专利名称：中药决明子蛋白质的提取方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药有效成分的提取纯化方法，具体是一种分子量为19680的中药决明子(Cassiaobtusifolia L.)蛋白质的提取方法，本发明还涉及所述蛋白质在制备降脂药物中的应用。
背景技术：
决明子为豆科植物决明Cassia obtusifolia L.或小决明Cassia tora L.的干燥成熟种子，具有祛风散热，清肝明目，润肠通便，降压降脂的功能，是临床常用中药。决明子蛋白质的总含量达18.56-22.93％，是主要的药用部分。实验证明，大豆蛋白对实验性高脂血症动物模型确有降脂功效(Hege W，.et al.Fish protein hydrolysate reduces plasma total cholesterol，increase the proportion of HDLcholesterol，and lowers acyl-CoAcholesterol acyltransferase activity in liver of Zucher rats.The Journal ofnutrients.2004，1341320-1327)。但对决明子具体的组成以及其作用的机制却未见文献报道，资料查阅也未见有关于决明子蛋白质性质及其功能方面的文献报道。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种分子量为19680的中药决明子蛋白质的提取方法。
本发明的目的还在于提供所述蛋白质在制备降脂药物中的应用。
为了达到本发明的目的，本方法采用石油醚脱脂、硫酸铵沉淀、分子筛及离子交换柱层析方法提取分离得到该蛋白质，并通过SDS-PAGE电泳、等电聚焦电泳、质谱解析、氨基酸测序以及圆二色(CD)光谱等方法鉴定了该蛋白质的生化性质及预测了其二级结构，同源序列分析证明该蛋白质为一新的蛋白质。两性霉素B细胞法证明该蛋白质具有抑制胆固醇合成的功效。
本发明的中药决明子蛋白质的提取方法包括如下步骤(1)决明子粗蛋白的提取，包括——在4-8℃条件下，将决明子碾碎后用石油醚或环己烷浸泡脱脂24-48小时，分2-4次进行；——回收溶剂，残渣按1g∶10ml-1g∶50ml的体积浸泡于50mmol pH为8.0的KH2PO4-NaOH中8-12小时，重复3-5次，合并提取液；——提取液离心20-30min，取上清液；上清液边搅拌边加入硫酸铵至45％-55％的饱和度，离心分离，保留沉淀；沉淀物在分子量3,000-8,000的透析袋中进行脱盐；——冷冻干燥仪中-20℃至-80℃温度下进行冷冻干燥，得到粉末状决明子粗蛋白，-20℃冷藏备用；(2)决明子粗蛋白的提纯，包括——将上述方法得到的粉末状决明子粗蛋白充分溶解于15mmol-25mmol pH为7.0-8.0的Tris-HCl的缓冲液中；——用分子筛层析柱进行初步纯化，分子筛层析柱上样前先用含有0.15-0.3mol NaCl的上述缓冲液平衡2-5倍柱体积；每次上样量为180ul-240ul，监测波长为280nm，流速为0.3-0.7ml/min；决明子粗蛋白经分子筛层析被分成5个峰分别为peak1、peak2、peak3、peak4和peak5。
(3)决明子蛋白质peak2的分离纯化，包括用离子交换柱纯化peak2，离子交换柱按照A液与B液依次交替的程序平衡，A液为15mmol-25mmol PH为7.0-8.0的Tris-HCl，B液为含有1.0mol NaCl的A液；将peak2浓缩、脱盐，上样量为25mg-50mg/ml；柱子用0-1.0mol的NaCl梯度、15mmol-25mmol pH为7.0-8.0的Tris-HCl的缓冲液进行洗脱，流速为0.8-1.5ml/min；peak2经离子交换柱层析被分成3个峰，分别为peakI、peakII和peakIII，收集peakIII，得到本发明所需的决明子蛋白质。
所述决明子可以从普通药房购得。
步骤(1)中决明子最好先磨成粉末，石油醚脱脂时间以24小时为佳，分2次进行。
脱盐时，优选分子量3,000的透析袋，透析液为双蒸水，每6h更换一次透析液。
脱盐后，先在-20℃冰箱中冷冻24小时，再转入冷冻干燥仪-60℃中冷冻干燥72小时。
在步骤(2)中，分子筛的再生可按0.1mol HCl→H2O→0.5mol NaOH→H2O→缓冲液的程序进行。
缓冲液以0.15mol NaCl、20mmol pH为7.0的Tris-HCl为最佳。
优选缓冲液平衡2倍柱体积；每次上样量最佳为200ul，监测波长为280nm，流速为0.5ml/min。
在步骤(3)中，离子交换柱的再生按0.1mol HCl→H2O→0.5mol NaOH→H2O→A液的程序进行。
缓冲液中A液以20mmol Tris-HCl(pH7.0)为佳。
柱子的平衡按照10mlA→20ml B→20mlA→20mlB→10ml A的程序进行，用0-1.0mol的NaCl梯度、20mmol pH7.0的Tris-HCl缓冲液洗脱，流速为1.0ml/min。
可以在盐浓度为0.3mol处洗脱下peakIII。
本发明方法所得peakIII采用下列方法进行蛋白质生化性质测定蛋白质peakIII生化性质及初级结构的测定SDS-PAGE及等电聚焦电泳用于鉴定该蛋白的纯度，并预测其分子量和等电点。SDS-PAGE电泳采用非连续的系统、垂直板进行，考马斯亮蓝G250染色。等电聚焦采用平板进行，载体两性电解质(ampholines)pH范围为2.5-5.0，Marker pH范围为2.5-6.5，电泳时间为6h。质谱分析测定蛋白质peakIII的分子量；peakIII经SDS-PAGE电泳后用垂直板法电转移到PVDF膜上进行蛋白质N-端序列测定；圆二色谱在CD光谱仪上进行，二级结构的比例根据Microcal Origin软件计算而得。
结果证明本发明所获得的决明子蛋白质分子量为19680，等电点为4.80，N-端氨基酸测序结果为IPYISASFPLNIEFLPSE，同源序列分析表明该蛋白不存在同源性的蛋白质，为一新的蛋白质。CD结果表明peakIII的α螺旋比例为12.5％，β折叠比例为55.6％，无规卷曲为31.9％。
实验证明，本发明方法所得新蛋白质能显著抑制细胞内胆固醇的合成，具有降脂的作用。测定方法及结果如下生理活性的测定本发明采用两性霉素B细胞法。细胞株用A液(RPMI1640培养基)稀释调整浓度为2×104/ml，每孔100ul接种于96孔板中，于37℃、5％CO2/95％大气中培养。每组设5-7个复孔。待细胞贴壁后换B液(A液去除小牛血清加入10％无脂蛋白血清)200ul。第2天换C液(B液分别加入不同剂量待测样品及阳性对照Simvastatin)200ul，继续培养24h，无脂蛋白血清清洗3次。加入D液(B液加入两性霉素300ug/ml)200ul培养8h后，无脂蛋白血清清洗3次。加入5mg/ml MTT10ul，继续培养4h，加入酸化的10％SDS 100ul终止反应。以分光光度计在570nm处检测吸光值。光密度值越高，表示细胞存活越多，样品抑制胆固醇生物合成的作用越强，降脂效果越显著。实验结果表明peakIII能显著抑制细胞内胆固醇的合成，具有降脂作用。
本发明与现有技术相比具有如下优点或效果(1)首次从决明子中分离得到一种新的蛋白质，并对该蛋白进行化学性质及初级结构的测定该蛋白的等电点为4.80，分子量为19680，N-端测序结果为IPYISASFPLNIEFLPSE，CD结果表明peakIII的α螺旋比例为12.5％，β折叠比例为55.6％，无规卷曲为31.9％。蛋白质数据库(PDB)搜索证明该蛋白缺乏同源蛋白，为一新的蛋白质。
(2)采用两性霉素B细胞法，对决明子新蛋白的活性进行测定，结果表明该蛋白能显著抑制细胞内胆固醇的合成，具有明显的降脂作用。
图1为本发明决明子蛋白质提取方法的总流程图；图2为本发明方法步骤(1)的决明子粗蛋白提取流程图；图3为本发明方法步骤(2)纯化所得决明子粗蛋白的分子筛层析图；图4为本发明方法步骤(3)分离纯化所得决明子蛋白质peak2的离子交换柱层析图。
具体的实施方式如图1所示，本发明的方法包括步骤(1)——决明子粗蛋白提取流程图、步骤(2)——决明子粗蛋白的初步纯化图、步骤(3)——决明子蛋白质peak2分离纯化图、步骤(4)——蛋白质peakIII生化性质及初级结构的测定和步骤(5)——生理活性的测定五步骤。
实施例1按照图1、2流程，本例所用决明子购于药房，安徽产。提取过程均在4℃条件下进行。决明子(1000g)充分碾碎后用石油醚浸泡24h脱脂，分2次进行。回收溶剂，残渣以1g∶10ml的体积浸泡于50mmol KH2PO4-NaOH(pH8.0)中10h，重复3次，合并提取液。提取液于12,000r/min高速离心20min，取上清。上清液边搅拌边加入硫酸铵至50％的饱和度。与上述同样条件下高速离心，保留沉淀。沉淀物在分子量3,000的透析袋中进行脱盐，透析液为双蒸水，每6h更换一次透析液。待样品充分脱盐后，先在-20℃冰箱中冷冻24小时，再转入冷冻干燥仪(-80℃)中冷冻干燥72小时，得粉末状样品。粉末状粗蛋白储于-20℃冰箱中，备用。
将步骤(1)中的粗蛋白粉末充分溶解于20mmol Tris-HCl(pH7.0)的缓冲液中，使用分子筛层析柱对粗蛋白进行分离。柱子用0.15mol NaCl、20mmol Tris-HCl(pH7.0)的缓冲液平衡2倍柱体积。每次上样量约为200ul，用0.15mol NaCl、20mmol Tris-HCl(pH7.0)的缓冲液进行洗脱，监测波长为280nm，流速为0.5ml/min。如图3所示，决明子粗蛋白经分子筛Superdex 75分离得到5个peaks。
生理活性测定的结果表明peak2的降脂活性最强。SDS-PAGE电泳结果表明peak2不是均一组分。因此，收集peak2进一步浓缩、脱盐进行下一步的纯化。
使用离子交换柱对peak2进行纯化。离子交换柱Resource Q按照10mlA→20ml B→20ml A→20mlB→10ml A的程序进行平衡。A液20mmol Tris-HCl(pH7.0)；B液1mol NaCl、20mmolTris-HCl(pH7.0)。将peak2浓缩、脱盐，上样量为25mg-50mg/ml，用0-1.0mol的NaCl梯度、20mmolTris-HCl(pH7.0)的缓冲液洗脱，流速为1.0ml/min。如图4所示，Resource Q把peak2洗脱分离成3个peakspeakI、peakII和peakIII，其中peakIII为主要成分，在盐浓度为30％处洗脱下来。
SDS-PAGE电泳及等电聚焦电泳结果表明peakIII具有均一的组分。因此收集peakIII进一步浓缩、脱盐，用于生化特性及生理功能的测定。
决明子蛋白质peakIII生化性质及初级结构的测定SDS-PAGE电泳采用非连续的系统、垂直板进行，考马斯亮蓝G250染色。凝胶终浓度为15％，Marker为小牛血清白蛋白。等电聚焦采用平板进行，载体两性电解质(ampholines)pH范围为2.5-5.0，Marker pH范围为2.5-6.5。循环水浴温度为8℃。电极液阳极为1mol H3PO4，阴极为1mol NaOH。电参数上限电压为1500V，上限电流为15mA，上限功率为8W，电泳时间为6h。质谱分析在MALDI-TOF质谱仪上进行，peakIII充分脱盐，浓度为5mg/ml，上样量为20ul。脱盐后的peakIII经SDS-PAGE电泳后用垂直板法电转移到PVDF膜上进行蛋白质N-端序列测定。圆二色谱在CD光谱仪上进行测定，被测样品浓度为5ug/ml，采用100ul液池。灵敏度100m deg，清晰度1nm，带宽1.0nm，190-260nm扫描累加3次。二级结构的比例根据Microcal Origin软件计算而得。
结果证明决明子蛋白质peakIII分子量为19680，等电点为4.80，N-端氨基酸测序结果为IPYISASFPLNIEFLPSE，同源序列分析表明该蛋白不存在同源性的蛋白质，为一新的蛋白质。CD结果表明peakIII的α螺旋比例为12.5％，β折叠比例为55.6％，无规卷曲为31.9％。
决明子蛋白质peakIII生理活性的测定本发明采用两性霉素B细胞法进行。首先是细胞培养液的制备A液RPMI1640培养基(含谷氨酰胺300ug/ml及10％小牛血清)；B液A液去除小牛血清加入10％无脂蛋白血清；C液B液分别加入不同剂量待测样品及阳性对照(Simvastatin)；D液B液加入两性霉素300ug/ml。实验操作过程中国仓鼠卵细胞(CHO)直接用A液稀释调整细胞浓度为2×104/ml，每孔100ul接种于96孔板中，于37℃、5％CO2/95％大气中培养。每组设5-7个复孔。待细胞贴壁后换B液(200ul)。第2天换C液(200ul)，继续培养24h，无脂蛋白血清清洗3次。加入D液(200ul)培养8h后，无脂蛋白血清清洗3次。加入5mg/ml MTT 10ul，继续培养4h，加入酸化的10％SDS 100ul终止反应。以岛津UV-1206分光光度计在570nm处检测吸光值。光密度值越高，表示细胞存活越多，样品抑制胆固醇生物合成的作用越强。
实验结果如表1所示，表明决明子新蛋白peakIII能显著抑制细胞内胆固醇的合成，具有降脂的作用。
表1 决明子蛋白质peakIII对细胞内胆固醇生物合成的影响(M±SD)
与空白对照组比较，**P＜0.01，*P＜0.05。蛋白浓度为5mg/ml，Simvastain浓度为2mg/ml。
实施例2其它同实施例1，所不同的是步骤(1)中决明子(500g)充分碾碎后用石油醚浸泡36h脱脂，分3次进行。残渣以1g∶25ml的体积浸泡于50mmol KH2PO4-NaOH(pH8.0)中12h，重复4次。提取液高速离心25min，上清液加入硫酸铵至45％的饱和度，高速离心后，沉淀物在分子量5,000的透析袋中进行脱盐。脱盐后，先在-20℃冰箱中冷冻16小时，再转入冷冻干燥仪(-50℃)中冷冻干燥72小时；步骤(2)中的粗蛋白溶解于15mM Tris-HCl(pH7.5)的缓冲液中。分子筛柱子用0.2mol NaCl、15mmol Tris-HCl(pH7.5)的缓冲液平衡3倍柱体积。每次上样量约为240ul，流速为0.3ml/min；步骤(3)中A液15mmol Tris-HCl(pH7.5)；B液1mol NaCl、15mmol Tris-HCl(pH7.5)。流速为1.5ml/min。结果获得所需的蛋白质，采用相同方法测定蛋白质的生化性质及生理活性，其各项参数与实施例1相同。
实施例3其它同实施例1，所不同的是步骤(1)中决明子(2000g)充分碾碎后用石油醚浸泡48h脱脂，分4次进行。残渣以1g∶50ml的体积浸泡于50mmol KH2PO4-NaOH(pH8.0)中8h，重复5次。提取液高速离心30min，上清液加入硫酸铵至55％的饱和度，高速离心，沉淀物在分子量8,000的透析袋中进行脱盐。脱盐后在冷冻干燥仪(-65℃)中冷冻干燥72小时；步骤(2)中的粗蛋白溶解于25mmol Tris-HCl(pH8.0)的缓冲液中。分子筛柱子用0.3mol NaCl、25mmol Tris-HCl(pH8.0)的缓冲液平衡5倍柱体积。每次上样量约为180ul，流速为0.7ml/min；步骤(3)中A液25mmolTris-HCl(pH8.0)；B液1mol NaCl、25mmol Tris-HCl(pH8.0)。流速为0.8ml/min。结果获得所需的蛋白质，采用相同方法测定蛋白质的生化性质及生理活性，其各项参数与实施例1相同。
所用药品均为分析纯，购于Sigma生物技术有限公司。
权利要求
1.一种中药决明子蛋白质的提取方法，其特征在于包括如下步骤(1)决明子粗蛋白的提取，包括——在4-8℃条件下，将决明子碾碎后用石油醚或环己烷浸泡脱脂24-48小时，分2-4次进行；——回收溶剂，残渣按1g∶10ml-1g∶50ml的体积浸泡于50mmol pH为8.0的KH2PO4-NaOH中8-12小时，重复3-5次，合并提取液；——提取液离心20-30min，取上清液；上清液边搅拌边加入硫酸铵至45％-55％的饱和度，离心分离，保留沉淀；沉淀物在分子量3,000-8,000的透析袋中进行脱盐；——冷冻干燥仪中-20℃至-80℃温度下进行冷冻干燥，得到粉末状决明子粗蛋白，-20℃冷藏备用；(2)决明子粗蛋白的提纯，包括——将上述方法得到的粉末状决明子粗蛋白充分溶解于15mmol-25mmol pH为7.0-8.0的Tris-HCl的缓冲液中；——用分子筛层析柱进行初步纯化，分子筛层析柱上样前先用含有0.15-0.3mol NaCl的上述缓冲液平衡2-5倍柱体积；每次上样量为180ul-240ul，监测波长为280nm，流速为0.3-0.7ml/min；决明子粗蛋白经分子筛层析被分成5个峰分别为peak1、peak2、peak3、peak4和peak5；(3)决明子蛋白质peak2的分离纯化，包括用离子交换柱纯化peak2，离子交换柱按照A液与B液依次交替的程序平衡，A液为15mmol-25mmol pH为7.0-8.0的Tris-HCl，B液为含有1.0mol NaCl的A液；将peak2浓缩、脱盐，上样量为25mg-50mg/ml；柱子用0-1.0mol的NaCl梯度、15mmol-25mmol pH为7.0-8.0的Tris-HCl的缓冲液进行洗脱，流速为0.8-1.5ml/min；peak2经离子交换柱层析被分成3个峰，分别为peakI、peakII和peakIII，收集peakIII。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中，决明子先磨成粉末再脱脂，石油醚脱脂时间为24小时，分2次进行。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤(1)中，脱盐时，选分子量3,000的透析袋，透析液为双蒸水，每6小时更换一次透析液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(1)中，脱盐后，先在-20℃冰箱中冷冻24小时，再转入冷冻干燥仪-60℃中冷冻干燥72小时。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤(2)中，分子筛的再生按0.1mol HCl→H2O→0.5mol NaOH→H2O→缓冲液的程序进行，采用缓冲液是0.15mol NaCl、20mmol pH为7.0的Tris-HCl。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于步骤(2)中，选缓冲液平衡2倍柱体积，每次上样量为200ul，监测波长为280nm，流速为0.5ml/min。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于步骤(3)中，离子交换柱的再生按0.1mol HCl→H2O→0.5mol NaOH→H2O→A液的程序进行；缓冲液中A液为20mmol Tris-HCl，pH为7.0。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于步骤(3)中，柱子的平衡按照10ml A→20ml B→20ml A→20ml B→10ml A的程序进行，用0-1.0mol的NaCl梯度、20mmol pH 7.0的Tris-HCl缓冲液洗脱，流速为1.0ml/min。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于步骤(3)中，在盐浓度为0.3mol处洗脱得到中药决明子蛋白质。
10.权利要求1所述方法制备的中药决明子蛋白质在制备降脂药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及分子量为19680的中药决明子蛋白质的提取方法，包括决明子粗蛋白的提取；决明子粗蛋白的提纯；决明子蛋白质peak2的分离纯化；得到的蛋白质能显著抑制细胞内胆固醇的合成，具有明显的降脂作用；本发明还涉及所述中药决明子蛋白质在制备降脂药物中的应用。
文档编号A61P3/00GK1733801SQ20051003685
公开日2006年2月15日 申请日期2005年8月30日 优先权日2005年8月30日
发明者李楚华, 李续娥, 郭宝江 申请人:华南师范大学