专利名称：猪细小病毒vp2亲和肽及其编码核苷酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种猪细小病毒VP2亲和肽及其编码核苷酸，属于生物技术领域。
背景技术：
卩遼菌体表面展不技术(phagedisplay random peptide library)是20世纪80年代发展起来的利用噬菌体表达外源基因的一项分子生物学新技术。噬菌体展示技术所选用的噬菌体载体是丝状噬菌体，包括Π，fd和M13噬菌体，其中M13噬菌体最为常用。这类单链环状DNA病毒颗粒的噬菌体，编码11种蛋白质，pII1、pV1、pVI1、pVII1、pIX为其衣壳结构蛋白，其中PVIII蛋白为主要衣壳蛋白，构成噬菌体的管状结构，呈螺旋对称排列，pill和PVII蛋白位于噬菌体外壳的尾端，是噬菌体吸附宿主菌的结构。目前大多数基于VP2的研究主要集中在PPV诊断和免疫方面；关于VP2在PPV感染过程中的作用机理研究方面的资料较少。目前猪细小病毒病在我国感染十分严重，阳性率可达90%以上，给养猪业造成了巨大的经济损失。PPV VP2是构成衣壳蛋白的主要成分，其编码的多肽能自我装配成类病毒粒子，具有很强的免疫原性，是防治细小病毒病的主要蛋白。基于传统疫苗的一些弊端，人工设计合成多肽疫苗将成为可能。噬菌体展示技术在新型疫苗研制上具有独特的优势，一是:噬菌体所展示的抗原表位能保持一定的空间构象，能有效刺激几天产生免疫应答；二是:噬菌体本身既可以做为载体，又可作为良好的免疫佐剂，能增强免疫效果。同时，噬菌体展示肽库技术对淘选PPV的抗原表位，研究猪细小病毒表面分子及其结合的受体，以及病毒侵入宿主细胞的分子机制，研制更有效的抗细小病毒的药物具有重要意义。1985年，Smith第一次证实丝状噬菌体fd基因组可以通过基因工程手段，将目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面。其基本原理为:选择合适的噬菌体为载体，利用基因工程技术将 外源基因克隆到其载体上，同时将外源基因编码的融合蛋白在噬菌体颗粒表面展示出来，被展示的多肽保持相对独立的空间结构和生物活性，有利于受体的识别和结合，从而组成含有多种短肽的库。外源蛋白或多肽的基因型和表现型的对应关系。噬菌体展示技术将基因表达与亲和选择相结合，其过程是将目的蛋白吸附于固相载体上，如酶标板或颗粒物质。原始肽库噬菌体与靶分子短时间孵育，洗去未结合的噬菌体，然后用特定的洗脱液将与靶蛋白特异性结合的噬菌体洗脱下来。扩增洗脱后的噬菌体，然后进行下一轮淘选，经过3 4循环的“吸附-洗脱-扩增”后，最终得到高度富集与靶蛋白结合的序列，然后通过酶联免疫吸附试验进一步鉴定筛选，获取真正的目的克隆，通过测定DNA序列，推导其氨基酸序列。最后合成多肽进一步研究其生物活性。
发明内容
本发明的目的在于通过噬菌体展示肽库技术淘选PPV的抗原表位，提供一种猪细小病毒VP2亲和肽A和B及其编码核苷酸。本发明的目的通过下述技术方案实现:
1、一种猪细小病毒VP2亲和肽A，氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.1所示。2、如上所述的一种猪细小病毒VP2亲和肽A的核苷酸，核苷酸序列如序列表SEQID N0.2 所示。3、另外一种猪细小病毒VP2亲和肽B，氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.3所示。4、如上所述的一种猪细小病毒VP2亲和肽B的核苷酸，核苷酸序列如序列表SEQID N0.4 所示。5、一种VP2序列的的扩增引物VP2-3和VP2-4，核苷酸序列为:VP2-3:5’ -GGGGATCCATGAGTGAAAATGTGGAA-3’ ；VP2-4: 5，-CCCCGTCGACTTAGTATAATTTTCTTGG-3，。本研究相对于现有技术，有如下有点及有益效果:利用噬菌体随机十二肽库技术淘选出了与VP2蛋白特异性结合的多肽。人工合成此短肽，对防治猪细小病毒病提供了一定的理论基础和试验依据。在此基础上我们拟利用病毒学实验技术分析并特性鉴定的多肽在细小病毒感染周期中的作用，为PPV感染和致病机理的研究提供重要理论依据，也为寻找PPV VP2抗原表位及病毒侵入细胞机制提供了重要的理论依据。本发明的多肽由于分子量较小，易穿透进入组织，比大蛋白渗透能力更强；半衰期短，在组织中蓄积很少(减少其代谢物引起并发症的风险)；结构稳定且生产成本较低。
图1是VP2基因的PCR扩增结果；其中M是Marker，I是VP2 基因的扩增片段，2是阴性对照；图2是pET32a_VP2重组表达载体的PCR鉴定结果，I是VP2基因的扩增片段；图3是pET32a_VP2重组表达载体的双酶切鉴定结果，I是BamH I和Sal I双酶切
结果;图4是VP2融合蛋白的SDS-PAGE电泳图；其中M:低蛋白质标准分子量；1:空载体菌液；2:未诱导菌液；3 1:诱导I 5h的重组菌；8:超声破碎后菌体沉淀；9:菌体上清；图5是噬菌体结合克隆模板DNA的纯化结果；其中M:DL8000DNA Marker ; I 10:分别对应I 10噬菌体结合克隆模板DNA的纯化；图6是噬菌体PCR纯化产物图；其中M:DL8000DNA Marker ;1 10:分别对应I 10噬菌体PCR扩增产物；图7是噬菌体结合克隆的ELISA检测结果(0D490)；图8是MTT法体外检测多肽抑制效果，A为多肽对PPV抑制的MTT结果，B为多肽对PPV感染细胞的抑制率；图9是间接免疫荧光体外检测多肽抑制效果，ST细胞对照(A)，100TCID50PPV对照(B)，I 号肽 +PPV (C)，2 号肽 +PPV (D)，1+2 号肽 +PPV (E、F)；
具体实施例方式本发明设计一对引物，扩增得到PPV VP2基因片段，构建重组质粒VP2_pET32a经IPTG诱导，在E.coli Rosetta中进行高效表达。以VP2蛋白为靶分子，利用噬菌体随即十二肽库，对VP2重组蛋白进行了五轮生物淘选，最终筛选出6种亲和力的十二肽。将亲和力最高和重复性最好的2个序列合成十二肽，通过MTT法和免疫荧光试验检测合成肽体外抗病毒活性良好。本研究结果为寻找PPV受体奠定了基础，为今后对PPV的防治及多肽疫苗的研制开发提供了一定的理论基础和试验依据。 实施例一 重组表达质粒pET32a_VP2的构建
(I) VP2序列的扩增(a)根据细菌偏爱的密码子，设计引物VP2-3和VP2-4VP2-3:5’ -GGGGATCCATGAGTGAAAATGTGGAA-3，(划横线处表示引入的酶切位点为BamHI)VP2-4:5’ -CCCCGTCGACTTAGTATAATTTTCTTGG-3’ (划横线处表示引入的酶切位点为 Sail)(b)进行常规链式聚合酶反应扩增VP2基因以VP2-3和VP2-4为引物，以VP2-T-6为模板，以ExTaq聚合酶进行PCR，VP2的PCR反应条件:50iil体系中含有所述PCR反应体系为50 ii L，包括5 ii LlOXEasyTaq Buffer、4u L dNTP、I u L VP2-3、I u L VP2_4、0.5u L VP2-T_6、0.5u L ExTaq聚合酶，加无菌水补至50 u L0将混合液在所述的PCR检测的反应程序为:95°C预变性5min ;94°C变性Imin ；56°C退火Imin ;72°C延伸2min ;反应进行30个循环；最后72°C再延伸15min。得到VP2序列PCR产物用I %的琼脂糖凝胶电泳进行分析，在1740bp附近存在单一的目标条带，结果如图1，表明实验获得了与预期相符的特异DNA片段即VP2基因。(2)重组表达质粒pET32a_VP2的构建将胶纯化回收后VP2PCR产物即进行BamH I和SalI双酶切，胶纯化回收后，与经同样酶切回收的质粒pET32a体外连接，构建重组表达质粒pET32a-VP2。转化入大肠杆菌感受态JM109中，37°C培养过夜，Amp+筛选阳性克隆子。实施例二重组表达质粒pET32a_VP2的PCR及酶切鉴定挑选阳性克隆子，抽提质粒pET32a_VP2，以VP2-3和VP2-4为引物进行PCR鉴定，并BamH I和Sal I双酶切，产物用I %琼脂糖凝胶电泳检测，位置与预测一致。结果如图2，表明VP2基因成功连接入pET32a载体中。实施例三诱导表达产物的SDS-PAGE分析将鉴定正确的重组质粒pET32a_VP2转化E.coli Rosetta (DE3)感受态细胞，加入IPTG使终浓度为0.6mmol/L，37°C振荡培养。处理试验样品，进行SDS-PAGE电泳分析。结果如图4。实施例四噬菌体随机十二肽库对VP2蛋白亲和配体的生物淘选及扩增根据本实验室成熟的噬菌体淘选技术，用噬菌体随机十二肽库，对靶分子VP2蛋白进行5轮生物淘选。(I)第一轮生物淘选(a) VP2重组蛋白通过0.22 —次性滤器过滤除菌，并测定其浓度，用包被液(0.lmol/L NaHCO3 pH8.6)将VP2蛋白稀释至IOOy g/mL。以下操作均无菌进行，使用灭菌枪头。(b)ELISA板于紫外灯下照射灭菌30min，每孔加入150iiL VP2蛋白稀释液。4°C包被过夜。(c)甩掉包被液，倒扣于干净的纸巾上拍打几次，以除去残余液体。每孔加入2001^封阻液，41:放置4h。(d) TBST (TBS+0.1 % [v/v] Tween-20)缓冲液洗板 6 次，每次旋转 ELISA 板使孔的底部及边缘均被洗到，弃去缓冲液，干净纸巾上拍甩几次以除去残余液体。洗涤过程操作要快，以避免板干燥。 (e) I U L噬菌体十二肽原始文库加入99 ii L的TBS缓冲液，混匀，加入酶标板孔中，室温间隔慢摇40min,即慢摇IOmin,停止IOmin,依次进行40min。(f)弃液，倒置于干净的纸巾上拍打几次除去残液。0.1 % TBST洗涤10次，每次甩拍均换干净的纸巾防止交叉污染。(g)加入洗脱液(0.2mol/L Glycine-HCl pH2.2) 100 u L，室温慢摇 30min，然后将洗脱液移入无菌微量EP管中，加入中和液(lmol/L Tris-HCl pH9.1) 15 y L以中和洗脱液，即为噬菌体第一轮淘选洗脱物，4 0C保存。(h)测定第一轮淘选洗脱物的滴度。(2)第一轮淘选洗脱物的扩增(a)取IOy L第一轮的噬菌体洗脱物，做KT1-KT5稀释，测定第一轮洗脱的滴度。(b)E.coli ER2 738按1: 100比例接种Low-LB液体培养基(含1%。四环素)中，37 0C 200rpm 摇床培养 5h。(c)取第一轮洗脱物50 ii L和新活化的E.coli ER273820 u L加入到20mLLow_LB培养物中，37 °C摇床培养4.5h。(d)将培养物分装IOmL离心管中，4°C、IOOOOrpm离心lOmin。取上清的上部80%转入一新鲜管中，加入1/6体积PEG8000/NaCl混匀。4°C噬菌体沉降过夜。(e)4°C、IOOOOrpm离心15min。弃去上清液,短暂离心,吸去残留液体。(f)取ImL TBS重悬沉淀物，悬液移入微量EP管中，4°C、IOOOOrpm离心5min，除去残余沉淀物。然后将上清转入另一无菌微量EP管中，加入1/6体积的PEG8000/NaCl，4°C沉降 60min。(g) 4°C、IOOOOrpm离心IOmin,弃去上清,短暂离心，用微量移液器吸去残余液体。用200 ii LTBS重悬沉淀物，4°C、IOOOOrpm离心lmin，除去残留的不容物沉淀。上清转入灭菌微量EP管中，即为扩增产物。(h)取10 ii L扩增物做10_8_10_12稀释，LB/IPTG/Xgal平板测定第一轮淘选扩增物的滴度。(3)第二、三轮生物淘选及洗脱物的扩增同上(4)第四轮筛选除去pET_32a标签蛋白pET_32a标签蛋白为靶分子，包被ELISA板IOii g/100ii 1，噬菌体与pET_32a标签蛋白作用后，收获上清即为第四轮淘选洗脱物，通过此过程除去与标签蛋白结合的噬菌体，得到只于VP2蛋白特异性结合的噬菌体(5)第五轮生物淘选
噬菌体第五轮淘选。靶蛋白的包被量为4yg/孔，此步得到的终产物即为第五轮的洗脱物，将其做10_2 10_8稀释，在LB/IPTG/Xgal平板上测定第五轮洗脱物的滴度，4°C避光保存总数不到100个噬菌斑的平板。表I噬菌体淘洗产物滴度pfu测定
权利要求
1.一种猪细小病毒VP2亲和肽A，其特征在于，氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.1所示。
2.一种编码如权利要求1所述的一种猪细小病毒VP2亲和肽A的核苷酸，其特征在于，核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.2所示。
3.一种猪细小病毒VP2亲和肽B，其特征在于:氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.3所/Jn o
4.一种编码如权利要求3所述的一种猪细小病毒VP2亲和肽B的核苷酸，其特征在于，核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.4所示。
5.一种VP2序列的的扩增引物VP2-3和VP2-4，其特征在于，核苷酸序列为:VP2-3:5’ -GGGGATCCATGAGTGAAAATGTGGAA-3’ ；VP2-4:5’ -CCCCGTCGACTTAGTATAATTTTCTTGG-3’。
全文摘要
本发明涉及一种猪细小病毒VP2亲和肽A和B及其编码核苷酸，猪细小病毒VP2亲和肽A，氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。猪细小病毒VP2亲和肽B，氨基酸序列如序列表SEQ ID No.3所示，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.4所示。还涉及到一对引物VP2-3和VP2-4的核苷酸序列。本发明的多肽由于分子量较小，易穿透进入组织，比大蛋白渗透能力更强；半衰期短，在组织中蓄积很少；结构稳定且生产成本较低。
文档编号C12N15/35GK103145804SQ201310028148
公开日2013年6月12日 申请日期2013年1月25日 优先权日2013年1月25日
发明者任晓峰, 朱卫娟, 斯琴高娃, 任玉东, 李广兴 申请人:东北农业大学