专利名称：蒲葵的抗肿瘤提取物及其制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种从植物中提取中药有效抗肿瘤成分的方法，特别是以蒲葵(包括果实、茎、根、叶)植物为原料提取抗肿瘤有效成分的方法以及应用。
背景技术：
恶性肿瘤是危害人类健康和生命的主要疾病。据估计全世界每年约有500万左右的人死于恶性肿瘤。近20多年来，由于生态环境的不断恶化，人们生活的紧张和不规律，以及疾病的传播，恶性肿瘤的发病率呈上升趋势，并成为继心血管疾病之后的第二大致死病因。因此，全球每年投入大量的人力物力用于研究开发防治癌症的新药物。近年来，药物学专家除了研究西药以外，也对中药进行了很多研究，对恶性肿瘤形成的机理也进行了探讨，组合化学、基因工程等先进技术的发明和应用加速了对恶性肿瘤药物开发进程。特别是目前以天然活性成分为先导化合物寻找新药有广阔的发展前景。迄今为止至少已评估了4万余种高等植物的抗肿瘤活性。据国外资料介绍，全世界已经开发了几百种抗癌新药，其中有很多种属于天然植物提取物，近几年，国内的研究人员对传统中药和民间草药的抗癌作用进行了广泛而深入的研究，并相继发现了一大批具有抗癌作用的植物和生物，如太平洋紫杉、中国红豆杉、蒲葵、艾蒿、银杏、喜树、灵芝、大叶菜、蛇床子、淡竹叶、茅菊、牛黄、山慈菇、马鞭草、夏枯草、仙鹤草、泽漆、五倍子、无花果、甜菜(根)、拓树根、大载、桧皮栎、接骨木、蜂胶、板蓝根、白烨皮、意苡仁、黄茂、山香草等，人们从这些植物分离出了有抗癌作用的活性成分。
在上述这些植物中，人们研究得较多的是红豆杉、喜树、灵芝、银含，但很多植物由于生长缓慢，资源贫乏，很难满足需求。而在南方，近年来人们开始对植物棕榈科蒲葵进行研究，发现蒲葵果实提取的物质具有预防和治疗癌症的成分，是一种高效、无毒的比较理想的抗癌药物。
蒲葵，为植物棕榈科蒲葵Livistona chinensis R.Br.，别名扇叶葵子、葵扇木子、蒲葵子，蒲葵为棕榈科葵属常绿乔木，一种野生或人工栽培的常绿乔木。它产于我国南部，广西、广东、福建等地，有多个品种，有的株高达30-50厘米，长于石灰石山区，有的株高达10-20米，单株直立。叶柄长约2米，有钩刺，干上裹棕皮，用于城市风景树，叶扇形，径约2米，深裂至中部，上部裂片条带状下垂。植株亭亭如盖，叶片飘柔如丝，为优美观叶植物。小苗叶丛密，冠形圆整，可作盆景或厅堂内绿化。大树可用行道树及植于水滨、庭院等处，为园林中常见的展景及遮荫树种。嫩叶可制葵扇，老叶供编织或者说覆盖荫棚、披屋；棕皮可作座垫、刷帚、蓑等等；柄亦可供编织或作牙签，经济价值颇高，其生长周期长，容易栽培，果实产量高，资源丰富。
据有关文献记载，从蒲葵(包括果实、根、叶)中提取有效成分，对肿瘤特别是恶性肿瘤病症有良好的治疗效果，一些药物研究部门已经将蒲葵作为抗肿瘤新药开发。
经过检索，我们查到公开出版物公开的有关蒲葵或以蒲葵为主要成分作为抗肿瘤药用的内容如下1、复生康胶囊质量标准的研究作者黄瑞松，叶云峰，苏青，胡秋萍，丘记珍，黄永灵机构广西民族医药研究所，广西兽药监察所，广西中医学院，刊名中草药.2003，34(8)文摘目的建立复生康胶囊质量控制方法。方法采用薄层色谱法对蒲葵子、喜树果和莪术进行定性鉴别，采用HPLC法测定喜树碱的含量。色谱条件为Dikma Diamonsil C18柱(250mm×4.6mm，5靘)；流动相甲醇-水(55∶45)；流速0.8mL/min；检测波长254nm。结果薄层色谱斑点清晰集中，喜树碱在0.0506～0.2530靏具有良好线性关系，平均回收率为96.90％，RSD-1.74％，(n＝6)。结论方法灵敏、准确、重现性好、专属性强，可作为复生康胶囊的质量控制标准。
2、一些单子叶木本植物鲜叶提取物清除DPPH自由基活性初探作者陆瑞利 胡丰林 许成林机构安徽农业大学，刊名生物学杂志.2003，20(6).文摘研究用二苯基苦基苯肼自由基酶标仪法，对常见的三十余种单子叶木本植物鲜叶的自由基清除活性进行了比较，发现不同科属、不同种植物鲜叶的80％甲醇提取物对DPPH自由基的清除活性有很大差异，其中供试的棕榈科7种植物鲜叶提取物，在相当于鲜叶浓度为2.5mg/ml于37℃下孵育20min时，对0.5mmol/L DPPH自由基清除率平均可达40.0％，而龙舌兰科5种植物平均仅为7.2％；刺葵、棕竹、筋头竹、蒲葵和棕榈等鲜叶有较强的自由基清除活性，它们在相当于鲜叶浓度为2.5mg/ml时的自由基清除率分别可达83.1％、79.2％、64.9％、60.5％和51.3％。这些树种有一定的开发潜力。
3、石上柏和蒲葵子对蛋白激酶C活性的影响作者黄才覃燕梅刊名中草药.1995，26(8).文摘采用DE52柱层析法部分纯化大鼠中的蛋白激酶C，研究了石上柏和蒲葵子醇提物对蛋白激酶C活性的影响。为了证明测定系统的可靠性，观察了多粘菌素B(已知蛋白激酶C抑制剂)对蛋白激酶C活性的影响。表明石上柏醇提物对蛋白激酶C有强烈的抑制作用，蒲葵子醇提物对蛋白激酶C的抑制率为66.6％，降低药物浓度抑制作用减弱；多粘菌素B对蛋白激酶C有抑制作用。
4、蒲葵中脂肪油的GC-MS联用分析作者何小玉，崔建国，黄初升，钟振国，机构广西师范学院化学系，广西中医学院，刊名化工技术与开发.2003，32(2).文摘采用GC-MS联用技术首次分析了蒲葵中脂肪油的组成，共分离出36个峰，并鉴定出其中的23种化合物。该脂肪油的主要成分为月桂酸乙酯、十六烷酸乙酯、亚麻酸、亚油酸乙酯、9-十八碳烯酸乙酯等。为蒲葵资源的开发利用提供了科学依据。研究表明，蒲葵籽对蛋白激酶C的活性有明显的抑制作用。蛋白激酶C的抑制剂对细胞增殖有抑制作用，一些临床上使用的抗癌药，如阿霉家等就是蛋白激酶C的抑制剂。我国南方民间用蒲葵籽治疗癌症(如鼻咽癌)，据称有相当的效果。同时，国内也有利用蒲葵籽经破细胞壁后提取的原粉制备抗癌剂的报道。国外巴基斯坦的Mala.V等人曾经对蒲葵籽的成分进行过研究，从中分离出一些多糖，氨基酸等，而目前国内还未发现对蒲葵的籽、根、叶中的有效成分进行分离，从中提取具有生理活性的化合物，并进行结构表征，生理活性试验及构效关系研究的报道。
5、中国专利<发明名称>用于治疗癌症的中药<申请人>张光新<国家省市>安徽(34)<联系地址>安徽省合肥市巢湖路287号安徽省科技厅大楼何梅生转<权利要求>用于治疗癌症的中药，其特征是具有如下各组分秋水仙、蒲葵、灵芝、长春花、喜树、三尖杉、鳄甲、半枝莲、龙葵、延胡索、斑蝥、白花蛇舌草、冬凌草、紫树、蚤休、魔芋。<摘要>用于治疗癌症的中药，其特征是具有如下各组分秋水仙、蒲葵、灵芝、长春花、喜树、三尖杉、鳄甲、半枝莲、龙葵、延胡索、斑蝥、白花蛇舌草、冬凌草、紫树、蚤休、魔芋。本发明可有效抑制癌细胞的扩散、杀灭癌细胞、抑制由于癌症引发的疼痛，减轻病人痛苦。
6、中国专利<发明名称>化瘤扶正丹<申请人>曾广盛、宁伟巍<国家省市>湖南(43)<联系地址>湖南省衡阳市中山南路24号大马嘶巷内衡阳市中医药学会专家门诊部<发明人>曾广盛<权利要求>一种化瘤扶正丹，其特征是制备原料中，按照天然牛黄0.5-1g、底珍20-30g、石耳10-20g、麦三七10-20g、蒲葵子10-20g、蟹甲1-2只、蛞蝓3-5条、西洋参5-10g、元寸0.1-0<摘要>一种化瘤扶正丹，将天然牛黄、底珍、石耳、麦三七、蒲葵子、蟹甲、蛞蝓、西洋参、元寸按一定比例混合，加工成粉末或取浓缩液而制取。具有清热解毒，活血化瘀，软坚散结，扶正祛邪功效，既治瘤化瘤，又辅助人体正气，增强机体活性，标本兼治，疗效明显，相比现有抗癌药物，具有延长人的寿命、减少死亡率的特效。无禁忌症，服用方便。
7、中国专利<发明名称>高效无毒纯天然抗癌剂申请(专利)号97100103.0<申请人>丁庆、丁录、丁鉴<国家省市>北京(11)<联系地址>北京市北京北京承泽园108楼404室<邮编>100871<发明人>丁庆、丁录<摘要>本发明涉及保健品与医药领域中对预防癌症、治疗癌症上的一个重要突破。本品是从天然或人工载培的棕榈科蒲葵果实中经破细胞壁后提取的原粉，具有丰富的营养物质，在临床上具有预防癌症、治疗癌症的特殊功能，并能有效地提高机体的免疫功能，无任何毒副作用。本发明还适用于生产蒲葵原粉各类制剂的保健品或中药厂家。
从我们上述的检索结果了解到，关于蒲葵药用的研究与利用已经有一些文献报道。有的对蒲葵的成分进行了研究，提示蒲葵等鲜叶有较强的自由基清除活性和对蛋白激酶C的抑制作用；有的在天然营养型保健品和药品组合物中加入有蒲葵，作为防癌、抗癌的有用的成分。但未见提示在有对蒲葵植物中的有效成分进行分离的过程中，揭示其具有防癌、抗癌的生理活性的是那一类化合物。
发明内容
本发明的目的是通过先对蒲葵植物的根、茎、籽、叶的成分进行分析测定，然后确定具提取物的分离方法，再分别将有效成分进行生理活性试验及构效关系研究。最后采用最有效的化合物制备成抗肿瘤药物制剂。
本发明蒲葵植物有效的抗肿瘤(抗癌)药物化合物包括以下几种1、薯蓣皂苷元(diosgenin) 2、β-谷甾醇(β-sitosterol) 3、豆甾酮(stigmasterone)
4、β-胡萝卜苷(β-daucosterol) 5、正二十六醇(hexacosyl alcohol) 此外，我们还提取分析得到小麦黄素(tricin)、芹菜素(apinin)、牡荆素(C21H20O10)、不饱和脂肪酸的混合物以及一些三萜类化合物。
以上几种化合物的分子式分别为薯蓣皂苷元(diosgenin)，分子式为C27H42O3；β-谷甾醇(β-sitosterol)，分子式为C29H50O；豆甾酮(stigmasterone)，分子式为C29H48O；β-胡萝卜苷(β-daucosterol)，分子式为C35H60O6；正二十六醇(hexacosyl alcohol)，分子式为C26H54O)。
本发明的上述化合物是通过红外光谱，质谱，核磁共振氢谱、碳谱、碳氢相关谱，电子光谱测定结构。
本发明的上述化合物是从蒲葵植物的根、籽、叶中提取物分离出来。具体提取方法如下(1)将新鲜采集或者晾干的蒲葵植物的根、籽、叶粉碎成3毫米以下的碎粒，用按蒲葵植物重量1-3倍70-97％(体积浓度)的乙醇浸提2-10小时，过滤分离出固相(药渣)和液相(蒲葵乙醇溶液)。
(2)液相(蒲葵乙醇溶液)蒸馏回收乙醇，得到黑色的浸提膏A。
(3)过滤分离出的固相(药渣)按蒲葵植物重量1-3倍加水煮两次，每次0.5-2小时，过滤，弃渣，再浓缩成含水50％以下的浓缩液B。
(4)合并醇提浸提膏A和水提浓缩液B，得到合并中间产品C；(5)将乙酸乙酯加到入中间产品C中，并加热到50-60℃，提取12小时反复三次，减压浓缩后得到蒲葵乙酸乙酯相粗提物，然后粗提物用硅胶柱层析纯化粗品，再用硅胶板层析，重结晶得出单体化合物，得到β-谷甾醇和正二十六烷醇。
(6)将石油醚加到中间产品C中，提取12小时反复三次，减压浓缩后得到石油醚相粗提物，然后粗提物用硅胶柱层析纯化粗品，再用硅胶板层析，重结晶得出单体化合物提取相分离得到化合物薯蓣皂苷元(diosgenin)；豆甾酮(stigmasterone)；β-胡萝卜苷(β-daucosterol)。
(7)将第(5)和第(6)步的单体化合物通过红外光谱，质谱，核磁共振氢谱、碳谱、碳氢相关谱，电子光谱测定结构。
(8)分别把上述化合物进行抗肿瘤试验。结果发现抗癌活性的效果按大小排列如下薯蓣皂苷元化合物＞甾体类化合物＞脂肪烷酸类化合物＞三萜类化合物。抗癌活性的原因可能与薯蓣皂苷元含有基本螺甾结构有关，或与甾体类化合物、脂肪烷酸类化合物的基团有关。
其它的不饱和脂肪酸可以采用碳谱及气相色谱-质谱、核磁共振氢谱进行分析。
其它的甾体类化合物也可以采用薄层色谱、氢谱、碳谱等进行分析。
具体实施例方式
以下是
具体实施例方式实施例1将新鲜采集的蒲葵植物的根、籽、叶粉碎成3毫米以下的碎粒，用按蒲葵植物重量2倍70％(体积浓度)的乙醇浸提7小时，过滤分离出药渣和蒲葵乙醇溶液，将蒲葵乙醇溶液蒸馏回收乙醇，得到黑色的浸提膏A；过滤分离出的固相(药渣)按蒲葵植物重量1倍加水煮两次，每次0.5-2小时，过滤，弃渣，再浓缩成含水50％以下的浓缩液B；合并醇提浸提膏A和水提浓缩液B，得到合并中间产品C；将乙酸乙酯加到入中间产品C中，并加热到50-60℃，提取12小时反复三次，减压浓缩后得到蒲葵乙酸乙酯相粗提物，然后粗提物用硅胶柱层析纯化粗品，再用硅胶板层析，重结晶得出单体化合物，经光谱和核磁共振谱鉴定，得到β-谷甾醇；或者经碳谱和氢谱结构鉴定，确定分子式为C26H54O并确定其结构为正二十六碳醇。
将石油醚加到中间产品C中，提取12小时反复三次，减压浓缩后得到石油醚相粗提物，然后粗提物用硅胶柱层析纯化粗品，再用硅胶板层析，重结晶得出单体化合物提取相分离，在薄层色谱监测，经氢谱和碳谱测定，得到化合物薯蓣皂苷元；豆甾酮；β-胡萝卜苷。
实施例2
将新鲜采集的蒲葵植物的根、籽、叶粉碎成3毫米以下的碎粒，用按蒲葵植物重量2倍80％(体积浓度)的乙醇浸提6小时，过滤分离出药渣和蒲葵乙醇溶液，将蒲葵乙醇溶液蒸馏回收乙醇，得到黑色的浸提膏A；过滤分离出的固相(药渣)按蒲葵植物重量2倍加水煮两次，每次0.5-2小时，过滤，弃渣，再浓缩成含水50％以下的浓缩液B；合并醇提浸提膏A和水提浓缩液B，得到合并中间产品C；将乙酸乙酯加到入中间产品C中，并加热到50-60℃，提取12小时反复三次，减压浓缩后得到蒲葵乙酸乙酯相粗提物，然后粗提物用硅胶柱层析纯化粗品，再用硅胶板层析，重结晶得出单体化合物，经光谱和核磁共振谱鉴定，得到β-谷甾醇；或者经碳谱和氢谱结构鉴定，确定分子式为C26H54O并确定其结构为正二十六碳醇。
将石油醚加到中间产品C中，提取12小时反复三次，减压浓缩后得到石油醚相粗提物，然后粗提物用硅胶柱层析纯化粗品，再用硅胶板层析，重结晶得出单体化合物提取相分离，在薄层色谱监测，经氢谱和碳谱测定，得到化合物薯蓣皂苷元；豆甾酮；β-胡萝卜苷。
实施例3将新鲜采集的蒲葵植物的根、籽、叶粉碎成3毫米以下的碎粒，用按蒲葵植物重量2倍95％(体积浓度)的乙醇浸提4小时，过滤分离出药渣和蒲葵乙醇溶液，将蒲葵乙醇溶液蒸馏回收乙醇，得到黑色的浸提膏A；过滤分离出的固相(药渣)按蒲葵植物重量2倍加水煮两次，每次0.5-2小时，过滤，弃渣，再浓缩成含水50％以下的浓缩液B；合并醇提浸提膏A和水提浓缩液B，得到合并中间产品C；将乙酸乙酯加到入中间产品C中，并加热到50-60℃，提取12小时反复三次，减压浓缩后得到蒲葵乙酸乙酯相粗提物，然后粗提物用硅胶柱层析纯化粗品，再用硅胶板层析，重结晶得出单体化合物，经光谱和核磁共振谱鉴定，得到β-谷甾醇；或者经碳谱和氢谱结构鉴定，确定分子式为C26H54O并确定其结构为正二十六碳醇。
将石油醚加到中间产品C中，提取12小时反复三次，减压浓缩后得到石油醚相粗提物，然后粗提物用硅胶柱层析纯化粗品，再用硅胶板层析，重结晶得出单体化合物提取相分离，在薄层色谱监测，经氢谱和碳谱测定，得到化合物薯蓣皂苷元；豆甾酮；β-胡萝卜苷。
实施例4将新鲜采集的蒲葵植物的根、籽、叶粉碎成3毫米以下的碎粒，用按蒲葵植物重量2倍97％(体积浓度)的乙醇浸提3小时，过滤分离出药渣和蒲葵乙醇溶液，将蒲葵乙醇溶液蒸馏回收乙醇，得到黑色的浸提膏A；过滤分离出的固相(药渣)按蒲葵植物重量3倍加水煮两次，每次0.5-2小时，过滤，弃渣，再浓缩成含水50％以下的浓缩液B；合并醇提浸提膏A和水提浓缩液B，得到合并中间产品C；将乙酸乙酯加到入中间产品C中，并加热到50-60℃，提取12小时反复三次，减压浓缩后得到蒲葵乙酸乙酯相粗提物，然后粗提物用硅胶柱层析纯化粗品，再用硅胶板层析，重结晶得出单体化合物，经光谱和核磁共振谱鉴定，得到β-谷甾醇；或者经碳谱和氢谱结构鉴定，确定分子式为C26H54O并确定其结构为正二十六碳醇。
将石油醚加到中间产品C中，提取12小时反复三次，减压浓缩后得到石油醚相粗提物，然后粗提物用硅胶柱层析纯化粗品，再用硅胶板层析，重结晶得出单体化合物提取相分离，在薄层色谱监测，经氢谱和碳谱测定，得到化合物薯蓣皂苷元；豆甾酮；β-胡萝卜苷。
以下是根据本发明实施例做出的蒲葵植物提取化合物进行的体外抗肿瘤实验(试验人员钟振国、张凤芬等)摘要 目的用体外细胞培养法研究蒲葵提取物对7类肿瘤细胞株生长的抑制作用。方法采用MTT法、细胞集落形成法、生长曲线法测定蒲葵提取物对白血病细胞株L1210和P388D1、宫颈癌细胞株Hela、人胃癌细胞株SGC7901、黑色素瘤细胞株B16、神经性肿瘤细胞株NG108-15、人肝癌细胞株Hele7404生长的抑制情况。结果蒲葵提取物对7类肿瘤细胞株的生长有抑制作用。药物浓度低于(0.5μg/ml)，对肿瘤细胞的作用不明显。随着药物浓度升高至5.0μg/ml，肿瘤细胞株的生长受到明显抑制。结论蒲葵提取物在体外具有抗肿瘤作用。
材料与方法1材料1.1蒲葵提取物蒲葵用乙酸乙酯反复浸提后，得到提取物的浓缩部分(以下简称蒲葵提取物)，药液临用前用DMSO溶解后无菌过滤备用。
1.2肿瘤细胞株白血病细胞株L1210和P388D1、宫颈癌细胞株Hela、人胃癌细胞株SGC7901、黑色素瘤细胞株B16、神经肿瘤细胞株NG108-15等均购自上海细胞生物研究所细胞库，人肝癌细胞株Hele7404由广西医科大学药理教研室提供。
1.3试剂MTT(四甲基噻唑蓝)为德国Sigma公司产品，批号020609；FBS(胚胎牛血清)为美国Hyclone公司产品，批号0405；RPMI1640和DMEM培养基为美国GIBCO公司产品，批号1120708和0311；Trypsin(胰蛋白酶)由天津市灏洋生物制品有限责任公司提供，批号200503；DMSO(二甲基亚砜)由天津汇英化学试剂有限公司提供，批号20030526。
1.4实验仪器CO2培养箱(ThermO Forma)，美国产。倒置显微镜(Olympus)，日本产。酶标仪(Biocell)，澳地利产。
2实验方法2.1MTT法参考文献报道[3]，在96孔培养板(NUNC)中每孔加入200μl(含有5000个/ml肿瘤细胞)含10％FBS的RPMI1640培养基的细胞悬液(除NG108-15细胞用含10％FBS的DMEM培养基外)，置37℃10％CO2培养箱中培养24h后，实验组分别加入最终浓度0.5ug/ml、1.0ug/ml、5.0ug/ml的蒲葵提取物的培养液，对照组则加入等浓度等体积溶剂的培养液，每组4孔，重复4次。置37℃，10％CO2培养箱培养5天后，弃去上清液，加入200μl/孔新鲜配制的含0.2mg/ml MTT的无血清培养液，37℃继续培养4h。弃上清液，加入200μl DMSO，振荡混匀后，在酶标仪上以波长为550nm，参比波长为450nm测定OD值。计算结果。
按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率。
肿瘤细胞生长抑制率％＝(1-实验组平均OD值/对照平均OD值)×100％2.2集落形成法取对数生长期的贴壁细胞(Hela、SGC7901、B16)用10％FBS的RPMI1640培养液和NG108-15用10％FBS的DMEM培养液配成500个/ml细胞悬液，接种于35mm培养皿(NUNC)中，4个为一组，每个2ml；实验组加入终浓度为0.5ug/ml、1.0ug/ml、5.0ug/ml的蒲葵提取物的细胞悬液200ul。对照组加入等浓度等体积溶剂的细胞悬液200ul。置5％CO2的37℃培养箱中静置7d；弃去培养液，用瑞氏-姬姆萨染色后计数含50个细胞以上的细胞集落。对悬浮细胞(L1210和P388D1)用10％FBS的RPMI1640培养液配成1000个/ml细胞悬液，置37℃预温；取35mm培养皿(NUNC)，4个为一组，实验组分别加入浓度为0.5ug/ml、1.0ug/ml、5.0ug/ml的蒲葵提取物，对照组则加入等体积的溶剂；取已融化的5％琼脂液1份，加入到9份37℃含15％FBS的新鲜RPMI1640培养液中，摇匀加入平皿中，每个1ml，置室温使其凝固；取预温的细胞悬液按每9.4ml加5％琼脂0.6ml的比例混匀，加到已铺底层琼脂的平皿中，每个1ml，置37℃、5％CO2培养箱中培养7d；在显微镜下计数含50个细胞以上的细胞集落。
按下列公式计算药物对细胞集落形成抑制百分率肿瘤细胞集落形成抑制百分率％＝(1-实验组细胞集落数/对照组细胞集落数)×100％2.3生长曲线法将L1210、P388D1、Hela、SGC7901、B16、Hele7404细胞接种于含10％FBS的RPMI1640培养基，NG108-15则用含10％FBS的DMEM培养基，分别配成10×103个/ml的细胞悬液，然后加入96孔培养板中，每孔200μl，实验组加入最终浓度为0.5ug/ml、1.0ug/ml、5.0ug/ml的蒲葵提取物，对照组加入等浓度等体积溶剂。每种细胞每浓度设三孔，重复4次，置10％CO237℃温箱中培养，然后按0d、1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d各取样40μl，加入0.4％台盼蓝液10μl，计数活细胞数。每孔计数4次，取均值，再累计3孔均值，根据细胞浓度值的对数值与时间作用绘成图，即为细胞生长曲线。
2.4统计学处理 以SPSS 10.0统计软件分析，两组间的均数比较采用t检验。
3.实验结果3.1MTT法测定不同浓度蒲葵提取物对肿瘤细胞株生长的抑制。结果见表1。
表1 不同浓度蒲葵提取物对肿瘤细胞抑制的影响(％)
注与对照组比较▲＜0.05，▲▲P＜0.01，▲▲▲P＜0.005，▲▲▲▲P＜0.001结果显示，蒲葵提取物对7类肿瘤细胞株有抑制作用，并与浓度有关。当提取物浓度较低(0.5μg/ml)时，药物对肿瘤细胞作用不明显。随着药物浓度升高，药物对肿瘤细胞的抑制杀伤越来越明显。其中药物对白血病细胞株P388D1较为敏感。
3.2集落形成法观察不同浓度蒲葵提取物对肿瘤细胞抑制作用。结果见表2。
表2 不同浓度蒲葵提取物对肿瘤细胞抑制的影响(％)
注与对照组比较▲P＜0.05，▲▲P＜0.01，▲▲▲P＜0.005，▲▲▲▲P＜0.001
集落形成法的结果显示，蒲葵提取物对7类肿瘤细胞株的集落形成有抑制作用。其结果与MTT法是较一致的。
3.3生长曲线法不同浓度蒲葵提取物对肿瘤细胞株生长的影响过程。结果见下图1、2、3、4、5、6、7。
图1是蒲葵提取物对L1210细胞生长曲线的影响；由图可知，蒲葵提取物作用于肿瘤细胞株L1210后，通过药物组与对照组比较发现，浓度为1.0μg/ml时已能看出药物对肿瘤细胞有着较明显的抑制杀伤作用。当药物浓度为5.0μg/ml时表现出较强的杀伤作用。
图2是蒲葵提取物对HELE7404细胞生长曲线的影响；由图可知，蒲葵提取物作用于肿瘤细胞株HELE7404后，通过药物组与对照组比较发现，浓度为1.0μg/ml时已能看出药物对肿瘤细胞有着较明显的抑制杀伤作用。当药物浓度为5.0μg/ml时表现出较强的抑制杀伤作用。
图3蒲葵提取物对Hela细胞生长曲线的的影响；由图可知，蒲葵提取物作用于肿瘤细胞株Hela后，通过药物组与对照组比较发现，浓度为1.0μg/ml时已能看出药物对肿瘤细胞有着较明显的抑制杀伤作用。当药物浓度为5.0μg/ml时表现出较强的抑制杀伤作用。
图4蒲葵提取物对P388D1细胞生长曲线的影响。
由图可知，蒲葵提取物作用于肿瘤细胞株P388D1后，通过药物组与对照组比较发现，浓度为1.0μg/ml时已能看出药物对肿瘤细胞有着较明显的抑制杀伤作用。当药物浓度为5.0μg/ml时，细胞培养到第3天已表现出对细胞有较强的抑制杀伤作用，到第4天以后细胞大量死亡。
图5蒲葵提取物对B16细胞生长曲线的影响由图可知，蒲葵提取物作用于肿瘤细胞株B16后，通过药物组与对照组比较发现，浓度为1.0μg/ml时已能看出药物对肿瘤细胞有着较明显的抑制作用。当药物浓度为5.0μg/ml时，细胞培养到第3天已表现出对细胞有较强的抑制杀伤作用，到第4天以后细胞逐渐出现死亡。
图6蒲葵提取物对NG108-15细胞生长曲线影响由图可知，蒲葵提取物作用于肿瘤细胞株NG108-15后，通过药物组与对照组比较发现，浓度为1.0μg/ml时已能看出药物对肿瘤细胞有着较明显的抑制作用。当药物浓度为5.0μg/ml时，细胞培养到第2天已表现出对细胞有较强的抑制作用，到第4天以后细胞逐渐出现死亡。
图7蒲葵提取物对SGC7901细胞生长曲线的影响由图可知，蒲葵提取物作用于肿瘤细胞株SGC7901后，通过药物组与对照组比较发现，浓度为1.0μg/ml时已能看出药物对肿瘤细胞有抑制作用。当药物浓度为5.0μg/ml时表现出较强的抑制杀伤作用。
结果显示，从以上七个图分析蒲葵提取物对肿瘤细胞生长过程有抑制杀伤作用。
4、讨论本实验通过采用三种不同的实验方法，研究蒲葵提取物在体外抗肿瘤作用。MTT法和集落形成法的结果显示，提取物对7类肿瘤细胞株生长均有抑制作用，其抑制率随着药物浓度增加而相应增高。细胞生长曲线法结果所显示结果与MTT法和集落形成法的结果相吻合。提示蒲葵提取物在体外具有抗肿瘤细胞作用。
MTT法、集落形成法、生长曲线法和Hoechst 33258荧光染色法是观察体外抗肿瘤活性的常用方法，尤其MTT法快速简便，常作为抗肿瘤药的体外初筛试验[4]，本研究采用几种实验方法的联合应用增加了实验结果的可靠性。
对恶性肿瘤目前尚无十分理想的治疗药物。近年来，从天然植物中寻找新的抗肿瘤药物已成为新药研究的主要发展方向之一。蒲葵根、茎、叶、果提取的复合物均具有抗肿瘤作用。研究表明，蛋白激酶C(PKC)是一种Ca+和磷脂酰丝氨酸(PS)激活的蛋白激酶，在细胞跨膜信号传递中起着重要作用。已有证据表明，蛋白激酶C与细胞增殖有关，许多蛋白激酶C抑制剂对细胞增殖有抑制作用，而一些抗癌药本身就是蛋白激酶C的抑制剂。有研究表明100μg/ml的蒲葵提取物对蛋白激酶活性的抑制率为66.6％，降低药浓度抑制作用减弱，提示蒲葵提取物抗癌活性可能与对蛋白激酶C的抑制有关。
从上述试验结果了解到，蒲葵提取物对治疗白血病、宫颈癌、人胃癌、黑色素瘤、神经肿瘤、人肝癌有效果。
具体病例1李××，男，55岁，感觉右上腹疼痛，经CT检查发现右叶肝癌15天，无其他不适症状、体征。用了本药两周后，复查CT结果发现肿瘤缩小，现仍继续服药治疗。
具体病例2张××，女，12岁，以乏力、发热来就诊，骨髓象见早，幼粒细胞占70％，血小板32×109/l，红系淋巴系，均明显受抑，诊为“急性非淋巴细胞型白血病”，住院以输血和对症治疗为主。经人介绍服用本中药系列药物，两个月后体力恢复，乏力、发热消失，复查血象、血小板83×109/l，早、幼粒细胞占13％，已达部分缓解。
具体病例3孙××，女，26岁，急性非淋巴细胞型白血病。患者以“消瘦乏力，突然晕厥”入院，查RBC1.6×1012/l，HB60g/l，PLT19×109/l。经医院骨穿确诊急性非淋巴性白血病。服经服用本药治疗，十天血色素上升为111g/l。连服半年，血常规转为正常，骨髓象缓解。
具体病例4苏××，男，3岁，因贫血、出血、发热，在医院骨髓检查，原十幼淋79％，确诊为急性淋巴细胞型白血病，由于家长拒绝化疗拖延月余，两个月后，患儿已奄奄一息，高烧39℃-40℃不退，牙龈出血不止，球结膜出血，皮肤紫癜，极度贫血，颌下有数个如蚕豆大的肿大淋巴结，验血血色素24g/l，血小板36×10g/l，原十幼淋93％，报病危，经服用本药治疗，五天后热退至正常水平，35天骨髓象示基本缓解。
具体病例5王××，女，50，因下腹疼痛、阴道出血到医院就诊，通过妇科检查考虑为宫颈癌。病理活组织检查，检验结果宫颈3、9点，宫颈12点-宫颈低分化鳞状上皮癌。确诊宫颈癌、下腹疼痛、出血、进食少。经使用本药1个月后，疼痛明显减轻、出血停止、进食增加。宫颈癌明显好转。继续服药1个半月，下腹坠痛消失，无出血，无不良反应。再经3个月的服药，病情无明显变化、无不良反应。经医院妇科检查及超声检查治愈宫颈癌。
具体病例6林××，男，58岁，因患胃癌施行手术治疗，一年后复发，发现肝有转移病灶。用本药一个多月后，复查CT发现病灶明显缩小。现仍继续治疗。
权利要求
1.一种蒲葵的体外抗肿瘤提取物，其特征在于其化学成分为薯蓣皂苷元；β-谷甾醇；豆甾酮；β-胡萝卜苷；正二十六醇，其化学结构如下薯蓣皂苷元 β-谷甾醇 豆甾酮 β-胡萝卜苷 正二十六醇
2.一种如权利要求1所述的蒲葵的体外抗肿瘤提取物制备方法，其特征在于(1)将新鲜采集的蒲葵植物的根、籽、叶粉碎成3毫米以下的碎粒，用按蒲葵植物重量1-3倍70-97％(体积浓度)的乙醇浸提2-10小时，过滤分离出固相和液相；(2)液相蒸馏回收乙醇，得到黑色的浸提膏A；(3)过滤分离出的固相按蒲葵植物重量1-3倍加水煮两次，每次0.5-2小时，过滤，弃渣，再浓缩成含水50％以下的浓缩液B；(4)合并醇提浸提膏A和水提浓缩液B，得到合并中间产品C；(5)将乙酸乙酯加到入中间产品C中，并加热到50-60℃，提取12小时反复三次，减压浓缩后得到蒲葵乙酸乙酯相粗提物，然后粗提物用硅胶柱层析纯化粗品，再用硅胶板层析，重结晶得出单体化合物，得到β-谷甾醇和正二十六烷醇；(6)将石油醚加到中间产品C中，提取12小时反复三次，减压浓缩后得到石油醚相粗提物，然后粗提物用硅胶柱层析纯化粗品，再用硅胶板层析，重结晶得出单体化合物提取相分离得到化合物薯蓣皂苷元(diosgenin)；豆甾酮(stigmasterone)；β-胡萝卜苷(β-daucosterol)；(7)将第(5)和第(6)步的单体化合物通过红外光谱，质谱，核磁共振氢谱、碳谱、碳氢相关谱，电子光谱测定结构。
3.一种如权利要求1所述的蒲葵的体外抗肿瘤提取物，其特征在于在治疗白血病、宫颈癌、人胃癌、黑色素瘤、神经肿瘤、人肝癌方面的应用。
全文摘要
本发明涉及一种蒲葵的体外抗肿瘤提取物，其化学成分为薯蓣皂苷元；β－谷甾醇；豆甾酮；β－胡萝卜苷；正二十六醇等，其提取方法是将新鲜采集的蒲葵植物的根、籽、叶粉碎，用乙醇浸提过滤分离出固相和液相，液相蒸馏回收乙醇，得到黑色的浸提膏A，过滤分离出的固相，水提，浓缩，合并醇提浸提膏和水提浓缩液，分别用乙酸乙酯和石油醚提取再用硅胶柱重结晶得出单体化合物，经药理学验证，蒲葵提取物对7类肿瘤细胞株的生长有抑制作用。
文档编号A61K36/88GK1733662SQ20051003662
公开日2006年2月15日 申请日期2005年8月22日 优先权日2005年8月22日
发明者钟振国, 崔建国, 张凤芬, 刘志萍 申请人:广西中医学院