专利名称：非甲－庚型肝炎诊断试剂及其检测方法
技术领域：
本发明涉及疾病诊断技术领域，具本地说是非甲-庚型肝炎诊断试剂及其检测方法。
背景技术：
在肝炎病原学诊断中，约有10％-20％的急慢性输血后肝炎、散发性肝炎、肝硬化和暴发型肝炎仍不能用现有的检测方法检出其病毒学标志，提示可能存在非甲庚型病毒。1997年，日本在输血后非甲庚肝炎病人血清中分离出了一种新的DNA病毒，称为输血传播病毒(transfusion-transmitted Virus，TTV)，它极有可能成为第八种肝炎病毒。研究表明，TTV呈全球性分布，是一种无胞膜的单链环状DNA病毒，它与不明原因的非甲-庚型肝炎病人转氨酶异常升高和肝功能异常有关，可通过血制品和肠道途径传播。目前，TTV的分类、基因型、病因学机理、流行病学规律等尚不完全清楚，只知其线状DNA长3.7kb，含有ORF1与ORF2两个开放读码框，分别编码770与220个氨基酸。
由于，TTV感染者血清TTV DNA滴度为50-5000拷贝/ml，较其他的一些经血传播的病毒(如HCV RNA的滴度为103-10拷贝/ml)低，因此，现在尚不能利用血清免疫学诊断方法检测TTV，采用聚合酶链式反应(PCR)就成为诊断TTV感染的主要手段。尽管PCR技术有较高的特异性和敏感性，但检测TTV需经过两次PCR扩增，操作较繁琐，技术要求高，易引起交叉污染而出假阳性，从而影响结果判断。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中TTV诊断中存在的问题和困难，提供一种敏感性高、特异性强、快速准确、重复性好、无溴乙锭污染的非甲-庚型肝炎诊断试剂及其检测方法。
本发明将PCR技术与微孔板核酸杂交酶呈色技术联用，用于临床检测非甲-庚肝型肝炎，即检测特异的TTV DNA。
本发明的非-甲庚型肝炎诊断试剂的检测方法按以下步骤进行检测1)人血清、胆汁或肝脏组织中提取DNA；2)设计TTV DNA特导性引物，并将其用生物素(biotin)标记；
3)用上述标记特异性引物对样本组织DNA进行PCR扩增，PCR产物用于微孔板杂交；4)将链酶亲合素(streptavidin)包被并封闭于微孔板上；5)合成TTV DNA特异性探针并用异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate，FITC)标记；6)取用变性液变性后的TTV DNA扩增产物，加入已包被好的微孔板中，用FITC标记的特异性探针进行杂交；7)洗涤后在核酸杂交产物中加入酶标荧光素抗体并温育；8)洗涤后再加入酶反应底物并温育；9)洗涤后用酶标仪检测核酸杂交后酶呈色结果，用于临床诊断样本是否TTV DNA携带者。
上述的检测方法中设计的TTV DNA引物为5′-biotin-CAT GTA TAGGAT AGA CTG、5′-biotin-CCT GGC AAT TTA CCA TTCC、5′-biotin-GCAGAA AGC GTC TAG CCAT、5′-biotin-CTC GCA AGC ACC CTA TCA GGCA、5′-biotin-TGA GGA AAT AAG GAC TG、5′-biotin-GTG TAC TGG AAGGCG TAA GC和探针为5′-FITC-CTA CCT CTA TAA GCA GCA GCA、5′-FITC-GGA GAG CCA TAG TGG TCT GCG、5′-FITC-TGG GCT GGGGAT CTA AGG TGTC。
本发明的诊断试剂及检测方法应用单式PCR，无需经过两次PCR扩增；应用生物素-亲和素将PCR产物包被于微孔板上，再与荧光素标记的探针杂交，使特异性的酶标记与荧光素抗体进行呈色反应，消除了非特异性扩增产物的影响，避免出现假阳性，结果更为可靠。因此，本发明具有敏感性高、特性强、快速准确、重复性好、无溴乙锭污染等优点，有望成为TTV DNA临床诊断的常规检测方法。
具体实施方案将PCR技术与微孔板核酸杂交酶呈色技术联用，按以下方法检测非-甲庚型肝炎1)从人血清、胆汁或肝脏组织中提取DNA；2)计TTV DNA特导性引物5′-biotin-CAT GTA TAG GAT AGA CTG、5′-biotin-CCT GGC AAT TTA CCA TTCC，通过PCR对TTV DNA进行扩增；3)用上述标记特异性引物对样本组织DNA进行PCR扩增，PCR产物用于微孔板杂交；4)将链酶亲合素(streptavidin)包被并封闭于微孔板上；5)合成TTV DNA特异性探针5′-FITC-CTA CCT CTA TAA GCA GCAGCA；6)取用变性液变性后的TTV DNA扩增产物，加入已包被好的微孔板中，用FITC标记的特异性探针进行杂交；7)洗涤后在核酸杂交产物中加入酶标荧光素抗体并温育；8)洗涤后再加入酶反应底物并育温；9)洗涤后用酶标仪检测核酸杂交后酶呈色结果，用于临床诊断样本是否TTV DNA携带者。
权利要求
1.一种非甲-庚型肝炎诊断试剂，其特征在于将PCR技术与微孔板核酸杂交酶呈色技术联用，用于临床检测非甲-庚肝型肝炎。
2.根据权利要求1所述的非-甲庚型肝炎诊断试剂的检测方法，其特征在于按以下步骤进行检测1)从人血清、胆汁或肝脏组织中提取DNA；2)设计TTV DNA特导性引物，并将其用生物素(biotin)标记；3)用上述标记特异性引物对样本组织DNA进行PCR扩增，PCR产物用于微孔板杂交；4)将链酶亲合素(streptavidin)包被并封闭于微孔板上；5)合成TFV DNA特异性探针并用异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate，FITC)标记；6)取用变性液变性后的TTV DNA扩增产物，加入已包被好的微孔板中，用FITC标记的特异性探针进行杂交；7)洗涤后在核酸杂交产物中加入酶标荧光素抗体并温育；8)洗涤后再加入酶反应底物并育温；9)洗涤后用酶标仪检测核酸杂交后酶呈色结果，用于临床诊断样本是否TTV DNA携带者。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于设计的TTV DNA引物为5′-biotin-CAT GTA TAG GAT AGA CTG、5′-biotin-CCT GGC AAT TTACCA TTCC、5′-biotin-GCA GAA AGC GTC TAG CCAT、5′-biotin-CTC GCAAGC ACC CTA TCA GGCA、5′-biotin-TGA GGA AAT AAG GAC TG、5′-biotin-GTG TAC TGG AAG GCG TAA GC
4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于探针为5′-FITC-CTACCT CTA TAA GCA GCA GCA、5′-FITC-GGA GAG CCA TAG TGG TCTGCG、5′-FITC-TGG GCT GGG GAT CTA AGG TGTC。
全文摘要
本发明是种非甲－庚型肝炎诊断试剂及检测方法。其特征在于将PCR技术与微孔板核酸杂交酶呈色技术联用，用于临床检测非甲－庚肝型肝炎。本发明的诊断试剂及检测方法应用单式PCR，无需经过两次PCR扩增；应用生物素－亲和素将PCR产物包被于微孔板上，再与荧光素标记的探针杂交，使特异性的酶标记与荧光素抗体进行呈色反应，消除了非特异性扩增产物的影响，避免出现假阳性，结果更为可靠。因此，本发明具有敏感性高、特性强、快速准确、重复性好、无溴乙锭污染等优点，有望成为TTV DNA临床诊断的常规检测方法。
文档编号C12Q1/68GK1436855SQ0211336
公开日2003年8月20日 申请日期2002年2月9日 优先权日2002年2月9日
发明者张 杰 申请人:昆明广博科技有限公司