专利名称：具有抗癌、抗菌作用的余甘子提取物及其中药制剂的生产方法
技术领域：
本发明涉及一种中药制剂，特别是以从余甘子的根、叶、皮、果中提取的黄酮类化合物制备的、具有抗癌和抗菌作用的中药制剂。
背景技术：
余甘子(phyllanthus emblica L)是大戟科(Euphorbiaceae)叶下珠属(phyllanthus)落叶小乔木或灌木，我国广西、广东、云南山上野生很多，过去为我国少数民族常用药材，已被《中国药典》收载。该植物的果实、根、树皮、叶均可供药用。余甘子性味甘、酸、涩、凉，归肺、胃经。其功能与主治为清热凉血，消食健胃，生津止咳；用于血热血瘀、消化不良、腹胀、咳嗽、喉痛及口干。余甘子的主要化学成分有维生素C、多种氨基酸和鞣质，其中包括葡萄糖投食子鞣质(glucogallin)、投食子酸(gallic acid)、并投食子酸(ellagic acid)、鞣料云实精(carilagin)、原诃子酸(terchebin)、诃子酸(chebulinicacid)、粘酸(mucic acid)、油柑酸(phyllemblic acid)等。近年来，人们对余甘子进行了多方面研究，并用有机溶剂对其有效成分进行提取，发现提取物中有一些抗菌活性成分，对葡萄球菌、伤寒杆菌、副伤寒杆菌、人肠杆菌及痢疾杆菌均有抑制作用，在民族药学研究中，亚洲的一些国家如斯里兰卡、缅甸、巴基斯坦、尼泊尔等国均有采用余甘子治疗眼部疾病、痢疾、肠胃炎，有的用于治疗淋病等。我国民间则有利用余甘果抗菌、生津止咳及治疗急慢性咽喉炎的历史，经现代检测技术还发现，余甘子果实中含多种抗氧化成分维生素C，鞣质，维生素E，还含超氧化物歧化酶(SOD)。因此很多医学工作者对余甘子进行了多方面的研究。我们经过检索，还查到以下的有关余甘子的公开文献1.题名藏药余甘子化学成分研究作者张兰珍[1]赵文华[1]郭亚健[1]涂光忠[2]林树[1]辛林广[1]机构[1]北京中医药大学中药学院，[2]北京微量化学研究所，北京10009刊名中国中药杂志.2003，28(10).-940-9文摘目的研究藏药余甘子的化学成分。方法各种色谱法分离纯化，理化和现代波谱法鉴定结构。结果分离鉴定出11个化合物，分别为没食子酸(I)，鞣花酸(II)，I-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖(III)，3，6-二-O--没食子酰基-D-葡萄糖(IV)，诃子酸(V)，槲皮素(VI)，诃黎勒酸(VII)，鞣云实精(VIII)，3-乙基没食子酸(3-ethoxy-4，5-dihydroxy-bellzcic acid，IX)，isoscrtiniin(X)，1，6-二-O-没食子酰基-D-葡萄糖(XI)。结论3-乙基没食子酸(3-ethoxy-4，5-dihydroxy-benzoic acid)为一新化合物，isostrietiniin为首次从余甘子中得到的化合物。
2.题名民族药余甘子对D-半乳糖胺致小鼠急性肝损伤的影响作者李萍 谢金鲜 林启云机构广西中医学院药理教研室，刊名中国民族民间医药杂志.2003(3).-161-1文摘方法本实验利用D-半乳糖胺(D-Gal-N)一次性腹腔注射(ip)诱发小白鼠急性肝损伤模型，通过测定血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及肝糖元、肝脏系数，观察余甘子水提醇沉物对肝损伤的保护作用。结果余甘子水提醇沉物各剂量组成均降低血清ALT、AST、ALP、MDA含量和肝脏系数，提高血清SOD活性及促进肝糖元合成，并可改善肝脏组织病理损伤，其作用呈剂量依赖性。结论余甘子水提醇沉物有一定程度抗自由基与抗脂质过氧化作用，对D-Gal-N所致的急性损伤具有明显的保护作用。
3.题名民族药余甘子的急性毒理与药效学研究作者李萍 谢彬等机构广西中医学院药理教研室，刊名中医药学刊.2002，20(6).文摘目的观察余甘子抗肝损伤的作用。并揭示其作用机理，方法一是观察余甘子对小鼠的急性毒性作用。二是采用四氯化碳(CCl4)一次性腹腔注射(ip)造成小鼠急性肝损伤模型。检测血清谷丙转氨酶(ALT)，谷草转氨酶(AST)，碱性磷酸酶(ALP)，肝糖元水平，计算肝脏系数，并作病理学观察。结果(1)余甘子水提物的LD50为35.16±2.5g/kg。(2)余甘子水提物各剂量组均可降低CCl4所致的急性肝损伤小鼠血清ALT，AST，ALP的活性及肝脏系数，并能增加肝糖元含量，改善肝脏组织病理损伤，其作用呈剂量依赖性，结论余甘子水提物对CCl4所致的急性肝损伤具有预防作用；该药口服安全，毒性极小。
4.题名余甘子的化学成分及在民族民间传统医药中的应用作者侯开卫机构中国林科院资源昆虫所，刊名中国民族民间医药杂志.2002(6).-345-348文摘在进行余甘子的化学成分、食疗保健功能、药理学等方面研究的同时，收集了国内外的有关资料，从科甘子的化学成分、药理学、临床应用以及在国内外民族民间传统医药中的应用作了较为系统的综述，为余甘子复方医药制剂的开发提供了科学依据。
题名民族药余甘子的本草学概况作者周涛[1]邱德文[2]机构[1]贵阳中医学院，刊名贵阳中医学院学报.2002，24(3).-3-文摘对余甘子的名称来源、植物形态、生态环境和民族用药形式进行概述。余甘子作为一个重要的传统民族药，本草学的研究将随着其现代药理学研究的开展，对开发和利用其资源奠定了中医药与民族药深层的沟通与交流的理论基础。
题名埃及药用植物中抗人类免疫缺陷病毒药物的研究作者孙晓芳[1]杜贵友[2]等机构[1]中国中医研究院西苑医院，[2]中国中医研究院中药研究所，刊名中国中药杂志.2002，27(9).文摘对来自埃及的97种药用植物的天然植物及其甲醇提取物和水提取物的抑制逆转录(RT)酶和抑制HIV-1诱导的细胞病理作用(CPE)进行体外评价。余甘子Phyllanthus emblica L.果实的甲醇提取物显示出很强的抑制HIV-1的RT作用，其50％抑制浓度(IC50)值为9μg·mL^-1。对甲醇提取物通过生物活性导向分级分离(bioactivity-guided fractionation)得到抑制性有效物质PutranjivainA(PA)，其IC50值为3.9μm。巴豆Croton tiglium种子的水提物和甲醇提取物可以显著的抑制传染性和HIV-1诱导的MT-4细胞的CPE，它们的IC50值分别为0.025μg·mL^-1和2.0μg·mL^-1，且均低于产生细胞毒性的浓度(选择性指数分别为34.4和50.0)。通过生物活性导向分级分离，从甲醇提取物中分离得到8种佛波醇酯，对它们抑制HIV-1诱导的MT-4细胞的CPE的活性进行评价。发现12-O-从四(烷)酰佛波醇-13-乙酸酯(TPA)既是HIV-1诱导的CPE的抑制剂(IC100值为0.48ng·mL^-1)，又是PKC的活化剂。另证明，12-O-乙酰佛波醇-13-癸酸酯(APD)有抗HIV-1的作用(IC100值为7.6ng·mL^-1)，但没有PKC的活化作用，另证明，12-O-乙酰佛波醇-13-癸酸酯(APD)有抗HIV-1的作用(IC100值为7.6ng·mL^-1)，但没有PKC的活化作用。
题名民族药余甘子的现代研究进展作者周涛[1]廖波[2]机构[1]贵阳中基学院，[2]兴义市药检所，刊名贵阳中医学院学报.2002，24(2).-50-文摘余甘子作为一味重要的传统民族药，随着现代化学，药理学研究的进一步展开，不但阐释了其民族用药形式，而且使余甘子在补益，抗衰老，抗肿瘤等方面的功能得到认识，为更合理地开发利用它创造了条件。
题名余甘子的药理研究作者李昌玲机构福建安摩乐制药实业有限公司，刊名药学进展.2001，25(4).-210-21文摘中草药余甘子在新药和保健食品开发方面极具应用价值。余甘子的药理研究表明，其具抗微生物感染、抗氧化、抗肿瘤、降血脂和血糖、降压、补益等多种生物学活性，且无明显毒副作用。
题名中藏药中诃子、毛诃子和余甘子的本草考证作者周宁[1]彭富全[2]机构[1]广州市医药中等专业学校[2]广州陈李济药厂，刊名中草药.2001，32(4).-355-35文摘目的初步探讨诃子，毛诃子和余甘子在中药和藏药中的关系。方法本草考证和应用历史追溯，结果诃子，毛诃子和余甘子都是中药中的外来药，是伴随佛经传入我国，在应用上与藏药比较有取舍和偏重，结论应运用现代科学研究成果对中医药与民族药进行相互之间的深层沟通和交流以丰富中医药学。
题名余甘子的生药鉴定作者罗干明[1]徐纪文[2]机构[1]广东省佛山药品检验所[2]广东省佛山市药商业总公司刊名中草药.2000，31(6).-461-4文摘对余甘子的组织与粉末显微特征进行了鉴定，纠正和补充了原文献的研究，为余甘子的药材鉴别提供了依据。
题名传统药物余甘子的民族药学研究作者夏泉[1]孔杰[2]机构[1]中国医学科学院北京协和医科大学药用植物研究所[2]西北师范大学植物研究所植化研究室刊名中国中药杂志.1997，22(9).-515-518，52文摘系统研究了余甘子的民族药学，介绍了余甘子的生物学特性，地理分布格局，化学组成以及近年来所开展的药理研究成果，并介绍了17个国家及民族在其医疗实践中对余甘子的传统使用。通过跨文化比较研究指出，作为一种重要的传统药物，余甘子与保肝，抗癌，健胃，抗诱变，抗衰老等35种功能有关，是一种具有广阔开发前景的药用植物。
从上述专利文献了解到，目前对余甘子的研究除了其抗菌活性成分以外，药物研究人员还发现余甘子具有保肝，抗癌，健胃，抗诱变，抗衰老、抗免疫缺陷等作用，而且余甘子口服安全，毒性小。但目前的公开文献对余甘子提取物的化学成分以及抗菌和抗癌机理未见有详细的报道。
发明内容
本发明的目的是从余甘子及其根、叶、皮或果实中分离出活性成分，并用这些活性成分作为制备抗菌和抗癌药物的原材料，从而更好地利用我国的中草药资源，丰富中草药治疗疾病的领域。
本发明人通过对余甘子根、树皮、叶或果实的提取物进行研究，发现具有抗菌和抗癌作用的成分为黄酮类化合物。本发明人的实验结果还表明，用从余甘子及其根、叶、皮中提取的黄酮类化合物制成的中药制剂，在体外试验及细菌感染病人身上应用，结果显示有良好的抗菌效果；在体内外的抗癌试验研究表明，其黄酮类化合物有良好的抗癌效果。
本发明提取的抗菌和抗癌有效成分，其化学鉴别反应和光谱特性如下(1)金属盐类试剂的络合反应①盐酸--镁粉反应在样品乙醇溶液中加入少量镁粉，再滴加1～2滴浓盐酸，在水浴中加热3min，溶液颜色变为红色。
②AlCl3显色反应将样品的乙醇溶液滴于滤纸上形成斑点，再往斑点上喷1％AlCl3乙醇溶液，置紫外灯下检示，斑点显黄色。
(2)碱性试剂显色反应常温下往样品液中滴加NaOH水溶液，摇匀，溶液颜色变为橙红色。
(3)紫外吸收光谱特征样品液用甲醇或乙醇溶解，在紫外段波长测定吸收峰。结果表明，在265nm和336nm出现最大吸收峰。
以上结果说明，本发明人从余甘子及其根、叶、皮中提取的有效成分的化学鉴别反应结果和紫外吸收测定特性符合黄酮类化合物的特征。
以下是制备余甘子黄酮类化合物的例子。这些例子只是用来对本发明进行举例说明，而不是对本发明的提取方法的限制原料包括余甘子的根、树皮、叶、果实或以上植株部位的混合物，以下简称药材；可采用干品或鲜品，但推荐使用干品，以便于贮存，保证原料品质的一致性。
提取前的处理先将余甘子原料粉碎，制成60目以上的粗粉。
提取方法一药材粗粉，加水煎煮3-4次，合并水煮液，过滤，滤液用大孔树脂吸附。水洗柱后用30-95％或95％以上的乙醇水溶液洗脱，洗脱液回收溶剂，即得余甘子总黄酮。
提取方法二药材粗粉，95％乙醇回流提取2-3次，合并醇提液，过滤，浓缩成干膏，上硅胶柱，以乙酸乙酯-石油醚梯度洗脱，收集含黄酮类化合物的流份。回收溶剂，即得余甘子总黄酮。
提取方法三药材粗粉，加水煎煮3-4次，合并水煮液，微滤(滤孔0.2μm-0.45μm)，滤液上大孔吸附树脂柱吸附，用95％乙醇，或者比乙醇极性小的溶剂如乙酸乙酯、混合溶剂如乙酸乙酯和石油醚的混合物，洗脱。洗脱液回收溶剂，即得余甘子总黄酮。
提取方法四药材粗粉，95％乙醇回流提取2-3次，合并醇提液，过滤，浓缩成稠膏或干膏，用正丁醇，或者比正丁醇极性小的溶剂如乙酸乙酯、石油醚、混合溶剂如乙酸乙酯和正丁醇的混合物，溶解，过滤，滤液回收溶剂，提取物中主要含有黄酮类化合物。
提取方法五提取方法一所得的水提取液，浓缩到1∶1(药材重量∶溶液体积)，用正丁醇，或者比正丁醇极性小的溶剂如乙酸乙酯、石油醚、混合溶剂如乙酸乙酯和正丁醇的混合物，萃取。收集有机相，回收溶剂，提取物中主要含有黄酮类化合物。
本发明所述方法提取得到的余甘子黄酮类化合物，在生产上，可根据需要，制备不同的制剂(或剂型)口服给药制剂，如口服液、片剂、胶囊、含片；经皮给药制剂，如酊剂、搽剂、贴膏；注射给药制剂，如注射剂；喷雾给药制剂，如喷鼻剂、喷喉剂。
提取方法采用通常的制药工艺和方法，不管以什么方法制备，均以提取物中含有抗菌有效物质为原则，即提取物中得到黄酮类化合物，其它可能含有少量的生物碱、皂苷类，但在层析过程剩余已经不多。
以下是抗癌、抗菌中药制剂的制备实例在本发明的抗癌、抗菌中药制剂中，含余甘子及根、叶、皮或果实提取物干物质0.00001-100％，辅料0-99.99999％。可根据需要，制备不同的剂型口服给药制剂，如口服液、片剂、胶囊、含片；经皮给药制剂，如酊剂、搽剂、贴膏；注射给药制剂，如注射剂；喷雾给药制剂，如喷鼻剂、喷喉剂。
具体实施例方式
以下是本发明实施的例子。这些例子只用于举例说明本发明的实施，并不是对本发明的限定。
提取方法实施例一药材粗粉，加5倍水煎煮3-4次，合并水煮液，过滤，滤液用大孔树脂吸附。水洗柱后用75％的乙醇水溶液洗脱，洗脱液回收溶剂，即得余甘子总黄酮。
提取方法实施例二药材粗粉，85％乙醇回流提取2-3次，合并醇提液，过滤，浓缩成干膏，上硅胶柱，以乙酸乙酯-石油醚梯度洗脱，收集含黄酮类化合物的流份。回收溶剂，即得余甘子总黄酮。
提取方法实施例三药材粗粉，加3倍水煎煮3-4次，合并水煮液，微滤(滤孔0.2μm-0.45μm)，滤液上大孔吸附树脂柱吸附，用95％乙醇，或者比乙醇极性小的溶剂如乙酸乙酯、混合溶剂如乙酸乙酯和石油醚的混合物，洗脱。洗脱液回收溶剂，即得余甘子总黄酮。
提取方法实施例四药材粗粉，55％乙醇回流提取2-3次，合并醇提液，过滤，浓缩成稠膏或干膏，用正丁醇，或者比正丁醇极性小的溶剂如乙酸乙酯、石油醚、混合溶剂如乙酸乙酯和正丁醇的混合物，溶解，过滤，滤液回收溶剂，提取物中主要含有黄酮类化合物。
提取方法实施例五提取方法一所得的水提取液，浓缩到1∶1(药材重量∶溶液体积)，用正丁醇，或者比正丁醇极性小的溶剂如乙酸乙酯、石油醚、混合溶剂如乙酸乙酯和正丁醇的混合物，萃取。收集有机相，回收溶剂，提取物中主要含有黄酮类化合物。
制备实施例一取以上提取方法一所得余甘子黄酮类化合物10克，加适量的水溶解，加入60克白糖粉，溶解，灭菌，分装，制得口服液100ml。每100ml口服液相当于100g余甘子生药材。
制备实施例二取以上提取方法二所得余甘子黄酮类化合物，用适量30％乙醇溶解，制成每ml含生药10g的酊剂溶液，供外伤伤口杀菌。
制备实施例三取以上提取方法三所得余甘子黄酮类化合物10克，加纯水溶解，微孔过滤，分装入冻干瓶，冷冻干燥，供注射用。每瓶相当于10g余甘子生药材。
制备实施例四取以上提取方法四所得余甘子黄酮类化合物，用适量30％乙醇溶解，加入1％氮酮作渗透剂，制成每ml含生药5g的皮肤搽剂溶液。
制备实施例五取以上提取方法五所得余甘子黄酮类化合物，加适量淀粉制粒，压成片剂，基片重0.3g，或包衣，每片相当于4g余甘子生药材。
制备实施例六制备实施例五所得颗粒，装入零号胶囊，每囊装0.6克，每粒胶囊相当于8g余甘子生药材。
制备实施例七提取方法一所得余甘子黄酮类化合物100克，加1400克白糖粉，制成颗粒，分装成每袋重15克的冲剂。每袋相当于10g余甘子生药材。
制备实施例八提取方法一所得余甘子黄酮类化合物1克，研成200目以上的细粉，装入喷瓶中，可制备喷鼻剂或喷喉剂。
本发明的余甘子黄酮类化合物具体药理和药效学临床试验。
一、抗癌作用试验1实验材料1.1余甘子总黄酮 钟振国提供，临用前用二甲基亚砜溶解后无菌过滤备用。
1.2肿瘤细胞株 白血病细胞株L1210和P388D1、宫颈癌细胞株Hela、人胃癌细胞株SGC7901、黑色素瘤细胞株B16、神经肿瘤细胞株NG108-15等均购自上海细胞生物研究所细胞库，人肝癌细胞株Hele7404由广西医科大学药理教研室提供。
1.3试剂MTT(四甲基噻唑蓝)为德国Sigma公司产品，批号020609；FBS(胚胎牛血清)为美国Hyclone公司产品，批号0405；RPMI1640和DMEM培养基为美国GIBCO公司产品，批号1120708和0311；Trypsin(胰蛋白酶)由天津市灏洋生物制品有限责任公司提供，批号200503；DMSO(二甲基亚砜)由天津汇英化学试剂有限公司提供，批号20030526。
1.4实验仪器CO2培养箱(ThermO Forma)，美国产。倒置显微镜(Olympus)，日本产。酶标仪(Biocell)，澳地利产。
2实验方法2.1MTT法参考文献报道[3]，在96孔培养板(NUNC)中每孔加入200μl(含有5000个/ml肿瘤细胞)含10％FBS的RPMI1640培养基的细胞悬液(除NG108-15细胞用含10％FBS的DMEM培养基外)，置37℃10％CO2培养箱中培养24h后，实验组分别加入最终浓度0.5ug/ml、1.0ug/ml、5.0ug/ml的余甘子总黄酮的培养液，对照组则加入等浓度等体积溶剂的培养液，每组4孔，重复4次。置37℃，10％CO2培养箱培养5天后，弃去上清液，加入200μl/孔新鲜配制的含0.2mg/ml MTT的无血清培养液，37℃继续培养4h。弃上清液，加入200μlDMSO，振荡混匀后，在酶标仪上以波长为550nm，参比波长为450nm测定OD值。计算结果。
按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率。
肿瘤细胞生长抑制率％＝(1-实验组平均OD值/对照平均OD值)×100％2.2集落形成法取对数生长期的贴壁细胞(Hela、SGC7901、B16)用10％FBS的RPMI1640培养液和NG108-15用10％FBS的DMEM培养液配成500个/ml细胞悬液，接种于35mm培养皿(NUNC)中，4个为一组，每个2ml；实验组加入终浓度为0.5ug/ml、1.0ug/ml、5.0ug/ml的余甘子总黄酮的细胞悬液200ul。对照组加入等浓度等体积溶剂的细胞悬液200ul。置5％CO2的37℃培养箱中静置7d；弃去培养液，用瑞氏-姬姆萨染色后计数含50个细胞以上的细胞集落。对悬浮细胞(L1210和P388D1)用10％FBS的RPMI1640培养液配成1000个/ml细胞悬液，置37℃预温；取35mm培养皿(NUNC)，4个为一组，实验组分别加入浓度为0.5ug/ml、1.0ug/ml、5.0ug/ml的余甘子总黄酮，对照组则加入等体积的溶剂；取已融化的5％琼脂液1份，加入到9份37℃含15％FBS的新鲜RPMI1640培养液中，摇匀加入平皿中，每个1ml，置室温使其凝固；取预温的细胞悬液按每9.4ml加5％琼脂0.6ml的比例混匀，加到已铺底层琼脂的平皿中，每个1ml，置37℃、5％CO2培养箱中培养7d；在显微镜下计数含50个细胞以上的细胞集落。
按下列公式计算药物对细胞集落形成抑制百分率肿瘤细胞集落形成抑制百分率％＝(1-实验组细胞集落数/对照组细胞集落数)×100％2.3生长曲线法将L1210、P388D1、Hela、SGC7901、B16、Hele7404细胞接种于含10％FBS的RPMI1640培养基，NG108-15则用含10％FBS的DMEM培养基，分别配成10×103个/ml的细胞悬液，然后加入96孔培养板中，每孔200μl，实验组加入最终浓度为0.5ug/ml、1.0ug/ml、5.0ug/ml的余甘子总黄酮，对照组加入等浓度等体积溶剂。每种细胞每浓度设三孔，重复4次，置10％CO237℃温箱中培养，然后按0d、1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d各取样40μl，加入0.4％台盼蓝液10μl，计数活细胞数。每孔计数4次，取均值，再累计3孔均值，根据细胞浓度值的对数值与时间作用绘成图，即为细胞生长曲线。
2.4统计学处理 以SPSS 10.0统计软件分析，两组间的均数比较采用t检验。
3实验结果3.1MTT法测定不同浓度余甘子总黄酮对肿瘤细胞株生长的抑制。结果见表1。
表1 不同浓度余甘子总黄酮对肿瘤细胞抑制的影响(％)
注与对照组比较1)P＜0.05，2)P＜0.01，3)P＜0.005，4)P＜0.001结果显示，余甘子总黄酮对7类肿瘤细胞株有抑制作用，并与浓度有关。当余甘子总黄酮浓度较低(0.5μg/ml)时，药物对肿瘤细胞作用不明显。随着药物浓度升高，药物对肿瘤细胞的抑制杀伤越来越明显。其中药物对白血病细胞株P388D1较为敏感。
3.2集落形成法观察不同浓度余甘子总黄酮对肿瘤细胞抑制作用。结果见表2。
表2 不同浓度余甘子总黄酮对肿瘤细胞抑制的影响(％)
注与对照组比较1)P＜0.05，2)P＜0.01，3)P＜0.005，4)P＜0.001集落形成法的结果显示，余甘子总黄酮对7类肿瘤细胞株的集落形成有抑制作用。其结果与MTT法是较一致的。
3.3生长曲线法不同浓度余甘子总黄酮对肿瘤细胞株生长的影响过程。结果见说明书附图。
说明书附图对生长曲线法不同浓度余甘子总黄酮对肿瘤细胞株生长的影响过程。其中图1展示了不同浓度余甘子总黄酮作用L1210细胞生长曲线情况。
图2不同浓度余甘子总黄酮作用HELE740细胞生长曲线情况。
图3不同浓度余甘子总黄酮作用Hela细胞生长曲线情况。
图4不同浓度余甘子总黄酮作用P388D1细胞生长曲线情况。
图5不同浓度余甘子总黄酮作用B16细胞生长曲线情况。
图6不同浓度余甘子总黄酮作用NG108-15细胞生长曲线情况。
图7不同浓度余甘子总黄酮作用SGC7901细胞生长曲线情况。
从图1-图7的结果显示，余甘子总黄酮对肿瘤细胞生长过程有抑制作用。7个附图都可以看到，药物浓度较低(0.5μg/ml)时，与对照组相比，药物对肿瘤细胞的作用不明显随着药物浓度升高，抑制肿瘤细胞的作用表现较为明显。从图中还可获知，对照组DMSO伴随浓度升高对肿瘤细胞也有一定抑制作用。余甘子总黄酮以对白血病细胞株P388D1较为敏感。结果与前两种方法是一致的。
4结论在体外试验中，余甘子总黄酮对肿瘤细胞的生长具有明显的抑制作用。
图中虽然只是给出了余甘子根提取物总黄酮的情况，但从余甘子根、叶、皮或果实提取的总黄酮的化学成分相差不大，试验验证数据省略。
二、抗菌作用试验1.提取物的制备余甘子及其根、叶、皮晒干，打成粗粉，分别用水、95％乙醇、石油醚、正丁醇、乙酸乙酯提取，回收溶剂，制成各自的提取物。此外，水提液浓缩到1∶1(药材重量∶溶液体积)，用石油醚萃取，收集有机相，回收溶剂，得石油醚萃取物；95％乙醇提取物用乙酸乙酯溶解，过滤，收集滤液，同收溶剂，得乙酸乙酯抽提物。
2.方法固体培养基连续稀释法。
3.结果见下表。
4.结果各提取物在低浓度时对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、伤寒沙门菌、肺炎克雷伯菌、甲型链球菌和乙型溶血性链球菌即表现出抑制作用。
对以上实例一所得口服液，委托广西中医学院药理教研室进行实验，结果表明，受试小白鼠不出现急性毒性和长期毒性反应，测不出LD50。
六、临床效果因本发明尚未获得新药临床批件，不能进入临床研究，因此只在2例志愿者身上进行临床应用实验。
例一 黄××，女，广西南宁市人，43岁，手部刀伤深及肌肉层，护理不当而发炎、化脓。以上述制备实例二所得酊剂，每隔4小时搽一次，三日后炎症和脓水消失，伤口逐渐愈合。
例二 莫××，男，广西南宁市人，37岁，饮食不洁致菌痢性腹泻。予上述制备实例一所得口服液口服，每日三次，每次50ml，服二次后腹泻停止，续服一日，全部痊愈。
例三 黄××，男，广西横县农民，52岁，肺癌病人。因经济困难中断医院正常治疗改为服用制备实例六所得胶囊30天，期间病情没有恶性发展。
例四 董××，男，广西恭城县农民，60岁，慢支肺气肿肺部感染病人。因病况反复发作，加上经济困难而中断医院正常治疗，改为服用制备实例五所得片剂10天，病情有所好转，气喘消失，继续服用3周后肺气肿明显好转。
权利要求
1.一种具有抗癌和抗菌作用的化合物，其特征在于它是从余甘子根、树皮、叶或果实中提取的黄酮类化合物，其化学鉴别反应和光谱特性如下(1)金属盐类试剂的络合反应①盐酸—镁粉反应在样品乙醇溶液中加入少量镁粉，再滴加1～2滴浓盐酸，在水浴中加热3min，溶液颜色变为红色；②AlCl3显色反应将样品的乙醇溶液滴于滤纸上形成斑点，再往斑点上喷1％AlCl3乙醇溶液，置紫外灯下检示，斑点显黄色；(2)碱性试剂显色反应常温下往样品液中滴加NaOH水溶液，摇匀，溶液颜色变为橙红色；(3)紫外吸收光谱特征样品液用甲醇或乙醇溶解，在紫外段波长测定吸收峰，结果表明，在265nm和336nm出现最大吸收峰。
2.根据权利要求1所述的余甘子根、树皮、叶或果实中具有抗癌和抗菌作用的黄酮类化合物的提取方法，其特征在于将余甘子粗粉加水煎煮3-4次，加水煎煮3-4次，合并水煮液，过滤，滤液用大孔树脂吸附，水洗柱后用30-95％或95％以上的乙醇水溶液洗脱，洗脱液回收溶剂，即得余甘子总黄酮。
3.根据权利要求1所述的余甘子根、树皮、叶或果实中具有抗癌和抗菌作用的黄酮类化合物的提取方法，其特征在于余甘子粗粉，乙醇回流提取2-3次，合并醇提液，过滤，浓缩成干膏，上硅胶柱，以乙酸乙酯-石油醚梯度洗脱，收集含黄酮类化合物的流份，回收溶剂，即得余甘子总黄酮。
4.根据权利要求1所述的余甘子根、树皮、叶或果实中具有抗癌和抗菌作用的黄酮类化合物的提取方法，其特征在于余甘子粗粉，加水煎煮3-4次，合并水煮液，0.2μm-0.45μm滤孔微滤，滤液上大孔吸附树脂柱吸附，用乙醇，或者比乙醇极性小的溶剂如乙酸乙酯、混合溶剂乙酸乙酯和石油醚的混合物，洗脱，洗脱液回收溶剂，即得余甘子总黄酮。
5.根据权利要求1所述的余甘子根、树皮、叶或果实中具有抗癌和抗菌作用的黄酮类化合物的提取方法，其特征在于余甘子粗粉，乙醇回流提取2-3次，合并醇提液，过滤，浓缩成稠膏或干膏，用正丁醇，或者比正丁醇极性小的溶剂如乙酸乙酯、石油醚、混合溶剂如乙酸乙酯和正丁醇的混合物，溶解，过滤，滤液回收溶剂，提取物中主要含有黄酮类化个物。
6.根据权利要求1所述的余甘子根、树皮、叶或果实中具有抗癌和抗菌作用的黄酮类化合物的提取方法，其特征在于将余甘子粗粉，加水煎煮3-4次，合并水煮液水提取液，浓缩到溶液体积的1∶1，用正丁醇，或者比正丁醇极性小的溶剂乙酸乙酯、石油醚或者混合溶剂乙酸乙酯和正丁醇的混合物，萃取，收集有机相，回收溶剂，得到黄酮类化合物。
7.根据权利要求1所述的抗菌中药制剂，其特征在于将提取的抗癌、抗菌化合物化合物做成以下制剂或剂型口服给药制剂口服液、片剂、胶囊、含片；经皮给药制剂酊剂、搽剂、贴膏；注射给药制剂注射剂；喷雾给药制剂，喷鼻剂、喷喉剂。
8.根据权利要求1和7所述的抗癌、抗菌中药制剂，其特征在于从余甘子的取的黄酮类化合物在制剂中的中的成分和干物质重量百分含量如下从余甘子提取的黄酮类化合物 0.00001-100％辅料 0-99.99999％所述的与该中药制剂配合的辅料，从国际或我国规定的药用辅料中选取。
全文摘要
本发明公开了一种从余甘子的根、树皮、叶或果实中提取的具有抗癌、抗菌作用的黄酮类化合物，其提取方法可以采用水煮法、醇提法、大孔树脂吸附法、萃取法；用该黄酮类化合物制成不同的中药制剂，有较好的抗菌和抗癌作用。
文档编号A61K36/185GK1733752SQ20051003662
公开日2006年2月15日 申请日期2005年8月22日 优先权日2005年8月22日
发明者钟振国, 董明姣 申请人:广西中医学院