提取法，按照极性由小至大顺序依次以溶剂(环己烷—氯仿—乙酸乙酯—正丁醇—乙醇—水)在索氏提取仪中各回流提取5次，合并每一分步骤的提取液，回收溶剂，得到该分步骤的相应提取物。每次所用的溶剂体积为决明子粉的2倍左右。每次回流提取时间为60min。每换另一种溶剂提取时，残渣均必须挥干溶剂。动物实验结果表明决明子粉及其乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、乙醇提取物和水提取物对高脂血症动物模型的形成均具有明显的预防作用，以水提物的作用最佳，因此选取水提物进行下一步的分离。
图3为本发明步骤(2)——决明子混合物C的制备流程图。将步骤(1)中的水提物溶于10倍体积的蒸馏水中，过滤去除不溶物，溶于水部分用正丁醇萃取6次，每次萃取体积为水溶液的0.5倍，每次萃取时间为30min，合并萃取液，挥干溶剂，得混合物A；将混合物A用3倍体积的95％乙醇充分溶解，分离出不溶于95％乙醇的混合物C。动物实验结果表明混合物C对高脂血症具有显著的治疗作用。
图4为本发明步骤(3)、(4)、(5)——决明子蒽醌类化合物的分离与纯化示意图。如步骤(3)、(4)、(5)所示将混合物C充分溶于3倍体积的蒸馏水中，滤去难溶的杂质，溶液部分流经大孔吸附树脂柱。吸附在柱上的有效部分依次采用95％的乙醇、水进行洗脱至无色，分别收集乙醇和水部分的洗脱液，浓缩，得干物质。乙醇洗脱所得物质远多于水洗脱部分，活性检测结果表明乙醇洗脱物具有较明显的降脂作用。因此收集乙醇洗脱物进行下一步的分离纯化。
乙醇洗脱物分别用硅胶(100～200目)柱层析(氯仿—甲醇—水为洗脱系统)，凝胶柱(水洗脱)以及聚酰胺柱层析(甲醇—水为洗脱系统)，分得化合物I～IV。通过本领域通用的理化性质分析和波谱(MS，IR，UV，NMR)解析鉴定了化合物I为大黄素-1-O-β-龙胆二糖甙、化合物II为大黄酚-1-O-β-龙胆二糖甙、化合物III为大黄素甲醚-8-O-β-龙胆二糖甙和化合物IV为大黄酚-1-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖甙。其中I为新化合物，II和IV系首次从决明子中分离得到。
实施例2其它同实施例1，所不同的是步骤(1)中决明子1000g，在索氏提取仪中各回流提取4次，每次所用的溶剂体积为决明子粉的2.5倍，每次提取时间为40min；步骤(2)中将水提物溶于5倍体积的蒸馏水中，溶于水部分用正丁醇萃取8次，每次萃取体积为水溶液体积的1倍，每次萃取时间为40min，合并萃取液，挥干溶剂，得混合物A。将混合物A用5倍的95％乙醇充分溶解，分离出不溶于95％乙醇的混合物C；步骤(3)中将混合物C充分溶于4倍的蒸馏水中，溶液部分流经大孔吸附树脂柱，吸附在柱上的有效部分依次采用95％的乙醇、水进行洗脱至无色，收集乙醇洗脱液，浓缩，得乙醇洗脱物。结果获得所需的化合物。
实施例3其它同实施例1，所不同的是步骤(1)中决明子1500g，在索氏提取仪中各回流提取6次，每次所用的溶剂体积为决明子粉的1.5倍。每次提取时间最佳为80min；步骤(2)中将水提物溶于7.5倍体积的蒸馏水中，溶于水部分用正丁醇萃取4次，每次萃取体积为水溶液体积的1.5倍，每次萃取时间为20min，合并萃取液，挥干溶剂，得混合物A。将混合物A用8倍的95％乙醇充分溶解，分离出不溶于95％乙醇的混合物C；步骤(3)中将混合物C充分溶于3倍的蒸馏水中，溶液部分流经大孔吸附树脂柱，吸附在柱上的有效部分依次采用95％的乙醇、水进行洗脱至无色，收集乙醇洗脱液，浓缩，得乙醇洗脱物。结果获得所需的化合物。
权利要求
1.一种从中药决明子中提取蒽醌类化合物的方法，其特征在于包括如下步骤(1)将中药决明子磨成粉末，采用溶剂分部提取法，按照极性由小至大依次以溶剂环己烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇、水在索氏提取仪中各回流提取4-6次，每次所用的溶剂体积为中药决明子粉末体积的1.5-2.5倍，每次提取时间为40-80min，温度为60±5℃；合并提取液，回收溶剂，得到水提物；(2)将步骤(1)得到的水提物溶于5.0-10.0倍体积的蒸馏水中，过滤去除不溶物，溶于水部分用正丁醇萃取4-8次，每次萃取所用体积为水溶液体积的0.5-1.5倍，每次萃取时间为20-40min，合并萃取液，挥干溶剂，得到的混合物用3.0-8.0倍体积的95％乙醇溶解，分离出不溶于95％乙醇的混合物；(3)将步骤(2)得到的不溶于95％乙醇的混合物溶于3-5倍体积的蒸馏水中，滤去难溶的杂质，溶液部分流经大孔吸附树脂柱；吸附在柱上的有效部分依次采用95％的乙醇、水进行洗脱至无色，收集乙醇洗脱液，浓缩得乙醇洗脱物；(4)用100～200目硅胶柱分离步骤(3)得到的乙醇洗脱物，采用氯仿—甲醇—水洗脱系统；调整洗脱系统中氯仿∶甲醇＝4∶1的体积，得到的混合物经硅胶层析，采用乙酸乙酯∶95％乙醇＝4∶1.5的体积洗脱，得到的混合物进一步经聚酰胺柱层析，甲醇∶水＝2∶3的体积洗脱得到蒽醌类化合物II和蒽醌类化合物III；调整洗脱系统中氯仿∶甲醇＝3∶1的体积，得到的混合物经硅胶柱反复层析，采用乙酸乙酯∶95％乙醇＝3-5∶1.0-2.0的体积洗脱，得到蒽醌类化合物I；调整洗脱系统中氯仿∶甲醇∶水＝3∶1∶0.1的体积，得到的混合物经聚酰胺柱层析，用甲醇∶水＝2∶3的体积洗脱得到的混合物进一步经凝胶柱层析、水洗脱得到蒽醌类化合物IV；所述蒽醌类化合物I为大黄素-1-O-β-龙胆二糖甙；蒽醌类化合物II为大黄酚-1-O-β-龙胆二糖甙；蒽醌类化合物III为大黄素甲醚-8-O-β-龙胆二糖甙；蒽醌类化合物IV为大黄酚-1-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖甙。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中，所用决明子使用时先磨成粉末，过100-200目筛，每次溶剂提取时间为55-65min，每次提取溶剂的体积为中药决明子粉末体积的2.0倍。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于在步骤(2)中，正酊醇的萃取在室温下进行，每次萃取体积为样品体积的0.5倍，每次萃取时间为25min；加入95％乙醇后充分摇匀、放置20min，沉淀析出部分即为不溶于95％乙醇的混合物。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于在步骤(3)(4)、(5)中，大孔吸附树脂介质依次用丙酮—乙醇—水冲洗干净后，再装柱。
全文摘要
本发明涉及从中药决明子中提取蒽醌类化合物的方法，包括(1)分部提取、(2)不溶于95％乙醇的混合物的制备、(3)大孔树脂分离纯化不溶于95％乙醇的混合物、(4)硅胶柱分离纯化乙醇洗脱物和蒽醌类化合物的分离、纯化；得到降脂有效成分大黄素－1－O－β－龙胆二糖甙、大黄酚－1－O－β－龙胆二糖甙、大黄素甲醚－8－O－β－龙胆二糖甙、大黄酚－1－O－β－D－吡喃葡萄糖基－(1→3)－β－D－吡喃葡萄糖基－(1→6)－β－D－吡喃葡萄糖甙。
文档编号C07C46/10GK1733679SQ20051003685
公开日2006年2月15日 申请日期2005年8月30日 优先权日2005年8月30日
发明者李楚华, 李续娥, 郭宝江 申请人:华南师范大学