一种基于量子点光谱分析及图像解析的肿瘤转移单元计数方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于量子点光谱分析及图像解析的肿瘤转移单元计数方法，利用该方法能快速实现对肿瘤微环境中多组分原位成像、各组分的定量计算及肿瘤转移单元的定量计数；本发明方法克服了传统和现代方法中存在的不足，检测速度快，稳定性好，不需要人工计算，避免个体判断误差；可有效方便地对多组分构成的转移单元进行快速定量计算，有利于推动肿瘤个体化治疗的发展。
【专利说明】一种基于量子点光谱分析及图像解析的肿瘤转移单元计数方法
【技术领域】
[0001]本发明属于组织免疫荧光及图像空间关系解析领域，具体涉及一种基于量子点光谱分析及图像解析的肿瘤转移单元计数方法，适用于人肿瘤组织微环境中由肿瘤细胞、巨噬细胞和肿瘤新生血管(血管内皮细胞)三种组分构成的肿瘤转移单元的计数，还涉及检测其他重要微环境组分共同构成的单元的定量计算。
【背景技术】
[0002]癌症是全球首位致死病因，在过去20年中，其发生率和死亡率居高不下，严重威胁我国居民健康(Jemal A, Bray F，Center MM, et al.Global cancer statistics.CA:A Cancer Journal for Clinicians.2011，61:69-90.)。癌症的发生及发展是一个多因素、多阶段、逐步发展的过程，其所处的组织环境对其进展影响巨大(Polyak K, HavivI，Campbell IG.Co-evolution of tumor cells and their microenvironment.Trendsin Genetics.2009, 25:30-38.)。肿瘤微环境是由多种成分构成的，因缺乏有效的技术，当前对肿瘤微环境的研究仍然以组织原位单一成分或离体蛋白质芯片研究为主，主要包括间质支架的主要成分胶原，肿瘤免疫调节的关键成分巨噬细胞以及肿瘤新生血管等，无法原位阐明上述多种成分对肿瘤侵袭转移及患者预后的影响。另外，研究显示肿瘤侵袭转移的过程中需要依赖巨噬细胞和肿瘤新生血管的共同参与，两者缺一不可。因此，由肿瘤细胞、巨噬细胞和肿瘤新生血管共同构成的肿瘤转移单元是肿瘤侵袭转移的必备条件。并且，单一的巨噬细胞及肿瘤新生血管定量分析显示其与肿瘤分级并无统计学关联，而肿瘤转移单元每增加10个,远处转移的风险便会提高2倍(Robinson BD, Sica GL, Liu YF, etal.Tumor Microenvironment of Metastasis in Human Breast Carcinoma:A PotentialPrognostic Marker Linked to Hematogenous Dissemination.Clinical CancerResearch.2009, 15:2433-2441.)。然而，目前并没有可靠的方法学研究能预测肿瘤侵袭转移的风险，因此肿瘤转移单元的计数有可能成为良好的预测患者侵袭转移风险的指标。
[0003]另外，目前有关肿瘤转移单元的计算是采用免疫组织化学多色染色方法，不同颜色之间的分辨率低，误差大，并且采用的是人工计数方法，个体差异大，尤其是在肿瘤转移单元数量庞大时，人工计算几乎不可能完成，这严重阻碍了其在医学临床应用中的发展。
[0004]近年来发展起来的量子点多色成像技术，以其具有以下优势:1)连续而宽的激发光谱，物理尺寸和组份比例可调性；2)可同时进行多色标记，检测灵敏度高；3)抗光漂白能力强；4)荧光强度高而稳定；5)生物相容性好，抗组织自发荧光干扰能力强；6)摩尔荧光量子产率高，突破了传统荧光材料探针局限，已在肿瘤的分子成像中取得重要进展(ChenC，Peng J, Sun SR, et al.Tapping the potentials of quantum dots into clinicalapplication for personalized oncology:current status and future perspectives.Nanomedicine, 2012, 7 (3):411-428.),为进一步实现由肿瘤微环境中多组分构成的单元计算奠定基础。
【发明内容】
[0005]针对现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种基于量子点光谱分析及图像解析的肿瘤转移单元计数方法，方法易行，操作简便。该方法不仅可对由肿瘤细胞、巨噬细胞以及肿瘤新生血管构成的肿瘤转移单元进行快速计算，更重要地是其具有普适性，也能定量计算由其他与肿瘤转移相关的重要成分构成的单元，为肿瘤侵袭转移机制研究提供了很好的技术支持，有望预测患者预后及指导个体化治疗。
[0006]为了实现上述目的，本发明要用以下技术措施:
[0007]—种基于量子点光谱分析及图像解析的肿瘤转移单元计数方法，其步骤如下:
[0008]I)肿瘤组织量子点双染，并进行光谱图像的采集及信号分离；
[0009]2)以绿色细胞为中心，以N微米为半径向周围拓展，在该范围内出现红色信号，则计为1，否则为0，最终输出此张图片的肿瘤转移单元数量，具体方法如下:
[0010]a)图像预处理:提取肿瘤组织量子点双染图像RGB颜色通道中的绿色通道，通过3*3模板中值滤波平滑噪声；采用阈值法将其转换成二值化图，通过形态学开重建操作消除突刺，切断细小搭接部分以提高小区域轮廓光滑度。空洞填充，去除小面积杂质区域后所得图像为绿色细胞初始分割图；采用面积阈值M将绿色细胞初始分割图像划分为单个细胞图像和粘连细胞图像；
[0011]b)标记提取:提取粘连细胞图像与原绿色通道图像叠加，对图像求反操作后扩展局部最小区域，通过形态学闭重建和空洞填充操作后将其作为细胞的内部标记，将粘连区域外作为绿色细胞信号外部标记；
[0012]所述的局部最小区域为亮度值相同且其周围的亮度值都比它大的区域；
[0013]c)采用分水岭算法对粘连细胞分离，得到绿色细胞信号分割图，统计绿色细胞信号总数；
[0014]d)对每一个绿色细胞，提取与其边界距离小于或等于N微米的扩展区域，如果该区域内有红色信号点则该绿色细胞满足条件，统计所有满足条件细胞数；
[0015]其中:N=a+b+c;M=pi*b~2 ；
[0016]a为肿瘤细胞的平均半径，b为绿色荧光细胞的平均半径，c为红色荧光细胞的平均半径。
[0017]本发明所述的算法，如未特别说明，均为本领域技术人员公知常用算法。
[0018]本发明所述的肿瘤转移单元是由肿瘤细胞及其他两种细胞一起构成的一个整体，并且在空间分布上，必须满足三者共同出现在一个以这三种细胞平均直径之和为直径的圆中。在实际工作中，并不局限于这些特定细胞，其他与肿瘤侵袭转移相关的细胞与肿瘤细胞一起也可定义为一种新的肿瘤转移单元，本发明的计数方法具备普适性。
[0019]本发明与现有技术相比具有以下优点和效果:
[0020]1、可在同一张肿瘤组织切片上实现原位实时多组分同时成像，并将肿瘤微环境的关键成分肿瘤细胞、巨噬细胞和肿瘤新生血管作为一个整体来分析，充分考虑了三种成分的空间分布特征；
[0021]2、利用计算机程序进行计算，检测速度快，稳定性好，不需要人工计算，避免个体判断误差；[0022]3、操作步骤简单；
[0023]4、普适性好；
[0024]5、本发明提供的一种基于量子点光谱分析及图像解析的肿瘤转移单元计数方法可实现对肿瘤进展过程中由肿瘤微环境关键成分肿瘤细胞、巨噬细胞和肿瘤新生血管构成的肿瘤转移单元快速准确计算，并可拓展用于由其他肿瘤微环境成分构成的单元计算，有利于推动肿瘤个体化治疗的发展。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1为本发明的技术流程图。
[0026]①在安装有多光谱分析仪的荧光显微镜下采集肿瘤组织量子点成像图片；②利用光谱分析软件对两种信号进行分离；③计算肿瘤转移单元的数量，输出肿瘤转移单元个数(每个框就代表1个转移单元)。【放大倍数:200X (a，b，c).图像由CRi Nuance多光谱细胞成像系统(Cambridge Research&Instrumentation, Inc., Woburn, MA, USA)米集和信号分离】图2为3例胃癌患者的组织切片量子点成像和肿瘤转移单元分析示意图及输出的结果。
【具体实施方式】
[0027]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围。
[0028]实施例1:
[0029]A.肿瘤组织石蜡切片:福尔马林固定后石蜡包埋的肿瘤组织切片，厚度4 μ m，固定于经多聚赖氨酸处理的防脱载玻片上；
[0030]B.肿瘤组织切片的准备:将组织切片置于烤箱60°C烘烤2小时，接着二甲苯脱蜡3次(不同的脱蜡缸)，每次5分钟，脱蜡后将组织切片依次放入无水乙醇5分钟、95%酒精2分钟、90%酒精2分钟和85%酒精2分钟，流水冲洗3分钟；
[0031]C.组织切片的抗原修复:用柠檬酸三钠29.41g，双蒸水1000ml配制柠檬酸三钠缓冲液，柠檬酸10.5g，双蒸水500ml配制柠檬酸缓冲液，分别取柠檬酸三钠缓冲液20.25ml、柠檬酸缓冲液4.75ml加入225ml双蒸水配制成柠檬酸抗原修复液(0.01M/L，pH6.0，250ml)ο将组织切片置入含上述抗原修复液的修复盒中进行微波修复，中高火修复5分钟后转至中火修复20分钟，然后待玻片自然冷却；
[0032]D.清洗组织切片:先用流水冲洗3分钟，然后用三羟基氨基甲烷(Tris) 6.05g，氯化钠38.0g，双蒸水5000ml，配制0.01M/L、pH7.2-7.4的TBS作为洗涤液，洗涤3次，每次3分钟；
[0033]E.封闭组织切片:将上述组织切片放入孵育盒中，用2%wt/vol牛血清白蛋白封闭(用上述TBS配置)30分钟，37 0C ；
[0034]F.一抗孵育:甩掉上述封闭液后，滴加鼠抗人巨噬细胞单克隆抗体(稀释比:1/100)和山羊抗人⑶105多克隆抗体(肿瘤新生血管标志物，稀释比:1/300)混合物(用上述封闭液稀释)，湿盒孵育，4°C冰箱过夜；
[0035]G.冲洗组织切片，冲洗液为含0.5%vol/vol吐温#20的TBS，TBS按上述步骤D的配方制备，洗涤3次，每次3分钟；[0036]H.再次封闭组织切片，同步骤E ；
[0037]1.二抗孵育:甩掉上述封闭液后，滴加QDs525_F (ab) 2和QDs655_F (ab)2混合物(稀释液同步骤F)，湿盒孵育，37°C，2h ；
[0038]J.冲洗切片；冲洗液与上述步骤G所用相同，TBS按上述步骤D的配方制备，洗涤3次，每次3分钟；
[0039]K.封片观察:用甘油90ml和TBSlOml配成90%缓冲甘油，缓冲甘油封片，用荧光显微镜观察图像。
[0040]实施例2:
[0041]图像采集及肿瘤转移单元的计数，具体如下:
[0042]I)CRi Nuance多光谱细胞成像系统(Cambridge Research&Instrumentation, Inc.，Woburn，MA，USA)，用紫外光激发，采集肿瘤组织量子点双染图像(图1b);在肿瘤组织区域分离出绿色巨噬细胞信号和红色肿瘤新生血管信号(图1c)；
[0043]2)肿瘤转移单元计数，以绿色信号为中心，以30微米为半径向周围拓展，在该范围内出现红色信号，则计为1，否则为0，最终输出此张图片的肿瘤转移单元数量，具体如下:
[0044]a)图像预处理:由于肿瘤组织量子点双染图像受噪声影响存在大量的伪极小值点而容易导致分水岭严重的过分割现象，在分割执行前对图像执行降噪等预处理。提取肿瘤组织量子点双染图像RGB颜色通道中的绿色通道，通过3*3模板中值滤波平滑噪声。采用自适应大津阈值法将其转换成二值化图，通过形态学开重建操作消除突刺，切断细小搭接部分以提高小区域轮廓光滑度。空洞填充，去除小面积杂质区域后所得图像为绿色巨噬细胞初始分割图；由于绿色巨噬细胞存在部分粘连现象，采用面积阈值300 (巨噬细胞直径大小一般为10-30微米，取中位数20计算面积pi*r~2)将绿色巨噬细胞信号初始分割图划分为单个细胞图像和粘连细胞图像；
[0045]b)标记提取:准确提取与绿色巨噬细胞信号区域密切相关的标记是控制分水岭算法过分割的关键问题，由于绿色巨噬细胞信号内部强度均匀且亮度较周围区域明显，采用扩展局部最小区域提取内部标记。提取粘连细胞图像与原绿色通道图像叠加，对图像求反操作后采用强度阈值30扩展局部最小区域(局部最小区域即亮度值相同且其周围的亮度值都比它大)，通过形态学闭重建和空洞填充操作后将其作为细胞的内部标记(每一个内部标记对应着一个锯齿细胞)，将粘连区域外作为绿色巨噬细胞信号外部标记；
[0046]c)采用分水岭算法(一种基于拓扑理论的数学形态学的分割方法，其基本思想是把图像看作是测地学上的拓扑地貌，图像中每一点像素的灰度值表示该点的海拔高度，每一个局部极小值及其影响区域称为集水盆，而集水盆的边界则形成分水岭。分水岭的概念和形成可以通过模拟浸入过程来说明。在每一个局部极小值表面，刺穿一个小孔，然后把整个模型慢慢浸入水中，随着浸入的加深，每一个局部极小值的影响域慢慢向外扩展，在两个集水盆汇合处构筑大坝，即形成分水岭)对粘连细胞分离。综合后得到绿色细胞信号分割图，统计绿色细胞信号总数；
[0047]d)对每一个绿色细胞，提取与其边界距离小于或等于30微米的扩展区域，如果该区域内有红色信号点则该绿色细胞满足条件，统计所有满足条件细胞数。
[0048]采用上述相同的计算方法，分别对5张按照上述方法采集的图片进行肿瘤转移单元的计算，进行叠加后即为该患者的肿瘤转移单元总数。
[0049]本发明所述的肿瘤转移单元是由胃癌细胞、巨噬细胞和肿瘤新生血管共同构成的，三种细胞的平均半径均为10微米，并且在空间分布上，必须满足上述计算条件。在实际工作中，并不局限于这些特定细胞，其他与肿瘤侵袭转移相关的细胞与肿瘤细胞一起也可定义为一种新的单元，本发明的计数方法具备普适性。
[0050]实施例3:
[0051]肿瘤转移单元计数的有效性:
[0052] 申请人:对30例胃癌患者的肿瘤转移单元计数研究，高分化管状腺癌10例，低分化管状腺癌10例，印戒细胞癌10例,其临床基本参数没有差异,但是单个巨噬细胞、新生血管及肿瘤转移单元计数在三组间均有统计学差异，证实肿瘤转移单元计算及分析的有效性。
[0053]
表1.30例胃癌患者的临床病理特征
【权利要求】
1.一种基于量子点光谱分析及图像解析的肿瘤转移单元计数方法，其步骤如下: 1)肿瘤组织量子点双染，并进行光谱图像的采集及信号分离； 2)以绿色细胞为中心，以N微米为半径向周围拓展，在该范围内出现红色信号，则计为1，否则为O，最终输出此张图片的肿瘤转移单元数量，具体方法如下: a)图像预处理:提取肿瘤组织量子点双染图像RGB颜色通道中的绿色通道，通过3*3模板中值滤波平滑噪声；采用阈值法将其转换成二值化图，通过形态学开重建操作消除突刺，切断细小搭接部分以提高小区域轮廓光滑度；空洞填充，去除小面积杂质区域后所得图像为绿色细胞初始分割图；采用面积阈值M将绿色细胞初始分割图像划分为单个细胞图像和粘连细胞图像； b)标记提取:提取粘连细胞图像与原绿色通道图像叠加，对图像求反操作后扩展局部最小区域，通过形态学闭重建和空洞填充操作后将其作为细胞的内部标记，将粘连区域外作为绿色细胞信号外部标记； 所述的局部最小区域为亮度值相同且其周围的亮度值都比它大的区域； c)采用分水岭算法对粘连细胞分离，得到绿色细胞信号分割图，统计绿色细胞信号总数； d)对每一个绿色细胞，提取与其边界距离小于或等于N微米的扩展区域，如果该区域内有红色信号点则该绿色细胞满足条件，统计所有满足条件细胞数；
其中:N=a+b+c ;M=pi*b~2 ； a为肿瘤细胞的平均半径，b为绿色荧光细胞的平均半径，c为红色荧光细胞的平均半径。
【文档编号】G01N21/64GK103760140SQ201410006423
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月7日 优先权日:2014年1月7日
【发明者】方敏, 李雁, 屈爱平, 刘娟, 袁静萍 申请人:李雁