来自酸热脂环酸杆菌的嗜热的与嗜热嗜酸的糖基化基因和酶以及相关生物、方法

专利名称：来自酸热脂环酸杆菌的嗜热的与嗜热嗜酸的糖基化基因和酶以及相关生物、方法
技术领域：
本发明总体上涉及生物技术。更具体地说，本发明涉及来自酸热脂环酸杆菌 (Alicyclobacillus acidocaldarius)的分离的和/或纯化的多肽和编码多肽的核酸序列 以及它们的使用方法。背景直到最近为止人们认为细菌通常不糖基化它们的蛋白。虽然已经有一些已报道的 例子，但是这些作为罕见的异常现象而不予考虑(BOrman2006)。现在正变得更为接受的是 细菌确实糖基化它们的蛋白，可能是以比真核生物更多的方式，尽管这种观点还没有广泛 传播( Schaffer等人2001)。在最近的一篇综述文章中，叙述了糖基化已显示出协助蛋白 稳定性、调节例如可溶性的物理性质、防止蛋白水解、改变活性特征、以及靶向分泌(Upreti 等人200 。1994年，一小组从酸热脂环酸杆菌纯化出一种淀粉酶并且显示所述淀粉酶在 活性生长过程中是细胞结合的、非糖基化的和不可溶的(khwerman等人1994)。当培养物 进入稳定期时，所述细胞释放多种可溶的糖基化形式的淀粉酶进入培养基(khwerman等 人1994)。没有进行比较不同形式淀粉酶活性的尝试。发明公开内容本发明的实施方案涉及酸热脂环酸杆菌基因组的纯化的和/或分离的核苷酸序 列、或者其同源物或片段。在本发明的一个实施方案中，所述核苷酸序列选自SEQ ID NO. 2、 19、36、53、70、87、104、121、138、155、172、189、206、223、240、257、274、291 和 310 或者其 同源物或片段中的至少一个。在本发明的另一个实施方案中，所述同源物选自由对SEQ IDN0. 2、19、36、53、70、87、104、121、138、155、172、189、206、223、240、257、274、291 和 310 中 的至少一个具有至少80%的序列同一性的核苷酸序列所组成的组。本发明的实施方案可以进一步涉及一种分离的和/或纯化的核酸序列，所述核酸 序列包括编码一种多肽的核酸序列，所述多肽选自由对SEQ IDN0. 1、18、35、52、69、86、103、 120、137、154、171、188、205、222、239、256、273、290、和 309 中的至少一个具有至少 90% 的 序列同一性的多肽所组成的组。本发明的实施方案还涉及由包括酸热脂环酸杆菌基因组的核苷酸序列的核苷酸序列或者其同源物或片段所编码的分离的和/或纯化的多肽。在一个实施方案中，所述核 苷酸序列包括选自由以下组成的组的核苷酸序列对SEQ ID No. 2、19、36、53、70、87、104、 121、138、155、172、189、206、223、240、257、274、291 和 310 中的至少一个具有至少 80%的序 列同一性的核苷酸序列。在本发明的另一个实施方案中，所述核苷酸序列包含选自SEQ ID N0.2、19、36、 53、70、87、104、121、138、155、172、189、206、223、240、257、274、291 和 310 或者其同源物或 片段中的至少一个的核苷酸序列。在又一实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO. 1、18、35、 52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、222、239、256、273、290、和 309 的氨基酸序列。 还在一实施方案中，所述多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列对SEQ ID No :1,18, 35、52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、222、239、256、273、290 和 309 中的至少一个 具有至少90%的序列同一性的多肽。在本发明的实施方案中，所述多肽可以是嗜酸的和/或嗜热的。在其他的实施方 案中，所述多肽可以是糖基化的、聚乙二醇化的、或其他方式的翻译后修饰的。方法的实施方案包括使用第二多肽糖基化或翻译后修饰第一多肽，所述第二多肽 选自由对 SEQ ID NO :1、18、35、52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、222、239、256、 273,290和309具有至少90%的序列同一性的多肽所组成的组。方法的另外的实施方案包括调节蛋白的稳定性、溶解性、降解性、活性特征、和/ 或第一多肽的分泌的方法，所述方法包括通过第二多肽来糖基化或翻译后修饰第一多肽， 所述第二多肽选自由对 SEQ ID No :1、18、35、52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、 222、239、256、273、290和309具有至少90%的序列同一性的多肽所组成的组。方法的另外的实施方案包括将产生或编码一种重组的、纯化的、和/或分离的核 苷酸序列的细胞和/或一种重组的、纯化的和/或分离的多肽放在包括等于或高于约25、 30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90和/或95摄氏度的温度和/或等于、低于和/ 或高于8、7、6、5、4、3、2、1和/或0的pH的环境中，所述核苷酸序列包括选自由以下组成的 组的核苷酸序列对 SEQ ID No :2、19、36、53、70、87、104、121、138、155、172、189、206、223、 240,257,274,291和310的序列中的至少一个具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列； 所述多肽选自由对 SEQ IDNo :1、18、35、52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、222、 239、256、273、290和309的序列中的一个具有至少90%的序列同一性的多肽所组成的组。考虑到在此所包含的教导内容，本发明的这些方面及其他方面将对熟练的技术人 员变得明显。附图
简述图 1 分别描绘了 在 SEQ ID NO 1 (RAAC00164)与 ref | YP_001223775. 11、 refIYP_729290. 1 I、refIZP_01084440. 1 I、refIZP_01079150. 1 I、以及 ref |ZP_01471594. 1 (SEQ ID No :3_7)之间的序列比对，这些序列都具有表1中SEQ ID NO 1指定的功能。在所有序列中保守的氨基酸被指示为“*”，而一般保守的氨基酸被指示为 “ ”合。图 2 分别描绘了 SEQ ID NO 18 (RAAC00517)与 ref | ZP_00589533. 11、 refIΖΡ_01386435. 1 | , ref|YP_378533. 1 | , ref|ZP_00513158. 1 以及 ref |YP_374173. 1 (SEQ ID NO :20-24)之间的序列比对，其中后者都具有表1中SEQ ID No 18指定的功能。在所有序列中保守的氨基酸被指示为“*”，而一般保守的氨基酸被指示为U ” I O图 3 分别描绘了 SEQ ID NO 35 (RAAC00650)与 ref | YP_001127183. 11、 refIZP_02038504. 1 U ref|ΥΡ_001647987. 1 U ref|YP_001377114. 1 以及 ref |NP_835081. 1 (SEQ ID No :37-41)之间的序列比对，其中后者都具有表1中SEQ ID No 35指定的功能。在所有序列中保守的氨基酸被指示为“*”，而一般保守的氨基酸被指示为 “ ”I ο图 4 分别描绘了 SEQ ID NO 52 (RAAC00991)与 ref | ZP_02327412. 11、 refIΥΡ_001487207. 1 U ref|ZP_01 172765. 1| , ref|NP_831314. 1 以及 ref I NP_844008. 11 (SEQ ID NO 54-58)之间的序列比对，其中后者都具有表1中SEQ ID NO:52指定的功能。在所有序列中保守的氨基酸被指示为“*”，而一般保守的氨基酸被指示为 “ ”I ο图 5A 禾口 5B 分别描绘 了 SEQ ID NO 69 (RAAC01110)与 ref | YP_001519856. 11、 refIYP_71 1688. 1 | , ref|ΖΡ_0 1331931. 1 U ref|YP_001076955. 1 以及 ref I YP_336440. 1 (SEQ ID NO :71-75)之间的序列比对，其中后者都具有表1中SEQ ID No 69指定的功能。在所有序列中保守的氨基酸被指示为“*”，而一般保守的氨基酸被指示为 “ ”I ο图 6A 禾口 6B 分另Ij 描绘了 SEQ ID NO 86 (RAAC01166)与 gb|AAR99615. 1|、 gb IABM68334. 2 |、ref | ZP_01372248. 11、ref | YP_519555. 11 以及 ref | ZP_02234077. 11 (SEQ ID NO 88-92)之间的序列比对，其中后者都具有表1中SEQ ID No :86指定的功能。在所 有序列中保守的氨基酸被指示为“*”，而一般保守的氨基酸被指示为“”。图 7 分另Ij 描绘了 SEQ ID NO 103 (RAAC01167)与 ref | ZP_01515212. 11、 refIΥΡ_001277643. 1 U ref|ZP_02291400. 1 U ref|ΥΡ_001633727. 1 以及 ref |YP_001434357. 1 (SEQ ID NO :105-109)之间的序列比对，其中后者都具有表1中SEQ ID No :103指定的功能。在所有序列中保守的氨基酸被指示为“*”，而一般保守的氨基酸被 指示为“”。图 8A 和 8B 分别描绘了 SEQ ID NO 120 (RAAC01170)与 ref | YP_001324592. 11、 refIYP_342776. 1 I、refINP_780975. 1 I、ref I ΥΡ_00 1636830. 1 I 以及 ref |YP_001299026. 1 (SEQ ID NO :122-126)之间的序列比对，其中后者都具有表1中SEQ ID No :120指定的功能。在所有序列中保守的氨基酸被指示为“*”，而一般保守的氨基酸被 指示为“”。图 9 分另Ij 描绘了 SEQ ID NO 137 (RAAC01248)与 ref | ZP_02170160. 11、 ref I ZP_0 1 17 1895. 1 I、refIYP_076646. 1 I、refIYP_5909 10. 1 I 以 及 ref |ZP_02175410. 1 (SEQ ID NO :139-143)之间的序列比对，其中后者都具有表1中SEQ ID No :137指定的功能。在所有序列中保守的氨基酸被指示为“*”，而一般保守的氨基酸被 指示为“”。图 10A 和 10B 分别描绘了 SEQ ID NO 154 (RAAC01348)与 ref | ZP_01665289. 11、 ref I ΖΡ_01643350. 11、gb | AAW77167. 11、ref | YP_452722. 1 以及 ref | ZP_02241787. 1 (SEQ ID NO :156-160)之间的序列比对，其中后者都具有表1中SEQ ID No :巧4指定的功能。在所有序列中保守的氨基酸被指示为“*”，而一般保守的氨基酸被指示为“”。图 11 分另Ij 描绘了 SEQ ID NO 171 (RAAC01377)与 ref | YP_147952. 11、 refIYP_5 206 70. 1| , ref|YP_00139 5809. 1 U ref|YP_001309701. 1 以及 ref |YP_001643660. 1 (SEQ ID NO :173-177)之间的序列比对，其中后者都具有表1中SEQ ID No :171指定的功能。在所有序列中保守的氨基酸被指示为“*”，而一般保守的氨基酸被 指示为“”。图 12 分另Ij 描绘了 SEQ ID NO 188 (RAAC01611)与 ref | YP_146214. 11、 refIYP_00 1 1244 6 3. 1 | , ref|NP_865 262. 1 | , ref|YP_426013. 1 以及 ref I ΖΡ_01885526. 1 (SEQ ID NO :190-194)之间的序列比对，其中后者都具有表1中SEQ ID No :188指定的功能。在所有序列中保守的氨基酸被指示为“*”，而一般保守的氨基酸被 指示为“”。图 13A 和 i;3B 分别描绘了 SEQ ID NO :205 (RAAC01612)与 ref | YP_146215. 11、 refIYP_001 124464. 1 U ref|ΥΡ_074948. 1 U ref|ΥΡ_0010 39503. 1 以及 ref |NP_621770. 1 (SEQ ID NO :207-211)之间的序列比对，其中后者都具有表1中SEQ ID No :205指定的功能。在所有序列中保守的氨基酸被指示为“*”，而一般保守的氨基酸被指 示为“”。图 14A 禾Π 14Β 分别描绘了 SEQ ID NO 222 (RAAC01926)与 ref | ΥΡ_001038202. 1|、 refIΖΡ_01667 587. 1|, ref|ΖΡ_01575301. 1 U ref|YP_001211020. 1 以及 ref |YP_516465. 1 (SEQ ID NO :224-228)之间的序列比对，其中后者都具有表1中SEQ ID No :222指定的功能。在所有序列中保守的氨基酸被指示为“*”，而一般保守的氨基酸被指 示为“”。图 15 分别描绘了 SEQ ID NO 239 (RAAC01998)与 ref | NP_348940. 11、 ref I NP_721244. 11、dbj | BAC75700. 11、ref | ZP_00605123. 11 以及 ref | YP_015329. 11 (SEQ ID No =241-245)之间的序列比对，其中后者都具有表1中SEQ ID No :239指定的功能。在 所有序列中保守的氨基酸被指示为“*”，而一般保守的氨基酸被指示为“”。图 16 分别描绘了 SEQ ID NO 256 (RAAC02011)与 ref | YP_754819. 11、 ref I YP_184322. 11 ,ref | NP_577787. 11 ,ref | NP_142068. 11 以及ref | NP_125751. 11 (SEQ ID NO =258-262)之间的序列比对，其中后者都具有表1中SEQ ID No :256指定的功能。在所 有序列中保守的氨基酸被指示为“*”，而一般保守的氨基酸被指示为“”。图 17A 和 17B 分别描绘了 SEQ ID NO :273 (RAAC02381)与 ref | NP_622177. 11、 refIYP_8488 58. 1 | , ref|ΥΡ_001374688. 1 | , ref|NP_470039. 1 以及 ref |ZP_01929325. 1 (SEQ ID No275_279)之间的序列比对，其中后者都具有表1中SEQ ID No :273指定的功能。在所有序列中保守的氨基酸被指示为“*”，而一般保守的氨基酸被指 示为“”。图 18 分另Ij 描绘了 SEQ ID NO 290 (RAAC02421)与 ref | ZP_01721811. 11、 refINP_241897. 1| , ref|ΥΡ_001486101. 1| , ref|ZP_01 1705 32. 1 以及 ref |ZP_02327994. 1 (SEQ ID NO =292-296)之间的序列比对，其中后者都具有表1中SEQ ID No :290指定的功能。在所有序列中保守的氨基酸被指示为“*”，而一般保守的氨基酸被 指示为“”。
图 19 分别描绘了 SEQ ID NO 309 (RAAC01168)与 ref | ΥΡ_001663880. 11、 refIYP_001 181332. 1 U ref|YP_675143. 1 U ref|YP_00235282 1. 1 以及 ref |YP_001114454. 1 (SEQ ID NO :311-315)之间的序列比对，其中后者都具有表1中SEQ ID No :309指定的功能。在所有序列中保守的氨基酸被指示为“*”，而一般保守的氨基酸被 指示为“”。实施发明的最佳方式本发明的实施方案包括与嗜热嗜酸菌酸热脂环酸杆菌的蛋白的糖基化和/或翻 译后修饰有关的基因以及相关蛋白。与这些过程有关的基因的编码序列是从酸热脂环酸杆 菌的基因组测序所产生的序列信息中来确定。这些基因和蛋白可能代表酸热脂环酸杆菌或 其他生物体的代谢工程的目标。与蛋白的糖基化和/或翻译后修饰相关的在酸热脂环酸杆 菌的基因组中发现的核酸序列、以及由此编码的氨基酸的非限制性实例在表1中列出。糖 基转移酶和/或翻译后修饰蛋白可能是但不限于以下类别UDP 葡萄糖磷酸转移酶、多 萜醇磷酸甘露糖基转移酶、和糖基转移酶以及其他。本发明的实施方案部分地涉及包括酸热脂环酸杆菌的基因和/或蛋白的基因序 列和/或蛋白序列。所包括的基因和蛋白是那些在蛋白的糖基化和/或翻译后修饰中起作 用的基因和蛋白。细胞内酶活性在本质上可能是嗜热的和/或嗜酸的并且类似基因的一般 实例描述于文献中。基因、序列、酶以及因子的类别包括但不局限于表1列出的那些。表1与糖基化相关的酸热脂环酸杆菌的基因和蛋白参照蛋白序列基因序列功能RAACOO164SEQ ID NO: 1SEQ ID NO: 2糖基转移酶RAAC00517SEQ ID NO: 18SEQ ID NO: 19糖基转移酶RAAC00650SEQ ID NO: 35SEQ ID NO: 36糖基转移酶RAAC00991SEQ ID NO: 52SEQ ID NO: 53糖基转移酶RAACOl 110SEQ ID NO: 69SEQ ID NO: 70糖基转移酶RAACO1166SEQ ID NO: 86SEQ ID NO: 87UDP β-葡萄糖磷酸转移酶RAACO1167SEQ ID NO: 103SEQ ID NO: 104糖基转移酶RAACO1170SEQ ID NO: 120SEQ ID NO: 121糖基转移酶RAACO1248SEQ ID NO: 137SEQ ID NO: 138糖基转移酶RAAC01348SEQ ID NO: 154SEQ ID NO: 155糖基转移酶RAAC01377SEQ ID NO: 171SEQ ID NO: 172糖基转移酶RAAC01611SEQ ID NO: 188SEQ ID NO: 189糖基转移酶RAAC01612SEQ ID NO: 205SEQ ID NO: 206糖基转移酶RAACO1926SEQ ID NO: 222SEQ ID NO: 223糖基转移酶RAACO1998SEQ ID NO: 239SEQ ID NO: 240糖基转移酶RAAC02011SEQ ID NO: 256SEQ ID NO: 257多萜醇磷酸甘露糖基转移酶RAAC02381SEQ ID NO: 273SEQ ID NO: 274糖基转移酶RAAC02421SEQ ID NO: 290SEQ ID NO: 291糖基转移酶RAACOl 168SEQ ID NO: 309SEQ ID NO: 310糖基转移酶 本发明涉及如下核苷酸序列包括酸热脂环酸杆菌的基因组的分离和/或纯化的核苷酸序列，选自 SEQ ID No :2、19、36、53、70、87、104、121、138、155、172、189、206、223、 240,257,274,291和310或其片段之一的序列。本发明同样涉及分离的和/或纯化的核苷酸序列，其特征在于它们包括以下至 少之一 :a) SEQ ID No :2、19、36、53、70、87、104、121、138、155、172、189、206、223、对0、257、 274491和310或其片段之一的序列的至少一个的核苷酸序列；b)与如在a)中所定义的核 苷酸序列同源的核苷酸序列；c)与如在a)或b)中所定义的核苷酸序列互补的核苷酸序列 和它们对应的RNA的核苷酸序列；d)能够在严格条件下与如在a)、b)或c)中所定义的序 列杂交的核苷酸序列；e)包含如在a)、b)、c)或d)中所定义的序列的核苷酸序列；以及f) 由例如在a)、b)、c)、d)或e)中所定义的核苷酸序列修饰的核苷酸序列。根据本发明，核苷酸、多核苷酸或核酸序列将被理解为既表示处于单体和二聚体 (所谓的串联)形式的双链或单链DNA又表示所述DNA的转录产物。本发明的方面涉及这样的核苷酸序列可能从分离方法起始或从基因工程的方法 起始对其进行分离、纯化或部分地纯化，所述分离方法诸如例如离子交换层析、通过基于分 子大小排除、或通过亲和性、或者可替代的基于不同溶剂溶解度的分级分离技术，所述基因 工程的方法诸如扩增、克隆和亚克隆，对于本发明的序列来说，由载体携带是可能的。根据本发明的分离的和/或纯化的核苷酸序列片段将被理解为指定的酸热脂环 酸杆菌基因组的任何核苷酸片段，并且以非限制性实例的方式可以包括所起源的序列的长 度为至少 8、12、20、25、50、75、100、200、300、400、500、1000 或更长的连续核苷酸。根据本发明的分离的和/或纯化的核苷酸序列的特定片段将被理解为指定的酸 热脂环酸杆菌基因组的任何核苷酸片段，所述片段在与酸热脂环酸杆菌基因组序列的对应 片段进行比对或比较之后具有至少一个不同性质的核苷酸或碱基。在本发明的意义上的同源的分离和/或纯化的核苷酸序列被理解为表示与根据 本发明的核苷酸序列的碱基具有至少一定百分比同一性的分离的和/或纯化的核苷酸序 列，所述百分比同一性为至少约 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、 90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99. 5%、99· 6%或 99. 7%，这个 百分比是纯统计的，并且在这两条核苷酸序列任意长度和全长之间分布差异是可能的。在本发明的意义上的特定的同源核苷酸序列被理解为表示具有如以上所定义的 特定片段的至少一条核苷酸序列的同源核苷酸序列。所述“特定的”同源序列可以包括例 如与代表酸热脂环酸杆菌的基因组的变体的基因组序列或其片段的序列相对应的序列。因 而这些特定的同源序列能够对应于与酸热脂环酸杆菌菌株内的突变有关的变异，并且特别 对应于至少一个核苷酸的截短、替换、缺失和/或增添。所述同源序列能够同样地对应于与 遗传密码的简并性有关的变异。术语“序列同源性的程度或百分比”是指如在本申请中所定义的“在最优比对之后 在两条序列之间序列同一性的程度或百分比”。两条氨基酸或核苷酸序列当如以下文所述进行最大对应比对时，如果在这两条序 列中的氨基酸或核苷酸残基的序列是相同的，则称它们是“相同的”。在两种(或多种)肽或 多核苷酸之间的序列比较通常是通过比较在区段或“比较窗口 ”的两条最佳比对的序列的 序列而进行，以识别和比较局部区域的序列相似性。通过Smith和Waterman，Ad. App. Math 2 :482(1981)的局部同源性算法，通过 Neddleman 和 Wunsch，J. Mol. Biol. 48 :443(1970)的同源性比对算法,通过 Pearson 和 Lipman，Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A. )85 :2444(1988) 的搜索相似性方法，通过这些算法的计算机化实施(在Wisconsin遗传学软件包，Genetics Computer Group (GCG), 575Science Dr. , Madison, Wis.中的 GAP、BESTFIT、FASTA、和 TFASTA)，或者通过目测可进行用于比较的序列的最优比对。通过比较在比较窗口的两条最佳比对的序列来确定“序列同一性的百分比”(或者 同一性的程度)，其中在所述比较窗口中的肽或多核苷酸序列的部分可以包括相比于参考 序列(它不包括增添或缺失)的增添或缺失(即空位)，以用于这两条序列的最优比对。百 分比的计算是通过确定相同的氨基酸残基或核酸碱基在两个序列中都存在的位置的数目 以得出匹配的位置的数目，用匹配的位置的数目除以比较窗口中的位置的总数目，并且将 结果乘以100以得出序列同一性的百分比。以上所给出的序列同一性的定义是将被本领域熟练技术人员使用的定义。所述定 义本身不需要任何算法的帮助，所述算法仅对实现序列的最优比对而不是序列同一性的计 算有帮助。从以上所给出的定义，由此可知，对于两条比较序列之间的序列同一性存在定义 明确的唯一值，所述值对应于最佳比对或最优比对所获得的值。BLAST N 或 BLAST P "BLAST 2 序列”为在网站 worldwideweb. ncbi. nlm. nih. gov/ gorf/bl2.html中可得到的软件，并且被发明人以及通常被熟练技术人员习惯性地用于比 较和确定两条序列之间的同一性，在上述软件中，依赖于要比较的序列长度的空位值(gap cost)被所述软件直接选择(即对于长度大于85的替换矩阵BL0SUM-62，为11.2)。本发明的序列的互补核苷酸序列被理解为表示如下的任何DNA:其核苷酸与本发 明的序列的核苷酸是互补的，并且其方向是颠倒的(反义序列)。在严格条件下与根据本发明的核苷酸序列杂交被理解为表示以如下方式所选择 的温度和离子强度的条件下的杂交所述方式为使得温度和离子强度允许保持在互补DNA 的两个片段之间的杂交。通过举例说明的方式，目的是限定以上所述的核苷酸片段的杂交步骤的非常严格 性的条件有利地如以下所述。在65°C的优选温度，在SSC缓冲液，对应于0. 15M NaCl和0. 05M柠檬酸钠的Ix SSC的存在下进行杂交。洗涤步骤例如可以如下进行在室温下的h SSC，接着是用在65°C 下的h SSC,0. 5% SDS ；2x 0. 5x SSC，0. 5% SDS的两次洗涤；在65°C各持续10分钟。使用例如42°C的温度在& SSC缓冲液的存在下的中度严格性条件，或者例如 37°C的温度在^ SSC缓冲液存在下的较低严格性的条件，分别要求在这两条序列之间杂交 的总体上较少量的互补。用于具有近似350个碱基大小的多核苷酸的以上所述的严格杂交条件将由本领 域的熟练技术人员根据Sambrook等人，1989的教导进行修改以适合于更大或更小尺寸的寡核苷酸。允许获得根据本发明的同源序列的方法中可被用作引物或探针的那些核苷酸 序列是在根据本发明的分离的和/或纯化的核苷酸序列中，这些方法如聚合酶链式反应 (PCR)、核酸克隆和测序是本领域熟练技术人员公知的。在根据本发明的分离的和/或纯化的核苷酸序列中，在允许存在SEQID NO :2、19、36、53、70、87、104、121、138、155、172、189、206、223、240、257、274、291 和 310、其片段之一、或如以下所定义的要被鉴别的其变体之一的方法中可被用作引物或探针的那些核苷酸序 列被再次优选。可以例如通过特异性扩增如PCR，或者在用适当的限制性内切酶消化根据本发明 的核苷酸序列之后获得根据本发明的核苷酸序列片段，这些方法具体在Sambrook等人， 1989年的著作中描述。同样能够根据本领域的普通技术人员所熟知的方法通过化学合成获 得此类代表性片段。修饰的核苷酸序列将被理解为表示根据本领域熟练技术人员公知的技术通过诱 变获得的任何核苷酸序列，并且包含关于根据本发明的正常序列的修饰，例如在多肽表达 的调节序列和/或启动子序列中的突变，特别地导致所述多肽的表达率的改变或导致复制 周期的调节。修饰的核苷酸序列同样将被理解为表示编码如下文所定义的修饰的多肽的任何 核苷酸序列。本发明涉及包括酸热脂环酸杆菌的分离的和/或纯化的核苷酸序列的核苷酸序 列，其特征在于所述分离的和/或纯化的核苷酸序列选自序列SEQID NO :2、19、36、53、70、 87、104、121、138、155、172、189、206、223、240、257、274、291 和 310 或其片段之一。本发明的实施方案同样涉及分离的和/或纯化的核苷酸序列，其特征在于它们包 含选自以下的核苷酸序列:a) SEQ ID No. 2、19、36、53、70、87、104、121、138、155、172、189、 206、223、M0、257、274、291和310或它们的片段之一或它们的片段之一的核苷酸序列的至 少一个；b)如在a)中所定义的序列的特定片段的核苷酸序列；c)与在a)或b)中所定义 的序列具有至少80%同一性的同源核苷酸序列；d)如在a)、b)或c)中所定义的序列的互 补核苷酸序列或与如在a)、b)或c)中所定义的序列相对应的RNA的序列；以及e)由如在 a)、b)、c)或d)中所定义的序列修饰的核苷酸序列。在根据本发明的分离的和/或纯化的核苷酸序列之中的是SEQ ID No. 13-17, 30-34、47-51、64-68、81-85、98-102、115-119、132-136、149-153、166-170、183-187、 200-204、217-221、234-238、251-255、268-272、285-289、302-306、319-323、336-340、 353-357,370-374,387-391,404-408,421-425,438-442,455-459,472-476,489-493, 506-510,523-527,540-544,557-561,574-578,591-595,608-612,625-629,642-646, 659-663、676-680、693-697、710-714、727-731、744-748、761-765、778-782 和 321-325 或其 片段的核苷酸序列，和对 SEQ ID No. 2、19、36、53、70、87、104、121、138、155、172、189、206、 223,240,257,274,291和310或其片段的序列的至少一个具有至少80%、81 %、82%、83%、 84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%, 99%,99. 5%,99. 6%、或99. 7%的同一性的同源性的任何其他分离的和/或纯化的核苷酸 序列。所述同源序列能够包括例如与酸热脂环酸杆菌的基因组序列对应的序列。以相同的 方式，这些特定的同源序列能够对应于与酸热脂环酸杆菌菌株内的突变有关的变异并且特 别地对应于至少一个核苷酸的截短、替换、缺失和/或增添。正如对于本领域的任何普通的 技术人员是明显的，用标准技术和例如BLAST的公共可得到的计算机程序，此类同源物容 易被创造和识别。如此，应该认为以上所指的每种同源物在此被列出并且被完全地描述。本发明的实施方案包括由根据本发明的核苷酸序列或其片段所编码的分离的和/或纯化的多肽，所述片段的序列由片段表示。氨基酸序列与能够根据SEQ ID NO :2,19,36, 53、70、87、104、121、138、155、172、189、206、223、240、257、274、291 和 310 的序列的至少一 个的三个可能的读码框中之一编码的分离的和/或纯化的多肽相对应。本发明的实施方案同样涉及分离的和/或纯化的多肽，其特征在于它们包括选自 氨基酸序列 SEQ ID No. 1、18、35、52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、222、239、256、 273,290和309或其片段之一的至少一个的多肽。氨基酸序列SEQ ID No. 8-12、25-29、42-46、59-63、76-80、93_97、110-114、 127-131、144-148、161-165、178-182、195-199、212-216、229-233、246-250、263-267、 280-284、297-301、314-318、33卜335、348-352、365-369、382-386、399-403、416-420、 433-437,450-454,467-471,484-488,501-505,518-522,535-539,552-556,569-573, 586-590,603-607,620-624,637-641,654-658,671-675,688-692,705-709,722-726, 739-743,756-760,773-777以及316-320或其片段的分离的和/或纯化的多肽，或者是与 SEQ ID NO :1、18、35、52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、222、239、256、273、290 和 309或其片段的序列的至少一个具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、 88%、89%、90%、91 %、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%、99. 6%或 99. 7%的同一性的同源性的任何其他分离的和/或纯化的多肽是在根据本发明的实施方 案的分离的和/或纯化的多肽中。正如对于本领域的任何普通的技术人员将是明显，用标 准技术和例如BLAST的公共可得到的计算机程序，这些同源物容易被创造和识别。如此，应 该认为以上所指的每种同源物在此被列出并且被完全描述。本发明的实施方案还涉及多肽，其特征在于它们包括选自以下的多肽a)根据本 发明的氨基酸序列的多肽的至少5个氨基酸的特定片段；b)与如在a)所定义的多肽同源 的多肽；c)如在a)或b)中所定义的多肽的特定的生物学活性片段；以及d)由在a)、b)或 c)中所定义的多肽修饰的多肽。在本说明书中，术语多肽、肽和蛋白质是可互换的。在本发明的实施方案中，根据本发明的分离的和/或纯化的多肽可以是糖基化 的、聚乙二醇化的和/或其他方式的翻译后修饰的。在另外的实施方案中，糖基化、聚乙二 醇化、和/或其他的翻译后修饰可以在体内或体外发生，和/或可以使用化学技术来实施。 在另外的实施方案中，任何糖基化、聚乙二醇化和/或其他的翻译后修饰可能是N-连接的 或0-连接的。在本发明的实施方案中，任何一种根据本发明的分离的和/或纯化的多肽在等于 或高于约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、和/或95摄氏度的温度可以具 有酶活性或功能活性，和/或在等于、低于或高于8、7、6、5、4、3、2、1、和/或0的pH条件下 可以具有酶活性或功能活性。在本发明的其他实施方案中，糖基化、聚乙二醇化和/或其他 的翻译后修饰可能为根据本发明的分离的和/或纯化的多肽所需要，所述多肽在等于或低 于 8、7、6、5、4、3、2、1、和 / 或 0 的 pH、或者在等于或高于约 25、30、35、40、45、50、55、60、65、 70、75、80、85、90、和/或95摄氏度的温度具有酶活性或功能活性。本发明的方面涉及如下多肽其通过从自然来源中纯化而被分离或获得，否则通 过遗传重组或可替代地通过化学合成获得，并且它们可因此包含如将在下文所描述的非天 然氨基酸。
根据本发明的实施方案的“多肽片段”被理解为指定的包含至少5个连续的氨基 酸、优选10个连续的氨基酸或者15个连续的氨基酸的多肽。在本发明中，特定的多肽片段被理解为指定的由根据本发明的特定片段核苷酸序 列所编码的连续的多肽片段。“同源多肽”将被理解为指定的具有关于天然多肽的某些修饰的多肽，具体而言， 所述修饰为例如至少一个氨基酸的缺失、增添或替换，截短，延长，嵌合体融合，和/或突 变。在所述同源多肽之中，其氨基酸序列与根据本发明的多肽的氨基酸的序列具有至少 80 %或90 %同源性的多肽是优选的。“特定的同源多肽”将被理解为指定的如以上所定义的并具有根据本发明的多肽 的特定片段的同源多肽。在替换的情况中，一个或多个连续或者非连续的氨基酸被“等同的”氨基酸代替。 表述“等同的”氨基酸在此是针对指定的能够被碱基结构的氨基酸之一替换、然而没有实 质上改变对应肽的生物活性的任何氨基酸，并且这样使得它们将被下文定义。正如对于本 领域的任何普通的技术人员将是明显的，用标准的分子生物学技术和例如BLAST的公共可 得到的计算机程序，此类替换容易被创造和识别。如此，应该认为以上所指的每种替换在 此被列出并且被完全描述。在氨基酸序列SEQ ID NO. 1、18、35、52、69、86、103、120、137、 154、171、188、205、222、239、256、273、290和309中的此类替换的实例可以包括氨基酸序列 SEQ ID No. 8-12、25-29、42-46、59-63、76-80、93-97、110-114、127-131、144-148、161-165、 178-182、195-199、212-216、229-233、246-250、263-267、280-284、297-301、314-318、 331-335、348-352、365-369、382-386、399-403、416-420、433-437、450-454、467-471、 484-488,501-505,518-522,535-539,552-556,569-573,586-590,603-607,620-624, 637-641、654-658、671-675、688-692、705-709、722-726、739-743、756-760、773-777 以及 316-320的那些分离的和/或纯化的多肽。这些等同的氨基酸可以通过依赖于它们与所替 换的氨基酸的结构同源性或依赖于能够被执行的在不同多肽之间生物活性的比较测验的 结果来确定。通过非限制性实例的方式，将提及能够被执行而不导致对应的修饰的多肽的生物 活性的广泛改变的替换的可能性，例如亮氨酸被缬氨酸或异亮氨酸代替，天冬氨酸被谷氨 酸代替，谷氨酰胺被天冬酰胺代替，精氨酸被赖氨酸代替等等，在相同条件下反向替换自然 地是可想象的。在另外的实施方案中，替换被限制为在具有相似的识别的酶活性的其他蛋白中不 保守的氨基酸中的替换。例如，本领域任何普通技术人员可比对在相似的生物体中有相同 功能的蛋白，并且确定哪些氨基酸在那种功能的蛋白中是一般保守的。可用来产生这样 的比对的程序的一个实例是由与NCBI提供的数据库结合的wordlwideweb. charite. de/ bioinf/strap/.此类多肽的实例可以包括但不限于那些在氨基酸序列SEQ ID No. 8-12, 25-29、42-46、59-63、76-80、93-97、110-114、127-131、144-148、161-165、178-182、 195-199、212-216、229-233、246-250、263-267、280-284、297-301、314-318、331-335、 348-352,365-369,382-386,399-403,416-420,433-437,450-454,467-471,484-488, 501-505,518-522,535-539,552-556,569-573,586-590,603-607,620-624,637-641, 654-658、671-675、688-692、705-709、722-726、739-743、756-760、773-777 以及 316—320 中发现的多肽。因此，根据本发明的一个实施方案，可以在具有那种功能的蛋白中一般保守的位 置制造替换或突变。在另外的实施方案中，核酸序列可以被突变或替换以使得它们编码 的氨基酸是未改变的(简并性替换和/或突变)，和/或被突变或替换以使得任何生成的 氨基酸替换或突变发生在具有那种功能的蛋白中一般保守的位置。此类核酸序列的实例 包括但不限于在 SEQID No. 13-17、30-34、47-51、64-68、81-85、98-102、115-119、132-136、 149-153、166-170、183-187、200-204、217-221、234-238、251-255、268-272、285-289、 302-306,319-323,336-340,353-357,370-374,387-391,404-408,421-425,438-442, 455-459,472-476,489-493,506-510,523-527,540-544,557-561,574-578,591-595, 608-612,625-629,642-646,659-663,676-680,693-697,710-714,727-731,744-748, 761-765,778-782以及321-325的或其片段的核酸序列中发现的核酸序列。特定的同源多肽同样对应于由如以上所定义的由特定的同源核苷酸序列所编码 的多肽，并且因此在本定义中包括突变的多肽或与可以在酸热脂环酸杆菌中存在的变体相 对应的多肽，以及特别地与至少一个氨基酸残基的截短、替换、缺失和/或增添相对应的多 肽。根据本发明的实施方案的“多肽的特定的生物学活性片段”将被具体理解为指定 的特定的多肽片段，如以上所定义那样，具有根据本发明的多肽的至少一个特征。在某些实 施方案中，所述肽能够表现作为表1列出的蛋白类型的至少一种。根据本发明的实施方案的多肽片段能够与酸热脂环酸杆菌中天然存在的分离或 纯化的片段相对应，或者与能够通过蛋白水解酶如胰蛋白酶、或糜蛋白酶或胶原酶或通过 化学试剂如溴化氰(CNBr)对所述多肽的切割而获得的片段相对应。此类多肽片段同样能 够就如通过化学合成、从根据本发明的表达载体转化的宿主中容易地制备，所述表达载体 包含允许表达所述片段的核酸，所述片段被置于适当的调节元件和/或表达元件的控制之 下。根据本发明的实施方案的多肽的“修饰的多肽”被理解为指定的通过将在以下描 述的遗传重组或化学合成而获得的具有关于正常序列的至少一个修饰的多肽。这些修饰或 许能够或许不能够对特异性和/或活性的起源、或结构构象的起源、定位、和根据本发明的 多肽的膜插入的能力的起源的氨基酸有影响。因此，产生具有等同的、提高的或降低的活性 以及等同的、更窄的或更宽的特异性的的多肽是可能的。在所述修饰的多肽中，有必要提及 如下多肽其中多达5个或更多个氨基酸能够被修饰、在N-端或C-端的末端被截短、或者 甚至被缺失或增添。允许对待说明的真核细胞或原核细胞的所述调控的方法是本领域普通技术人员 公知的。同样被很好地理解的是使用编码所述修饰的多肽的核苷酸序列用于所述调控例如 通过根据本发明并且在以下描述的载体将是可能的。前述的修饰的多肽可以通过使用组合化学获得，在所述组合化学中，在模型、细胞 培养物或微生物上测验多肽之前系统地改变多肽的部分例如以选择最具活性或具有寻找 的特性的化合物是可能的。化学合成同样具有能够利用非天然氨基酸或非肽键的优点。因此，为了提高根据本发明的多肽的寿命持续时间，利用非天然氨基酸例如D形式或其他的氨基酸同源物例如特别是含硫形式可能是令人感兴趣的。最后，将根据本发明的多肽的结构、其特定的或修饰的同源形式整合到多肽类型 或其他类型的化学结构中将是可能的。因此，提供在N端和C端的末端不被蛋白酶识别的 分子可能是令人感兴趣的。编码根据本发明的多肽的核苷酸序列同样是本发明的部分。本发明同样涉及可作为引物或探针使用的核苷酸序列，其特征在于所述序列选自 根据本发明的核苷酸序列。被很好地理解的是本发明在各种实施方案中同样涉及由核苷酸序列编码的酸热 脂环酸杆菌的特定的多肽，所述多肽能够通过从天然多肽中纯化、通过遗传重组或通过化 学合成通按本领域熟练技术人员公知以及如以下具体描述的方法而获得。以相同的方式， 直接针对由所述核苷酸序列所编码的所述特定多肽的标记或未标记的单克隆抗体或多克 隆抗体也被本发明包括。本发明的实施方案另外涉及根据本发明的核苷酸序列作为引物或探针来检测和/ 或扩增核酸序列的用途。因此，可使用根据本发明的实施方案的核苷酸序列来扩增核苷酸序列，特别是通 过PCR技术(聚合酶链式反应)(Erlich，1989 ；Innis等人，1990 ；Rolfs等人，1991 ；以及 White 等人，1997)。这些寡脱氧核糖核苷酸或寡核糖核苷酸引物有利地具有至少8个核苷酸、优选至 少12个核苷酸、以及甚至更优选的至少20个核苷酸的长度。可以有利地采用靶核酸的其他扩增技术作为PCR的替代。本发明的核苷酸序列、特别是根据本发明的引物同样能够在扩增靶核酸的其他方 法中采用，例如TAS技术(基于转录的扩增系统)，由Kwoh等人在1989年描述；3SR技术 (自主序列复制)，由Guatelli等人在1990年描述；NASBA技术(基于核酸序列的扩增)， 由Kievitis等人在1991年描述；SDA技术(链置换扩增)(Walker等人，1992) ；TMA技术 (转录介导的扩增)。本发明的多核苷酸还能够在用作探针的核酸的扩增或修饰技术中采用，例如LCR 技术(连接酶链式反应)，由Landegren等人在1988年描述并且由Barany等人在1991年改 进，所述技术采用热稳定连接酶；RCR技术(修复链式反应)，由Segev在1992年描述；CPR 技术(循环探针反应)，由Duck等人在1990年描述；用Q- β复制酶的扩增技术，由Miele 等人在1983年描述并且特别地由Chu等人在1986年、Lizardi等人在1988年改进，然后 由Burg等人以及Mone等人在1996年改进。在待检测的靶多核苷酸可能是RNA例如一种mRNA的情况中，借助根据本发明的至 少一种引物采用扩增反应之前或者借助本发明的至少一种探针采用检测步骤之前，使用逆 转录酶类型的酶以便从包含在所述生物样品中的RNA获得cDNA是可能的。获得的cDNA将 因此用作在根据本发明的扩增或检测步骤中所采用的一种或多种引物或者一种或多种探 针的靶。将以这样的方式选择所述检测探针使得它与靶序列或从靶序列中产生的扩增子 杂交。通过序列的方式，这样一种探针将有利地具有至少12个核苷酸的序列、特别地至少 20个核苷酸的序列以及优选地至少100核苷酸的序列。
本发明的实施方案还包括可作为根据本发明的探针或引物使用的核苷酸序列，其 特征在于它们用一种放射性化合物或非放射性化合物标记。所述未标记的核苷酸序列可以直接作为探针或引物使用，尽管所述序列普遍用一 种放射性同位素(32P、35S、3H、125I)或用一种非放射性分子(生物素、乙酰氨基芴、地高辛、 5-溴脱氧尿苷、荧光黄素)标记以获得可用于许多应用的探针。核苷酸序列的非放射性标记的实例描述于例如法国专利号78. 10975中，或者被 Ureda等人或Sanchez-Pescador等人在1988年描述。在后一种情况中，使用在专利FR-M22956和FR-2518755中所述的标记方法中的 也将是可能的。杂交技术能够以各种方式进行(Matthews等人，1988)。最普遍的方法包括将细胞 的核酸提取物固定在支持体(如硝酸纤维素、尼龙、聚苯乙烯)上，并且包括在定义明确的 条件下固定的靶核酸与探针一起孵育。在杂交后，清除过量的探针并且通过适当方法(与 所述探针相关的放射活性、荧光或酶活性的测量)检测形成的杂交分子。本发明在各种实施方案中同样包括根据本发明的核苷酸序列，其特征在于它们被 共价或非共价地固定在支持体上。根据利用依据本发明的核苷酸序列的另一个有利方式，后者能够固定在支持体上 使用并且可因此用来通过特异性杂交捕获从待测验的生物样品中获得的靶核酸。如果必 要，将所述固相支持体从所述样品中分离，然后在第二探针即用一种可容易检测的元素标 记的所谓的检测探针的帮助下检测在所述捕获探针与所述靶核酸之间所形成的杂交复合 物。本发明的另一方面是用于序列的克隆和/或表达的载体，其特征在于它包含根据 本发明的核苷酸序列。根据本发明的载体特征在于它们包含允许所述核苷酸序列在确定的宿主细胞中 整合、表达和/或分泌的元件，它们同样是本发明的部分。所述载体那么可以包含启动子、翻译起始和终止的信号以及适当的转录调节区 域。载体能稳定地保持在所述宿主细胞中，并且能够任选地具有指定所述翻译的蛋白分泌 的特殊的信号。可以根据所用的宿主细胞的功能来选择这些不同的元件。为此目的，可以 将根据本发明的核苷酸序列插入到所选宿主内的自主复制载体或所选宿主的整合载体中。将根据本领域熟练技术人员目前使用的方法来制备此类载体，并且将自其产生的 克隆通过标准方法可能引入到适当的宿主中，所述标准方法诸如例如脂质转染、电穿孔和 热激。根据本发明的载体是例如质粒或病毒来源的载体。用于表达本发明的多肽的载体 的一个实例是杆状病毒。这些载体对于转化宿主细胞以便克隆或表达本发明的核苷酸序列而言是有用的。本发明同样包括被根据本发明的一种载体转化的宿主细胞。这些细胞可以通过将已插入到如以上所定义的载体中的核苷酸序列引入到宿主 细胞中、然后在允许复制和/或表达所述转染的核苷酸序列的条件下培养所述细胞来获得。所述宿主细胞可以选自原核或真核系统，诸如例如细菌细胞(Olins和Lee，1993)；同样还有酵母细胞(Βικ:1Λ01Ζ，1993)；以及植物细胞，例如拟南芥；以及动物细胞， 特别是哺乳动物细胞(Edwards和Aruffo，1993)的培养物，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞； 同样还有其中利用应用杆状病毒的方法是可能的昆虫的细胞，例如sf9昆虫细胞(Luckow， 1993)。本发明的实施方案同样涉及包含所述根据本发明的所述转化的细胞之一的生物。表达酸热脂环酸杆菌的一种或多种基因或基因的部分的根据本发明的转基因生 物的获得，可以根据本领域熟练技术人员公知的方法如通过病毒或非病毒转染，在例如大 鼠、小鼠或兔中进行。在具有普遍存在性或者对一种组织类型选择性的强启动子的控制下， 通过转染多个拷贝的所述基因获得表达一种或多种所述基因的转基因生物是可能的。通过 以下获得转基因生物同样将是可能的在胚细胞株中的同源重组，将这些细胞株转移到胚， 在生殖线水平选择这些受感染的嵌合体，并且使所述嵌合体生长。根据本发明的转化细胞和转基因生物在用于制备重组多肽的方法中是可利用的。现今，通过基因工程、使用由根据本发明的表达载体所转化的细胞或者使用根据 本发明的转基因生物相对大量地生产重组多肽是可能的。用于制备重组形式的本发明的多肽的方法的特征在于它们采用了根据本发明的 载体，和/或由根据本发明的载体所转化的细胞，和/或包含根据本发明的所述转化的细胞 之一的转基因生物，这些方法本身包含在本发明中。如在此使用的“转化”和“转化的”涉及将核酸引入细胞中，无论是原核的还是真 核的。进一步，如在此使用的“转化”和“转化的”不需要涉及生长控制或生长失调。在用于制备重组形式的本发明的多肽的所述方法之中，采用载体和/或由所述载 体转化的细胞和/或包含所述转化的细胞之一的转基因生物的制备方法，包含根据本发明 的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码酸热脂环酸杆菌的多肽。根据本发明的变体可以包括产生与“载体”蛋白相融合的重组多肽(嵌合蛋白)。 这个系统的优点是它可以允许重组产物的稳定和/或蛋白水解的减少，在体外复性过程中 溶解度的增加，和/或当融合伙伴对特定配体具有亲和性时纯化的简化。更具体地说，本发明涉及用于制备本发明的多肽的方法，包括以下步骤a)在允 许表达根据本发明的核苷酸序列的重组多肽的条件下培养转化的细胞；b)如果需要的话， 回收所述重组多肽。当用于制备本发明的多肽的方法采用根据本发明的转基因生物时，所述重组多肽 就从所述生物中被提取出来。本发明还涉及能够通过如之前所描述的本发明的方法获得的多肽。本发明还包括用于制备合成多肽的方法，其特征在于它使用根据本发明的多肽的 氨基酸序列。本发明同样涉及通过根据本发明的方法获得的合成多肽。根据本发明的多肽同样能够通过在肽合成领域中常规的技术制备。这种合成可以 在均相溶液中或在固相中进行。例如，可以借助于由Houben-Weyl在1974年所描述的在均相溶液中的合成技术。这种合成方法包括按所需顺序对连续氨基酸进行两个两个地连续缩聚，或者包括 按适当顺序对之前形成并且已包含几个氨基酸的氨基酸和片段、或可替代地之前以这种方式制备的几个片段进行缩聚，应当理解的是有必要事先保护由这些氨基酸或片段所携带的 所有的反应性官能团，除了一端的胺官能团和另一端的羧基之外或者反之亦然，根据在肽 合成中公知的方法，所述胺官能团和羧基在正常情况下必须参与肽键的形成，特别是在活 化羧基官能团之后。还可以借助于由Merrifield所描述的技术。根据Merrifield方法，为了制备肽链，借助于非常多孔的聚合树脂，链的第一 C端 氨基酸被固定在所述树脂上。这种氨基酸通过它的羧基被固定在树脂上并且它的胺官能团 受到保护。这样将要形成所述肽链的氨基酸被一个接一个地固定在已形成并连在树脂上的 肽链部分的氨基上，所述氨基每次都事先被脱保护。当已经形成整个的所述希望肽链时，将 形成肽链的不同氨基酸的保护基团清除，并在酸的帮助下将所述肽从所述树脂中分离。本发明另外涉及杂合多肽，所述杂合多肽具有根据本发明的至少一种多肽和能够 在人或动物中诱导免疫反应的多肽的序列。有利地，所述抗原决定簇是这样的它能够诱导体液反应和/或细胞反应。对于这样的决定簇来说，包括糖基化、聚乙二醇化、和/或其他方式的翻译后修饰 的形式的根据本发明的多肽将是可能的，使用所述多肽目的在于获得能够诱导直接针对多 个表位的抗体的合成的免疫原性组合物。这些杂合分子可以部分地被形成根据本发明的多肽载体分子或其片段，所述分子 或其片段与可能的免疫原性部分特别是白喉毒素、破伤风毒素、乙型肝炎病毒的表面抗原 (专利FR 7921811)、脊髓灰质炎病毒的VPl抗原或者任何其他病毒或细菌的毒素或抗原的 表位有关。用于合成杂合分子的方法包括在基因工程中用于构建编码对所寻找的多肽序列 的杂合核苷酸序列的方法。例如，有利地引用由Minton在1984年描述的用于获得编码融 合蛋白的基因的技术是可能的。编码杂合多肽和根据本发明的杂合多肽的所述杂合核苷酸序列特征在于它们是 通过表达所述杂合核苷酸序列而获得的重组多肽，它们同样是本发明的一部分。本发明同样包括载体，其特征在于它们包含所述杂合核苷酸序列之一。由所述载 体转化的宿主细胞、包含所述转化的细胞之一的转基因生物以及使用所述载体、所述转化 的细胞和/或所述转基因生物来制备重组多肽的方法同样是本发明的一部分。根据本发明的多肽、以下所述的根据本发明的抗体以及根据本发明的核苷酸序 列，可以有利地在用于在能够包含酸热脂环酸杆菌的样品中检测和/或鉴定酸热脂环酸杆 菌的方法中采用。按照根据本发明的多肽、抗体以及核苷酸序列的特异性，将使用的这些方 法具体能够检测和/或鉴定酸热脂环酸杆菌。根据本发明的多肽可有利地被用于在能够包含酸热脂环酸杆菌的样品中检测和/ 或鉴定酸热脂环酸杆菌的方法，其特征在于它包括以下步骤a)将这份样品与根据本发明 的多肽或其片段之一相接触(在允许所述多肽与可能存在于所述生物样品中的抗体之间 的免疫反应的条件下)；b)显示可能形成的抗原抗体复合物。任何常规方法可被用来对可能形成的抗原抗体复合物进行检测。通过举例的方式，优选的方法带来作用为根据通过免疫荧光的ELISA技术的免疫 酶促方法或放射免疫方法(RIA)或其等同方法。
因此，本发明同样涉及根据本发明的、借助充分的标记如酶促、荧光的或放射性的 类型标记的多肽。此类方法包括例如以下步骤将根据本发明的确定量的多肽组合物放在微滴定 板的孔中，向所述孔中加入递增稀释度的血清或不同于之前所定义的必须被分析的生物样 品，孵育微滴定板，向微滴定板的孔中加入直接针对猪免疫球蛋白标记了的抗体，这些抗体 已借助酶进行了标记，所述酶选自能够水解底物改变底物至少在确定的波长例如在^Onm 发光的吸收的酶，通过与对照试验进行比较来检测水解的底物的量。根据本发明的多肽允许制备单克隆抗体或多克隆抗体，这些抗体的特征在于它们 特异性地识别根据本发明的多肽。有利的是，根据由Kohler和Milstein在1975年描述的 技术从杂交瘤制备所述单克隆抗体是可能的。例如，通过用与所述免疫反应的佐剂相关联 的、根据本发明的多肽或DNA免疫动物特别是小鼠，然后在已事先固定了用作抗原的多肽 的亲和柱上纯化包含在免疫了的动物血清中特异性抗体来制备所述单克隆抗体是可能的。 根据本发明的多克隆抗体也可以通过在已事先固定了用作抗原的多肽的亲和柱上纯化包 含在动物血清中的抗体来制备，所述动物通过免疫的方式受到酸热脂环酸杆菌或者根据本 发明的多肽或片段攻击。本发明同样涉及单克隆或多克隆抗体或者它们的片段、或者嵌合抗体，其特征在 于它们能够特异性识别根据本发明的多肽。对于本发明的抗体来说，用与之前对本发明的核酸探针所述相同的方式如酶的、 荧光的或放射性类型的标记来标记它们同样是可能的。本发明另外涉及用于在样品中检测和/或鉴定酸热脂环酸杆菌的方法，其特征在 于它包括以下步骤a)将所述样品与根据本发明的单克隆或多克隆抗体相接触(在允许所 述抗体与可能存在于所述生物样品中的酸热脂环酸杆菌的多肽之间免疫反应的条件下)； b)显示可能形成的抗原抗体复合物。本发明同样涉及用于在样品中检测和/或鉴定酸热脂环酸杆菌的方法，其特征在 于它采用根据本发明的核苷酸序列。更具体而言，本发明涉及用于在样品中检测和/或鉴定酸热脂环酸杆菌的方法， 其特征在于它包括以下步骤a)如果需要的话，从待分析的样品中分离DNA ；b)借助根据本 发明的至少一种引物或一对引物特异性扩增所述样品的DNA ；c)显示扩增产物。例如，这些可以利用根据本发明的核酸探针通过分子杂交技术来检测。这种探针 将有利地用非放射性元素(冷探针)或放射性同位素标记。出于本发明的目的，“生物样品的DNA”或“包含在生物样品中的DNA”将被理解为 表示在所考虑的生物样品中存在的DNA或可能在逆转录酶类型的酶对所述生物样品中存 在的RNA作用后所获得的cDNA。本发明的另外的实施方案包括一种方法，其特征在于它包括以下步骤a)将根据 本发明的核苷酸探针与生物样品相接触，如果需要，包含在所述生物样品中的DNA在允许 所述探针与所述样品的DNA杂交的条件下之前已变得容易杂交；b)显示在所述核苷酸探针 与所述生物样品的DNA之间所形成的杂交体。本发明还涉及根据本发明的一种方法，其特征在于它包括以下步骤a)将固定在 根据本发明的支持体上的核苷酸探针与生物样品相接触，如果需要所述样品的DNA在允许所述探针与所述样品的DNA杂交的条件下之前已变得容易杂交；b)将在支持体上固定的所 述核苷酸探针与包含在生物样品的DNA之间所形成的杂交体，如果需要在将没有与所述探 针杂交的所述生物样品的DNA清除后，与根据本发明的标记了的核苷酸探针相接触；c)显 示在步骤b)中所形成的新的杂交体。根据之前所定义的检测和/或鉴定的方法的有利的实施方案，其特征在于，在步 骤a)之前，首先借助根据本发明的至少一种引物扩增所述生物样品中的DNA。方法的实施方案包括用第二多肽糖基化或翻译后修饰第一多肽，所述第二多肽选 自由对 SEQ ID No. 1、18、35、52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、222、239、256、273、 290和309具有至少90%的序列同一性的多肽所组成的组。方法的另外的实施方案包括调节蛋白的稳定性、溶解性、降解性、活性特征和/或 第一多肽的分泌的方法，所述方法包括通过第二多肽来糖基化或翻译后修饰所述第一多 肽，所述第二多肽选自由对 SEQ ID NO :1、18、35、52、69、86、103、120、137、巧4、171、188、 205、222、239、256、273、290和309具有至少90%的序列同一性的多肽所组成的组。方法的另外的实施方案包括将产生或编码一种重组的、纯化的、和/或分离的核 苷酸序列的细胞和/或一种重组的、纯化的和/或分离的多肽放在包括等于或高于约25、 30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90和/或95摄氏度的温度和/或等于、低于和 /或高于8、7、6、5、4、3、2、1和/或0的pH的环境中，所述核苷酸序列包括选自由以下组 成的组的核苷酸序列对 SEQ ID No :2、19、36、53、70、87、104、121、138、155、172、189、206、 223、对0、257、274、四1和310的序列中的至少一个具有至少90%的序列同一性的核苷酸序 列；所述多Jft选自由对SEQ IDNo. 1、18、35、52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、222、 239、256、273、290和309的序列中的至少一个具有至少90%的序列同一性的多肽所组成的 组。本发明提供了已被遗传处理具有改变的产生表达蛋白的能力的细胞。特别的， 本发明与革兰氏阳性微生物相关，例如具有感兴趣蛋白的提高表达的杆菌种类，其中一种 或多种染色体基因被失活，和/或其中一种或多种染色体基因已经从所述杆菌染色体中删 除。在另外一些实施方案中，一种或多种天然的染色体区域已经从相应的野生型杆菌宿主 染色体中删除。在另外的实施方案中，所述杆菌是脂环酸杆菌属的某个种或者是酸热脂环 酸杆菌。在另外的实施方案中，在等于或高于约25、30、；35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、 85、90、和/或95摄氏度的温度和/或在等于、低于和/或高于8、7、6、5、4、3、2、1、和/或 0的pH时糖基化和/或翻译后修饰一种多肽的方法，是通过一种重组的、纯化的、和/或分 离的核苷酸序列和/或一种重组的、纯化的和/或分离的多肽实施的，所述核苷酸序列包括 选自由以下组成的组的核苷酸序列对SEQ ID NO :2、19、36、53、70、87、104、121、138、155、 172、189、206、223、对0、257、274、四1和310的序列的至少一个具有至少90%的序列同一性 的核苷酸序列，所述多肽选自由对 SEQ ID No. 1、18、35、52、69、86、103、120、137、154、171、 188、205、222、239、256、273、290和309的序列中的一个具有至少90%的序列同一性的多肽 所组成的组。在本发明的实施方案中，根据本发明的任何一种分离的和/或纯化的多肽在等于 或高于约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、和/或95摄氏度的温度下可以具有酶活性或功能活性，和/或在等于或低于和/或高于8、7、6、5、4、3、2、1、和/或0的pH 下可以具有酶活性或功能活性。在本发明的其他实施方案中，糖基化、聚乙二醇化和/或其 他的翻译后修饰可能为根据本发明的分离的和/或纯化的多肽所需要，所述多肽在等于或 低于 8、7、6、5、4、3、2、1、和 / 或 0 的 pH、或者在等于或高于约 25、30、35、40、45、50、55、60、 65、70、75、80、85、90、和/或95摄氏度的温度具有酶活性或功能活性。在以下用作说明的实施例中对本发明进行了另外详细的描述。尽管所述实施例可 能仅代表本发明的选择的实施方案，但应该理解以下实施例是用作说明的而非限制。实施例实施例1 使用来自酸热脂环酸杆菌的核苷酸和氨基酸序列的糖基化在SEQID NO :2、19、36、53、70、87、104、121、138、155、172、189、206、223、240、257、 274、291和310中提供了从酸热脂环酸杆菌中分离的并且分别编码SEQ ID N0:l、18、35、 52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、222、239、256、273、290 和 309 的多肽的核苷酸 序列。使用本领域中的标准技术将 SEQ ID NO :2、19、36、53、70、87、104、121、138、155、172、 189、206、223、240、257、274、291和310的核苷酸序列放到表达载体中。然后将所述载体 提供给细胞，如细菌细胞或真核细胞例如Sf9细胞或CHO细胞。结合存在于细胞中的正常 构件，包含 SEQ ID NO :2、19、36、53、70、87、104、121、138、155、172、189、206、223、对0、257、 274,291 和 310 的所述载体产生了 SEQ ID NO :1、18、35、52、69、86、103、120、137、154、171、 188、205、222、239、256、273、290 和 309 的多月太。然后分离和 / 或纯化 SEQ ID NO :1、18、35、 52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、222、239、256、273、290 和 309 的多肽。于是 SEQ ID NO :1、18、35、52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、222、239、256、273、290 和 309 的分离的和/或纯化的多肽各自表现出具有表1提供的一种或多种活性。SEQ ID No 1、18、35、52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、222、239、256、 273,290和309的分离的和/或纯化的多肽与其他蛋白或细胞组分联合显示出具有使其他 蛋白糖基化的活性。实施例2 使用来自酸热脂环酸杆菌的核酸和氨基酸序列调节蛋白的稳定性、溶 解性、降解性、活性特征，和/或第一多肽的分泌通过糖基化或其他翻译后修饰，实施例1的多肽和核苷酸序列用于翻译后修饰一 种或多种其他蛋白。与具有相同或相似的氨基酸序列的未经修饰的蛋白对比，所述修饰的 蛋白显示具有改变的蛋白稳定性、溶解性、降解性、活性特征、和/或分泌。实施例3 酸热脂环酸杆菌的糖基化蛋白多肽RMC(^676(SEQ ID NO :307)是通过以下的方案获得的。在小麦阿拉伯木聚糖 上培养酸热脂环酸杆菌并且在三天之后收集。将培养物离心以去除细胞并且用0. 22微米 的滤器过滤所得的上清液以去除任何残留的碎片。通过10，000道尔顿分子量截留膜的超 滤作用将经过过滤的上清液浓缩到大约lmL。将所得的浓缩的过滤上清液通过以下另外纯 化将蛋白捕获在阳离子交换柱上，用盐梯度洗脱它们，重新加载到第二个阳离子交换柱上 并且用第二种盐梯度洗脱它们。将样品汇集并且在12% SDS-PAGE的凝胶上进行电泳。将单 独的条带从凝胶上切下来并且使其经历凝胶内胰蛋白酶消化。然后将所述肽片段洗脱，并 且在C-18柱子上分离，并通过电喷射注射进入离子阱质谱仪。通过MASCOT运行质谱，它将 观测到的谱线与从已知蛋白序列产生的理论谱线相比较。MASCOT允许使用者指明可能存在于蛋白上的特定修饰，并且找出与这些修饰一致的谱线。MASCOT鉴别出许多从RAAC(^676 消化的肽，如以下表2提供的，所述肽可能被糖基化。如在表2中可见，查询号94、96、221、332、333、337和400返回RAAC02676上预期 的糖基化。表2中的所有片段是SEQ ID NO :307(RAAC02676)的片段。在SEQ ID NO :308 中提供了根据确定的位点的RAAC(^676的糖基化形式。表2查询号实测Mr(预期)Mr(计算)ppm未中得分预期排名肽17398.1406794.2667794.4174-189.650(24)731K.YGDIVTK.N18398.1591794.3037794.4174-143.080(28)382K.YGDIVTK.N19398.1596794.3047794.4174-141.820550.0731K.YGDIVTK.N20398.1621794.3097794.4174-135.530(41)1.71K.YGDIVTK.N77569.17811136.34171136.5461-179.860(46)0.411R.EINAYAGSNAKN78569.17961136.34471136.5461-177.220620.0111R.EINAYAGSNAK.N94579.67761157.34071157.5676-196.020346.91R.QNGLSPSDLART + Glyc-Asn (N)96579.70711157.39971157.5676-145.050(20)2.5e+023R.QNGLSPSDLART + Glyc-Asn (N)138721.23861440.46271440.7394-192.070(62)0.0191R.EPNGDIALMLVN R.S139721.24111440.46771440.7394-188.600820.000221R.EPNGDIALMLVN R.S207987.87961973.74471974.0098-134.270(130)6.2e-091R.AVGLFYQSFLTEIGQSSICA208987.87961973.74471974.0098-134.270(123)2.8e-081R.AVGLFYQSFLTEI GQSSK.A209987.88011973.74571974.0098-133.760(71)0.00451R.AVGLFYQSFLTEI GQSSK.A210987.89861973.78271974.0098-115.0201405.9e-101R.AVGLFYQSFLTEI GQSSKA216661.18221980.52471980.8966-187.710(37)4.11R.WPGGSISDVYN WETNTR.N217991.31961980.62471980.8966-137.230(59)0.0531R.WPGGSISDVYN WETNTR.N218991.34111980.66771980.8966-115.520(42)3.61R.WPGGSISDVYN WETNTR.N219991.34611980.67771980.8966-110.470(31)401R.WPGGSISDVYN WETNTR.N221991.83961981.66471981.8806-108.910850.000161R.WPGGSISDVYN WETNTR.N + Glyc-Asn (N)265731.93922192.79572193.2117-189.660690.00861R.GSNAAQILQTLQ SISPLLSPR.A2661097.45612192.89772193.2117-143.150(31)561R.GSNAAQILQTLQ SISPLLSPR.A2861133.46062264.90672265.1892-124.700(31)582R.SPSTIYSADLNVL GVGPYAITKA2871133.47862264.94272265.1892-108.810(48)0.951R.SPSTIYSADLNVL GVGPYAITKA2881133.48112264.94772265.1892-106.600700.00731R.SPSTIYSADLNVL GVGPYAITKA289756.15952265.45672265.18921180(21)4.5e+029R.SPSTIYSADLNVL GVGPYAITK.A
3091177.99862353.98272354.2481-112.720680.0121K.ALVYGEGSSAVS PALTLPTAHSVK.L3101178.00162353.98872354.2481-110.170(51)0.591K.ALVYGEGSSAVS PALTLPTAHSVK.L3111178.00862354.00272354.2481-104.220(54)0.261K.ALVYGEGSSAVS PALTLPTAHSVK.L3191182.93812363.86172364.1346-115.410(91)5.1e-051R.TWSSFETQVDPQ GAAQTALATR.I3201182.93862363.86272364.1346-114.990(109)7.9e-071R.TWSSFETQVDPQ GAAQTALATR.I3211182.94162363.86872364.1346-112.450(115)2.1e-071R.TWSSFETQVDPQ GAAQTALATR.I3221182.97812363.94172364.1346-81.570(83)0.000361R.TWSSFETQVDPQ GAAQTALATR.I3231182.98662363.95872364.1346-74.3801261.6e-081R.TWSSFETQVDPQ GAAQTALATR.I324789.18252364.52572364.13461650(17)l.le+039R.TWSSFETQVDPQ GAAQTALATR.I3301188.32812374.64172374.18511920887.6e-051K.GNPGLSPQAYAQ NALQFIQAMR.A3321188.41762374.82072375.1691-146.690(72)0.00421K.GNPGLSPQAYAQ NALQFIQAMRA + Glyc-Asn (N)3331188.41812374.82172375.1691-146.260(76)0.00191K.GNPGLSPQAYAQ NALQFIQAMRA + Glyc-Asn (N)3371188.94062375.86672376.1531-120.540(66)0.0171K.GNPGLSPQAYAQ NALQFIQAMR.A + 2 Glyc-Asn (N)3971288.54162575.06872575.3605-113.300(130)8.2e-091R.QASSSIVGNALAQAASLSPTISAYLR. Q3981288.56212575.10972575.3605-97.3801352.6e-091R.QASSSIVGNALA QAASLSPTISAYLR Q399859.50022575.47872575.360545.90(64)0.0341R.QASSSIVGNALA QAASLSPTISAYLR. Q400859.85792576.55172576.344580.40(74)0.00351R.QASSSIVGNALA QAASLSPTISAYLR Q + Glyc-Asn (N)实施例4 来自酸热脂环酸杆菌的蛋白的糖蛋白染色在小麦阿拉伯木聚糖上培养酸热脂环酸杆菌并且三天后收集。将培养物离心去除 细胞，并且用0. 22微米的滤膜过滤所得的上清液以去除任何残留的碎片。通过10，000道 尔顿分子量截留膜的超滤作用将经过过滤的上清液浓缩到大约lmL。使用标准方案，将这种 浓缩材料的几条泳道与已知是糖基化的和未糖基化的蛋白的阳性和阴性对照一起在12% SDS-PAGE的凝胶上电泳。所述凝胶被纵向地切成两半，其中一半使用Simply Blue Safe Stain染色，而另一半使用来自Sigma的糖蛋白检测试剂盒。阳性和阴性对照都用Simply Blue染料染色，只有阳性对照用糖蛋白染料染色，用以显示所述染色方案正确地工作。在 Simply Blue染色的胶上，所述酸热脂环酸杆菌蛋白的泳道揭示在大约120千道尔顿的一 条带，这是酸热脂环酸杆菌的一种细胞外蛋白的预期分子量。在糖蛋白染色的胶上的所述 相同位置显示粉红色的条带，指示对于糖基化蛋白的阳性结果。当已经在某些实施方案中描述本发明时，在本公开的精神和范围内可以进一步修 改本发明。因此，本申请旨在覆盖使用其一般原理的本发明的任何变化、使用或改编。此 外，本申请旨在覆盖对本公开的背离当出现在本发明所属领域中已知的或习惯性的实践之 内时，这些背离落在所附权利要求书及其法律等同物的限制之内。参考文献目录Barany, F. , 1911,PNAS. USA, 88 :189-193.(巴拉尼，F.，1911，美国科学院院刊.美 国，88 :189-193.)Borman, S.,2006, Glycosylation Engineering. Chem. Eng. News,84(36) 13-22. 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权利要求
1.一种分离的或纯化的核酸序列，包括编码一种多肽的核酸序列，所述多肽对SEQ ID No. 1具有至少90%的序列同一性。
2.如权利要求1所述的分离的或纯化的核酸序列，其中所述多肽在等于或低于大约PH 8时具有酶活性。
3.如权利要求1所述的分离的或纯化的核酸序列，其中所述多肽在等于或高于大约35 摄氏度的温度具有酶活性。
4.如权利要求1所述的分离的或纯化的核酸序列，其中所述核酸序列存在于载体中。
5.一种分离的或纯化的多肽，包括对SEQ ID No. 1具有至少90%的序列同一性的多肽。
6.如权利要求5所述的分离的或纯化的多肽，其中所述多肽在等于或低于大约pH8时 具有酶活性。
7.如权利要求5所述的分离的或纯化的多肽，其中所述多肽在等于或高于大约35摄氏 度的温度具有酶活性。
8.如权利要求5所述的分离的或纯化的多肽，其中所述多肽是糖基化的、聚乙二醇化 的、或其他方式的翻译后修饰的。
9.如权利要求5所述的分离的或纯化的多肽，其中所述多肽具有糖基转移酶活性。
10.一种在等于或高于大约；35摄氏度的温度或者在等于或低于约8的pH时糖基化或 翻译后修饰第一多肽的方法，所述方法包括提供由一种核苷酸序列所编码的重组的、纯化的、或分离的多肽，所述核苷酸序列包括 对SEQ ID NO 2具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列；用所述的重组的、纯化的、或分离的多肽糖基化或翻译后修饰所述第一多肽。
11.根据权利要求10所述的方法，其中糖基化或翻译后修饰所述第一多肽发生在等于 或低于大约PH 8。
12.根据权利要求10所述的方法，其中糖基化或翻译后修饰所述第一多肽发生在等于 或高于大约35摄氏度的温度。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述重组的、纯化的、或分离的多肽是糖基化 的、聚乙二醇化的、或其他方式的翻译后修饰的。
14.根据权利要求10所述的方法，其中所述重组的、纯化的、或分离的多肽具有糖基转 移酶活性。
15.一种调节所述蛋白的稳定性、溶解性、降解性、活性特征、或第一多肽的分泌的方 法，所述方法包括提供由一种核苷酸序列所编码的重组的、纯化的、或分离的多肽，所述核苷酸序列包括 对SEQ ID NO 2具有至少90%序列同一性的核苷酸序列；用所述重组的、纯化的、或分离的多肽糖基化或翻译后修饰所述第一多肽。
16.根据权利要求15所述的方法，其中糖基化或翻译后修饰所述第一多肽发生在等于 或低于大约PH 8。
17.根据权利要求15所述的方法，其中糖基化或翻译后修饰所述第一多肽发生在等于 或高于大约35摄氏度的温度。
18.根据权利要求15所述的方法，其中所述重组的、纯化的、或分离的多肽是糖基化的、聚乙二醇化的、或其他方式的翻译后修饰的。
19.根据权利要求15所述的方法，其中所述重组的、纯化的、或分离的多肽具有糖基转 移酶活性。
20.一种分离或纯化的核酸序列，包括编码一种多肽的核酸序列，所述多肽选自由对 SEQ ID No 1、18、35、52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、222、239、256、273、290 和 309具有至少90%序列同一性的多肽所组成的组。
21.如权利要求20所述的分离的或纯化的核酸序列，其中所述多肽在等于或低于大约 PH 8时具有酶活性。
22.如权利要求20所述的分离的或纯化的核酸序列，其中所述多肽在等于或高于大约 35摄氏度的温度具有酶活性。
23.如权利要求20所述的分离的或纯化的核酸序列，其中所述核酸序列存在于载体中。
24.—种分离的或纯化的多肽，包括选自由以下组成的组的多肽对SEQ ID NO :1,18, 35、52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、222、239、256、273、290和 309 具有至少 90%序列同一性的多肽。
25.如权利要求M所述的分离的或纯化的多肽，其中所述多肽在等于或低于大约pH8 时具有酶活性。
26.如权利要求M所述的分离的或纯化的多肽，其中所述多肽在等于或高于大约35摄 氏度的温度具有酶活性。
27.如权利要求M所述的分离的或纯化的多肽，其中所述多肽是糖基化的、聚乙二醇 化的、或其他方式的翻译后修饰的。
28.如权利要求M所述的分离的或纯化的多肽，其中所述多肽具有选自由UDPβ-葡 萄糖磷酸转移酶、多萜醇磷酸甘露糖基转移酶、和糖基转移酶的活性所组成的组的活性。
29.在等于或高于大约35摄氏度的温度或者在等于或低于大约8的ρΗ时糖基化或翻 译后修饰第一多肽的一种方法，所述方法包括提供由一种核苷酸序列所编码的重组的、纯化的、或分离的多肽，所述核苷酸序列包括 选自由以下组成的组的核苷酸序列对SEQ ID NO :2、19、36、53、70、87、104、121、138、155、 172、189、206、223、对0、257、274、四1和310的序列中的至少一个具有至少90%的序列同一 性的核苷酸序列；用所述重组的、纯化的、或分离的多肽糖基化或翻译后修饰所述第一多肽。
30.根据权利要求四所述的方法，其中糖基化或翻译后修饰所述第一多肽发生在等于 或低于大约PH 8。
31.根据权利要求四所述的方法，其中糖基化或翻译后修饰所述第一多肽发生在等于 或高于大约35摄氏度的温度。
32.根据权利要求四所述的方法，其中所述重组的、纯化的、或分离的多肽是糖基化 的、聚乙二醇化的、或其他方式的翻译后修饰的。
33.根据权利要求四所述的方法，其中所述重组的、纯化的、或分离的多肽具有选自由 UDP β -葡萄糖磷酸转移酶、多萜醇磷酸甘露糖基转移酶、和糖基转移酶的活性所组成的组 的活性。
34.一种调节所述蛋白的稳定性、溶解性、降解性、活性特征、或第一多肽的分泌的方 法，所述方法包括提供由一种核苷酸序列所编码的重组的、纯化的、或分离的多肽，所述核苷酸序列包括 选自由以下组成的组的核苷酸序列对SEQ ID NO :2、19、36、53、70、87、104、121、138、155、 172、189、206、223、对0、257、274、四1和310的序列中的至少一个具有至少90%序列同一性 的核苷酸序列；用所述重组的、纯化的、或分离的多肽糖基化或翻译后修饰所述第一多肽。
35.根据权利要求34所述的方法，其中糖基化或翻译后修饰所述第一多肽发生在等于 或低于大约PH 8。
36.根据权利要求34所述的方法，其中糖基化或翻译后修饰所述第一多肽发生在等于 或高于大约35摄氏度的温度。
37.根据权利要求34所述的方法，其中所述重组的、纯化的、或分离的多肽是糖基化 的、聚乙二醇化的、或其他方式的翻译后修饰的。
38.根据权利要求34所述的方法，其中所述重组的、纯化的、或分离的多肽具有选自由 UDP β -葡萄糖磷酸转移酶、多萜醇磷酸甘露糖基转移酶、和糖基转移酶的活性所组成的组 的活性。
全文摘要
提供了来自酸热脂环酸杆菌的分离的和/或纯化的多肽和编码多肽的核酸序列。还提供了使用来自酸热脂环酸杆菌的分离的和/或纯化的多肽和核酸序列用于糖基化和/或翻译后修饰蛋白的方法。
文档编号C12N15/11GK102046802SQ200980106043
公开日2011年5月4日 申请日期2009年2月26日 优先权日2008年2月27日
发明者D·N·汤普森, D·W·里德, J·A·莱西, V·S·汤普森, W·A·阿佩尔 申请人:巴特勒能源同盟有限公司