序进行：在一个25cm2的细胞培养瓶中加入至 少IOml含10%小牛血清的培养液；从液氮中取出装有细胞的冻存管，立即放入37°C水浴轻 轻摇动使冻存物在1分钟内解冻，用酒精棉球擦拭冻存管外壁后拿入超净台；将解冻后的 细胞悬液移入已加了培养液的培养瓶中，稍加摇动混匀，拧松瓶盖，平放入二氧化碳培养箱 中，在37°C、5% C02、95%湿度条件下培养，约24小时细胞贴壁后换新鲜培养液3~5ml继 续培养。
[0023] 获得的卵巢癌多药耐药细胞株，命名为SK0V3/TPL，分类命名为人卵巢癌细胞 系，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，微生物保藏号为CGMCC No. 10306,保藏日期为2015年01月04日。
[0024] 实施例2对耐药细胞株SK0V3/TPL进行形态学观察及生物学特性鉴定
[0025] I. 1形态学观察
[0026] (1)倒置相差显微镜观察活细胞形态
[0027] 取对数生长期SK0V3、SK0V3/TPL细胞各一瓶，换液后在倒置相差显微镜下观察活 细胞形态并照相。可见SK0V3细胞呈多角形，形态较一致，细胞内结构均匀（图I) ;SK0V3/ TPL细胞较大、形态不一，细胞核、胞质增大，多核仁现象增多，细胞内尤其是近细胞膜处有 较多深色物质聚集（图2)。
[0028] (2) HE染色观察细胞形态
[0029] 取对数生长期31(0￥3、31(0￥3"1^细胞，用0.25%胰酶消化制成单细胞悬液，调整 密度约I X IOVml，接种于铺盖玻片的培养皿，置二氧化碳培养箱常规培养，待细胞基本长 成单层，取出盖玻片，弃培养液，0.0 lM PBS浸洗3次，常规HE染色，于光学显微镜下观察。 可见SK0V3细胞排列规则，形态均一（图3) ;SK0V3/TPL细胞大小、形态不等，胞体及胞核体 积较大（图4)。
[0030] 1. 2测定细胞生长曲线和群体倍增时间（MTT法）
[0031] 取对数生长期SK0V3、SK0V3/TPL细胞，用胰酶消化制成单细胞悬液，调整密度。每 种细胞均以2000/孔种于96孔板，设8个复孔。同时接种7块96孔板。于实验的1~7 天每天取出一块板，用MTT法检测490nm波长处OD值，通过OD值-细胞数直线回归方程将 OD值换算成细胞数。将7次的实验数据进行分析，绘制生长曲线（图5)。按Patterson公 式Td = Λ TX lg2/lg(Nt/No)计算细胞倍增时间，Td为倍增时间，Nt为终末细胞数，No为 初始细胞数（此处用OD值代替），Λ T为Nt~No的时间，算得SK0V3和SK0V3/TPL细胞群 体倍增时间分别为27. 73±5. 92h和41. 53±3. 31h，耐药细胞生长速度减慢（P < 0. 001)。
[0032] 1. 3耐药谱分析（MTT法）
[0033] 取对数生长期51(0￥3、51(0￥3八?1^细胞，用0.25%胰酶消化，制成单细胞悬液，以 8 X 104/ml的密度接种于96孔板，每孔100 μ I (8000个细胞/孔）。常规培养24h。每孔加 100 μ 1用培养液配制的化疗药物，使11种药物（雷公藤甲素、甲氨蝶呤、5-氟脲嘧啶、阿糖 胞苷、吉西他滨、依托泊甙、丝裂霉素 C、阿霉素、米托蒽醌、紫杉醇、长春新碱）分别以7~8 个浓度梯度作用于细胞（浓度梯度根据预实验所得，务必使半数抑制浓度在此梯度范围中 间位置）。每一浓度设4个复孔，同时设仅接种细胞的无药对照孔和仅加培养液的调零孔。 于37°C、5% C02、95%湿度条件下培养72h。每空加5mg/ml MTT溶液20 μ 1，继续培养4h。 吸弃上清液，每孔加 DMSO 150 μ 1，震荡仪震荡lOmin，用酶标仪检测490nm波长OD值，每4 个复孔取其平均值。根据OD值计算细胞抑制率，计算公式：细胞抑制率=(1-实验组OD值 /对照组OD值）X 100 %。根据每种药物不同浓度抑制率，利用GraphPad软件计算该药半 数抑制浓度（IC5tl),从而计算每种药物的耐药指数RI，RI =耐药细胞IC5c/亲代细胞IC5Q， 比较耐药细胞和亲代细胞的差异。分析表明，SK0V3/TPL细胞对TPL的耐药指数（RI)为 50. 95,属高度耐药，除对TPL耐药外，对MTX、5-FU、Ara-C为中度耐药，对GEM、VP-16、MMC、 ADM、MIT、TAX、VCR呈低度耐药。详细数据如表1所示。
[0034] 表1 SKOV3/TPL细胞与SKOV3细胞对化疗药物的IC5tl值及耐药指数
[0035]
【主权项】
1. 一种卵巢癌多药耐药细胞株，其特征在于：所述的卵巢癌多药耐药细胞株是利用药 物雷公藤甲素诱导人卵巢癌SK0V3细胞株建立而成，细胞株命名为SK0V3/TPL，微生物保藏 号为CGMCC No. 10306,保藏日期为2015年Ol月04日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心。
2. -种制备权利要求1所述的卵巢癌多药耐药细胞株的方法，其特征在于：包括以下 步骤：（1)人卵巢癌SK0V3细胞株，复苏后用含10%小牛血清、lOOU/ml青霉素和lOOU/ml链 霉素的1640培养液于37°C、5% C02、95%湿度条件下培养； (2) 取对数生长期SK0V3细胞，换新鲜培养液，加入雷公藤甲素（TPL)，使其作用浓度为 10nM，在37°C、5% C02、95%湿度条件下继续培养，适时换液，维持IOnM药物浓度直至存活 细胞能在此浓度稳定生长、传代； (3) 适当增加TPL的作用浓度，在37°C、5% C02、95%湿度条件下继续培养，适时换液， 维持药物浓度直至存活细胞能在此浓度稳定生长、传代； (4) 重复步骤（3)直到获得能在400nM TPL中稳定生长、传代及复苏的SK0V3/TPL细胞 株。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（3)每次增加TPL的作用浓度为 50nM〇
4. 根据权利要求1所述的卵巢癌多药耐药细胞株，其特征在于：所述细胞株对TPL的 耐药指数为 50. 95,除对 TPL 耐药外，对 MTX、5-FU、Ara-C、GEM、VP-16、MMC、ADM、MIT、TAX、 VCR有交叉耐药。
5. 权利要求1所述的卵巢癌多药耐药细胞株在肿瘤相关研宄中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种雷公藤甲素诱导建立的卵巢癌多药耐药细胞株及其用途，细胞株命名为SKOV3/TPL，微生物保藏号为CGMCC No.10306，是选择人卵巢癌SKOV3细胞株作为亲代细胞，从10nM逐步增加中药雷公藤的单体提取物雷公藤甲素(Triptolide，TPL)的作用浓度至400nM，建立了卵巢癌多药耐药细胞株SKOV3/TPL。卵巢癌多药耐药细胞株SKOV3/TPL能在400nM的TPL中稳定生长、传代及复苏，对TPL的耐药指数(Resistant Index，RI)为50.95，除对TPL耐药外，对MTX、5-FU、Ara-C、GEM、VP-16、MMC、ADM、MIT、TAX、VCR有交叉耐药。本发明卵巢癌多药耐药细胞株的建立为肿瘤相关研究提供耐药肿瘤细胞模型，并可通过对比其与亲代细胞的遗传差异进而研究药物的作用机制。CGMCC No.1030620150104
【IPC分类】C12Q1-02, C12N5-09, C12R1-91
【公开号】CN104805057
【申请号】CN201510220945
【发明人】张雅芳, 王庚, 王莉, 李娜, 吕晓红
【申请人】哈尔滨医科大学
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年5月4日