专利名称：使用提高肿瘤细胞对放射疗法和/或化学疗法敏感性的物质的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用提高肿瘤细胞对放射疗法和/或化学疗法敏感性的物质。
背景技术：
用放射线和/或细胞抑制剂(化学疗法)杀灭人体癌细胞是人类与癌症作斗争最 重要的疗法。但是，如今人们还不能完全靶向地杀灭肿瘤组织，在治疗过程中健康的组织也 受到损害，从而产生严重的副作用，降低了患者痊愈的可能性。因此，人们需要这样一种疗 法可以靶向地、持续时间尽可能短地实施治疗，从而使副作用尽可能小。现代的放射疗法 可以达到这些要求，这种疗法可以杀灭肿瘤内部最重要的细胞群体，即肿瘤细胞，并有效地 防止其在治疗后重新生长(肿瘤复发)。但是在某些临床条件下无法使用这种放射剂量，因 此必须同时使用化学疗法和/或新型的分子疗法，才能消灭肿瘤干细胞。下面所介绍的一 些临床活体外和活体内试验表明，究竟是针对某种特定分子的分子疗法单独使用就可以杀 灭肿瘤干细胞，还是需要与放射疗法结合才能杀灭肿瘤干细胞。如果成功使用这种疗法，患 者就可以治愈，并且肿瘤不会复发。评价靶向分子疗法治疗效果的另一个决定性标准是了 解肿瘤组织中是否有目标分子。利用人体肿瘤活组织进行的这些试验，目的是检验相关的 分子究竟是表达还是高表达。
发明内容
本发明的目的是提高肿瘤细胞在放射治疗和/或化学治疗中的敏感性，从而缩短 放射治疗和/或化学治疗的时间，降低其强度，从而最终减小其副作用。根据本发明，通过施用可以锁定或限制PINCH-I蛋白的功能的物质达成了这 个目的。PINCH-I蛋白在有关文献中还被称为LIMSl或者“LIM and senescent cell antigenlike domains 1”。根据本发明，向肿瘤细胞施用本发明所述的物质。本发明中所指 的肿瘤细胞既可以是在各种形式的恶性肿瘤疾病中出现在血液系统肿瘤中的，也可以是出 现在固体肿瘤中的。本发明令人惊讶地表明，锁定肿瘤细胞中的PINCH-I蛋白(的功能或 者表达)可以提高肿瘤细胞对放射和化学治疗的敏感性。用放射线和/或细胞抑制剂(化 学疗法)治疗后的检查结果表明，癌细胞的存活率比没有锁定PINCH-I蛋白时要低的多。在化学疗法中例如可以使用顺钼或丝裂霉素C，但是也可以根据需要治疗的肿瘤 病使用所有其它的化学疗法。化学疗法中所使用的物质主要是5'-脱氧-5-氟尿苷、 5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、9-氨基喜树碱、阿巴瑞克、阿扎胞苷、放线菌素D、阿 地白介素、阿仑单抗(MabCampath )、阿利维A酸、六甲蜜胺、双氢胺蒽醌、氨磷汀、氨基 苯乙哌啶酮、安吖啶、氯咪喹酮、阿那曲唑、砒霜、天冬酰胺酶、阿曲生坦(Xinlay )、咪唑硫 嘌呤、注射卡介苗(Theracys)、盐酸苯达莫司汀、贝伐单抗、贝沙罗丁、比卡鲁胺、Biolimus A9 (雷帕霉素衍生物)、博来霉素、硼替佐米、乙基酰胺、白消安、烯二炔类高效抗肿瘤抗生 素、卡鲁睾酮、喜树碱、卡培他滨、卡钼、卡莫司汀、西妥昔单抗、苯丁酸氮芥、氯乙胺、盐酸西那卡塞、顺钼、克拉屈滨、环磷酰胺、抗雄性激素制剂、胞嘧啶阿拉伯糖苷、阿糖胞苷、氮 烯唑胺、放线菌素D、阿法达贝泊汀、达沙替尼(Sprycel )、道诺霉素、地尼白介素、右丙亚 胺、多西他奇、阿霉素(Adriamycin)、甲雄烷酮、埃利奥、表柔比星(4_EpiAdriamycin)、埃 罗替尼(Tarceva )、红细胞生成素、雌氮芥、依托泊苷、依维莫司(Certicane )、依西美 坦、优保津、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、氟他胺、福美坦、磷雌酚、氟维司群、粒细胞集落 刺激因子、吉非替尼(Iressa )、2、2-二氟脱氧胞嘧啶核苷、吉妥单抗、戈舍瑞林、羟基脲 (Hydroxyurea)、替伊莫单抗(Zevalin )、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、干扰素α、依 立替康、伊沙匹隆、兰瑞肽、拉帕替尼(Tykerb )、来拉度胺(Revlimid )、来曲唑、甲酰四 氢叶酸、亮丙瑞林、左旋咪唑、Lonafarnib (Sarasar )、11-2、洛莫司汀、美登醇、盐酸氮 芥、甲地孕酮、美法仑、巯基嘌呤、巯乙磺酸钠、密都锭、甲氧沙林、甲基强的松龙、米替福新、 丝裂霉素C、米托鬼白胼、米托坦、米托蒽醌、苯丙酸诺龙、奈拉滨、尼洛替尼(Tasigna )、 尼莫司汀、诺非单抗、奥利默森纳、醋酸奥曲肽、奥普瑞白介素、奥沙利钼、氧氮杂膦、紫杉 醇和紫杉醇衍生物、帕米膦酸二钠、帕尼单抗、培加酶、培门冬酶、聚乙二醇非格司亭、培美 曲塞、喷司他丁、哌血生、普卡酶素、鬼白毒素衍生物、聚苯丙生、P卜吩姆钠、泼尼松、丙卡 巴胼、奎纳克林、雷替曲塞、雷帕霉素(Sirolimus)、拉布立酶、视黄醇、紫红霉素D、美罗华 (MabThera )、沙格司亭、索拉非尼(Nexavar )、链佐星、舒尼替尼(Sutent )、他莫昔 芬、替加氟、替莫唑胺、坦罗莫司、替尼泊甙、睾内酯、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、替吡法尼 (Zamestra )、拓扑替康(拓扑异构酶I抑制剂)、托瑞米芬、百克沙、曲贝替定、曲妥单抗 (Herceptin )、曲奥舒凡、维甲酸、曲普瑞林、曲磷胺、乌拉莫司汀、戊柔比星、异长春花碱、 长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨和唑来膦酸盐。放射方式主要使用光子放射(X线放射，y放射)、电子放射、质子放射或重离子放 射(l-H,2-He,7-Li,9-BeUl-B, 12-C, 14-N 16-0) 本发明的主要内容是使用可以提高肿瘤细胞对放射和/或化学疗法敏感性的物 质，其方法是在基因表达层面或者蛋白层面上锁定或限制PINCH-I蛋白的功能。此外，本发明还包括了一种治疗肿瘤患者的方法，也就是首先通过施用在基因表 达层面或者蛋白层面上锁定或限制PINCH-I蛋白功能的物质提高肿瘤细胞对放射疗法和/ 或化学疗法的敏感性，然后用放射疗法和/或化学疗法进行治疗。治疗人体组织上的良性 或恶性肿瘤的方法包括下列步骤a)在患有肿瘤疾病的生物全身或局部施用一种或多种在基因表达层面或者蛋白 层面上锁定或限制PINCH-I蛋白功能的物质，从而提高肿瘤对在b)步骤实施的放射和/或 化学治疗的敏感性。b)然后用放射和/或化学疗法治疗肿瘤。生物既可以是动物，也可以是人。本发明所述的方法尤其适用于人体。在本发明中，可以锁定或限制PINCH-I蛋白功能的物质涵盖的范围十分广泛。其 中既包括在蛋白层面上通过直接捆绑而抑制PINCH-I蛋白的物质，例如抗体、自然配体或 改性配体，也包括在转录或者转录后层面上阻断或大幅减少基因表达，从而不形成PINCH-I 蛋白或者减少PINCH-I蛋白形成量的物质，例如RNA干扰素或者转录因子。使用本发明所述的物质特别适合所有类型存在PINCH-I蛋白的肿瘤，尤其是PINCH-I蛋白在其中过度表达的肿瘤。锁定PINCH-I蛋白功能的物质，在本发明中指的是适用于在基因表达层面或者蛋 白层面上减弱、抑制或者阻断PINCH-I蛋白功能的物质。主要包括有机化合物、肽类似物、 模拟肽、核酸、寡核苷酸、多聚核苷酸、抗体等。这些物质既可以直接作为活性物质施用，也 可以通过身体内部的新陈代谢形成“前药”。本发明所述的、可以锁定或限制PINCH-I蛋白功能的物质，主要是PINCH-I蛋白抗 体、PINCH-l-dsRNA、PINCH-l-siRNA、PINCH-I-短发夹状 RNA 和 PINCH-I-吗啡啉(也称为 注射吗啡啉修饰的反义寡核苷酸、phosphorodiamidate morpholino oligos或PMOs)。在本发明的一个实施方式中，使用了 PINCH-I蛋白抗体，这种抗体能够靶向地识 别和捆绑PINCH-I蛋白。在向肿瘤细胞施用这种抗体之后，用放射和/或化学疗法治疗肿 瘤细胞。抗体通过与PINCH-I蛋白的捆绑锁定了其功能，从而提高了肿瘤细胞对放射和/ 或化学疗法的敏感性。从而大大降低了用放射和/或化学疗法治疗后的癌细胞存活率。在此主要使用单克隆PINCH-I抗体，尤其是人化抗体。人化单克隆抗体包括本发 明所述单克隆抗体捆绑PINCH-I蛋白的超变区和人体抗体轻链和重链的可变区和恒定区 的构架区。人们已经知道了生产人化抗体的方法，主要是由Morrison (1984)、Jones (1986)、 Verhoeyen (1988)、Riechmann (1988)、Queen (1989)和 Tempest (1991)等科学家阐述的。本发明所指的抗体此外还可以是抗体的不同改性形式，例如抗体片段，也就是FV 片段、Fab片段、(Fab) ‘ 2片段或者单链抗体(利用基因技术生产的双重特殊抗体，由两个 通过短链连接的结合区域组成)。人们已经知道了 F(ab2)或F(ab)片段的生产工艺，主要 是在《免疫学》一书(John Wiley & Sons，http://www.wiley.com/legacy/cp/cpi/)的实 验室操作指南中阐述的。本发明所述的抗体例如IgGl同型的鼠抗单克隆PINCH-I蛋白抗体(Klon PINCH-C58 ；Sigma-Aldrich, DE)、IgM 同型的鼠抗单克隆 PINCH-1 蛋白抗体(Klon PINCH-N173 ；Sigma-Aldrich, DE)和 IgG2a 同型的鼠抗单克隆 PINCH 蛋白抗体(Klon 49 ； Becton Dickinson, DE)。在本发明的另一种实施形式中，通过使用RNA干扰素(RNAi)抑制PINCH-I编码基 因的表达。RNA干扰指的是一种机制，即通过使用可以识别目标的RNA分子抑制基因的表达。在一个优选的实施方式中，通过RNA干扰而抑制PINCH-I蛋白表达的分子是 siRNA-(小干涉RNA)分子。siRNA分子是短的单链或双链RNA分子，可以靶向抑制目标基因 的表达。通过施用PINCH-1-siRNA可以防止肿瘤细胞表达PINCH-I基因，从而形成PINCH-I 蛋白。这样就提高了肿瘤细胞对放射疗法和/或化学疗法的敏感性。本发明优先使用的siRNA是18到30核苷酸的寡核苷酸，尤其是21到23核苷 酸的寡核苷酸，它们或者由一个与人体PINCH-l-cDNA(SEQ ID No. 1，Genbank Accession Number匪004987)的序列相同的RNA单链组成，或者由一个RNA双链组成，其中一链与 PINCH-l-cDNA(SEQ ID No. 1)的序列相同，另一链与第一链互补。序列相同意思是两个序列 至少有80%完全一致，最好是超过90%或者95%。PINCH-1-cDNA是DNA链条，制备方法是将从PINCH-I基因中转录而得的成熟mRNA 通过反转录酶制剂转录到一个与这个mRNA互补的DNA链条。
5
在siRNA的3'末端，此外还连接了两个胸腺嘧啶脱氧核苷残余物。humane PINCH-l-cDNA (SEQ IDNo. 1)1tagttcaagacaacagagacaaagctaagatgaggaagttctgtacagtttaggaaatag
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PINCH-1-cDNA指的是所有与SEQ ID No. 1的序列95%或以上相同，最好是98%或
以上相同的序列。用一种专业人员熟悉的方法制备siRNA。本发明所述PINCH-1-siRNA 的实例例如是 SEQ ID No. 2、SEQ IDNo. 3、SEQ ID No. 4 和SEQ ID No. 5的多聚核苷酸及其基因序列只有少许不同、但是也能锁定PINCH-I蛋白功 能的变体(同源性)。SEQ ID No.2至5的多聚核苷酸同源变体与多聚核苷酸的区别最多 不超过1到4个核苷酸，最好不超过1到2个核苷酸。1)GGACCUAUAUGAAUG⑶UUtt(SEQIDNo.2)
2)GGACUCUUCUAUGA⑶UUGtt(SEQIDNo.3)
3)GGAAGAAAGUACUOTGAACtt(SEQIDNo.4)
4)GCUAUAUCUCAAAGCA⑶Utt(SEQIDNo.5) 本发明还阐述了具有改性骨架的互补序列。具有改性骨架的核苷酸序列这个概念
6指的是所有其它线性聚合体，腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)，鸟嘌呤(G)和尿嘧啶(U)或胸腺激素 (T)在其中按照相应的顺序排列，例如具有由寡核苷酸、氨基磷酸酯或0-甲基衍生骨架的 核苷酸序列、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、具有混合骨架的核酸或者用吗啡啉以及荧光燃 料(绿色/红色/等，fluororescence proteins)标记的核苷酸序列，这些物质都可以抑 制PINCH-I基因的表达。在siRNA转染(也就是将靶向RNA分子植入真核细胞)后，用放射和/或化学疗 法治疗肿瘤细胞in vitro.放射源最好使用传统的200kVX射线管(13mA，-1. 3Gy/min)。细胞抑制剂例如可以使用顺钼(Platinex ，Bristol-Myers-Squibb公司，慕尼 黑)和丝裂霉素 C(Mitomycin medac , klinische SpezialprSparate公司，韦德尔)。
下面按照附图借助本发明的一个优选实施形式来对本发明进行进一步说明，其 中图1为蛋白质印迹；图2为治疗机理示意图；图3为蛋白质印迹；图4为治疗机理示意图；图5为治疗机理示意图；图6为肿瘤生长和放射后的肿瘤重现。
具体实施例方式实施例1 在永生化的胎鼠成纤维细胞中，使PINCH-I编码基因沉默。制备转基因老鼠的标 准方法例如在专利W0/1999/036528中已作阐述。通过使PINCH-I基因沉默，大大提高了细胞对X射线治疗或细胞抑制剂的敏感性， 也就是说与表达PINCH-I担保的对照组细胞相比，这些细胞在用放射疗法或化学疗法治疗 后的存活率明显降低。将细胞放入二维或三维培养模型，用X射线(200kV，13mA， 1，3 Gy/ min，O-IOGy)或浓度O-lOumol/1的细胞抑制剂顺钼(Platinex )或丝裂霉素C (Mitomycin medac ) (1小时或24小时)进行治疗。测量细胞群落存活率，也就是经过治疗细胞的完 整性。将增长的细胞群落固定并染色，用显微镜测定群落数量。图1展示了一个蛋白质印迹，表明在PINCH-I编码基因已经沉默的老鼠细胞中没 有形成PINCH-I蛋白(图右)，与之相反，在对照组细胞中有PINCH-I蛋白(图左)。图2展示了在二维(图2a、b、c)或三维(图2d)培养模型中用放射治疗或者细胞 抑制剂顺钼(图2b)、丝裂霉素C(图2c)治疗后，PINCH-I编码基因已经沉默的老鼠细胞的 群落存活率，以及野生型对照组细胞的群落存活率。实施例2 将HCT-116 (ATCC 编号 CCL-247)和 DLD-I (ATCC 编号 CCL-221)类型的人体结肠 直肠细胞株用SEQ ID No. 5的PINCH-1-siRNA转染。为此，各自将3x105个肿瘤细胞放 到6孔细胞培养板(BD公司，海德堡)的DMEM培养基(Gibco公司，卡尔斯鲁厄)中，播散Glutamax-I (丙氨酰谷氨酰胺)、10%的血清(FCS ；Biochrom公司，柏林)和的非必需氨 基酸(Gibco公司，卡尔斯鲁厄)，然后在温度37°C、C02浓度7%的条件下培养。在24小时 后，用Opti-MEM I (Invitrogen公司，卡尔斯鲁厄)洗涤这些细胞，然后用Oligofectamine 试剂(0. 2% )和20nmol/lPINCH-l-siRNA在无血清的条件下在Opti-MEM I中转染8小时。 接着加入10%的血清，将细胞在温度37°C、C02浓度7%的条件下继续孵育16小时。在转染 24小时后，用PBS磷酸盐缓冲液(PBS ；PAA, Colbe )洗涤这些细胞，然后用胰蛋白酶/EDTA 溶液溶解。一部分细胞用于测定放射治疗后的细胞群落存活率(细胞群落生成率试验)， 另一部分细胞继续培养24小时。为了检测蛋白质印迹中的敲除效果，由这个馏分生成蛋白 裂解液，用SDS-PAGE分离蛋白，转染到一个硝酸纤维膜上，用鼠抗PINCH-I蛋白抗体(Klon 49 ;BDHeidelberg)、连接过氧化酶的山羊抗鼠第二抗体和ECL系统(GE Healthcare，慕尼 黑)进行检测。如图3所示，蛋白质印迹表明成功地通过靶向siRNA序列阻止了 PINCH-I蛋 白的形成。用非靶向的对照组SiRNA(Co)或者只用转染试剂(Oligo，Oligofectamin)治疗 这些细胞，PINCH-I蛋白的表达没有任何变化。图4表明，用PINCH-1-siRNA治疗过的肿瘤 细胞在放射治疗后的存活率比带有对照组siRNA(Co或C0 siRNA)的肿瘤细胞低得多。用 20nmol/l的浓度转染siRNA，在48小时后用0_6Gy的剂量照射这些细胞。实施例3 通过用靶向PINCH-I抗体锁定PINCH-I蛋白，可以提高肿瘤细胞对放射或化学 疗法的敏感性。为了测定用PINCH-I抗体治疗后的单基因存活率，将肿瘤细胞放到24 孔细胞培养板(BD公司，海德堡)的DMEM培养基(Gibco公司，卡尔斯鲁厄)中，播散 Glutamax-I (丙氨酰谷氨酰胺)、10%的血清(FCS ；Biochrom公司，柏林)和的非必需 氨基酸(Gibco公司，卡尔斯鲁厄)。在37°C和C02浓度7%的条件下培养24小时后，加 入50ug/ml PINCH-I抗体或者非靶向对照组抗体(Santa Cruz公司，海德堡)，然后继续孵 育24小时。然后用240kV的X射线进行照射(Yxlon Y. TU 320，Yxlon，哥本哈根，丹麦； 20mA， 1. 3Gy/min)。在播散8天后，将这些细胞用80%的乙醇固定30分钟，用考马斯亮 蓝溶液染色，然后对具有超过50个细胞的细胞群落进行计数。图5展示了人体结肠直肠细胞株(HCT-116，DLD-1)的存活率，这些细胞株在 放射治疗(O 或 4Gy)前 24 小时用 PINCH-I 抗体(Klon PINCH-C58 (Sigma P8896)、Klon PINCH-N173 (Sigma P9371)、Κ1οη 49 (Beckton-Dickinson 目录编号 612711)或者非靴向对 照组抗体(Co)进行了处理。用靶向PINCH-I抗体处理过的肿瘤细胞对放射治疗的敏感性 比对照组肿瘤细胞大大提高。实施例4 为了检验 Pinch 1 fl/fl (Pinch 1 floxed/floxed)相对于 Pinchl-/-肿瘤细胞 在活体内的放射敏感性，在免疫抑制NMRI (nu/nu)小鼠身上植入同种异体肿瘤。这些肿瘤 细胞的特征是对放射的反应、生长率、增殖、氧气供应(Hypoxie)、血管对其的供应以及供 血。通过肿瘤体积以及直到局部重现治疗的时间测定肿瘤对放射的反应。为此，将7至14周大的雄性和雌性免疫抑制NMRI (基因型nu/nu ；没有胸腺和毛 发)小鼠(德累斯顿大学医学系实验中心)在移植肿瘤的1到5天前，采用全身照射(1x4 Gy,200kV X射线，0. 5mm铜滤镜，lGy/min))方法继续进行免疫抑制处理。实验动物房12小 时有灯光照明，12小时无照明(灯光在每天早上7点钟打开)，温度恒定保持在26°C，相对
8空气湿度50-60%。用一种市面上常见的实验室动物食谱和水喂养这些实验鼠。为了在活 体内产生同种异体肿瘤，将免疫抑制的Pinchl-/-和Pinch 1 fl/fl胎鼠成纤维细胞从皮 下植入受体实验鼠的双肩部位。在形成可以用触觉感知到的肿块之后，将肿瘤切开，从皮下 移植到一组实验鼠身上。从这些实验鼠中，将增长率达到平均值的肿瘤切开，分割成Imm大 小的小块，加入介质，为了接下来的试验将其保存在液态氮中。在实验时，将得到的肿瘤小块移植到5只实验鼠的后背(第一阶段)。在形成了直 径10到15mm的肿瘤后，将增长率达到平均值的肿瘤切开，分割成Imm大小的小块，移植到 另外10只实验鼠的后背(第二和第三阶段)。在实验过程中，将增长率达到平均值的第二 和第三阶段肿瘤切开，分割成Imm大小的小块，从皮下移植到右侧后腿。切开的肿瘤特点是 隔绝了 DNA或蛋白。用PRC仪检测在Pinchl-/-肿瘤中的Pinch 1敲除效果，以及在Pinch 1 fl/fl细胞中的Pinch 1 floxed序列。通过蛋白质印迹检测PINCH 1蛋白的表达。用200kV X射线(0. 5mm铜滤镜，放射剂量IGy/min，放射仪Seifert)对右侧后腿 实施局部照射。当肿瘤体积达到0. 10到0. 32cm3后，随机地将每四只实验鼠分为一组，用不 同的剂量进行照射。将实验鼠麻醉(腹腔内注射120mg氯胺酮(腹腔内)/kg体重和16mg 甲苯噻嗪/kg体重)，将有肿瘤大腿的血管夹住从而抑制血流，在2分钟后分别进行26、32、 38、44、50、56或62Gy剂量的照射。Pinch 1 fl/fl和Pinchl-/-肿瘤平均地分配在不同的 剂量组中。用游标卡尺每星期测量肿瘤直径两次。用球体体积计算公式(η /6ab2)计算肿瘤 的体积，其中a是最长的肿瘤轴，b是较短的、与其呈直角的肿瘤轴。从每个肿瘤的生长曲 线中，测定未经照射和经过照射的Pinch 1 fl/fl和Pinchl-/-肿瘤生长时间，也就是实验 开始后肿瘤体积达到初始体积2倍(TGTV2)或5倍(TGTys)所需的时间。用Marm-Whitney U非参数检验(GraphPad Prism软件4. 03版)比较Pinch 1 fl/fl和Pinchl-/-肿瘤的生 长时间平均值。肿瘤体积的测量一直持续到肿瘤体积达到大约1.5cm3为止。如果肿瘤体 积通过连续三次测量发现达到最低点后重新升高，则测定肿瘤在放射后重新的频率。对85Pinch 1 fl/fl和99 Pinchl-/-肿瘤的局部控制效果进行评估。在有Pinch 1 fl/fl和Pinchl-/-肿瘤的实验鼠身上，在照射的210天后测定所有重新出现的肿瘤。结 果表明，所有照射剂量为38Gy的Pinchl-/-肿瘤被控制在局部。对于Pinch 1 fl/fl肿瘤 而言，无论使用哪种剂量的射线都没有出现具备控制效果。根据Kaplan-Meier方法可以从 数学角度预估到局部重新出现肿瘤时的时间，然后用Log rank测试(GraphPad Prism软件 4. 03版)进行比较。用逐渐增大的X射线剂量(26_62Gy)照射肿瘤，在210天后进行观察。与活体内 的实验结果一致，Pinchl-/-同种异体与Pinch 1 fl/fl同种异体相比具有更高的放射敏 感性，无论是细胞生长的延迟还是不重现新肿瘤的肿瘤存活现象都说明了这一点。图6a表 明了在接受放射后的肿瘤体积，图6b是Kaplan-Meier分析，也就是对于免疫抑制实验鼠的 皮下增长Pinchl fl/fl和1-/-同种异体肿瘤而言，不重现新肿瘤的肿瘤存活现象。对于 肿瘤体积(图6a)而言，每个数据点都表示10到18只实验鼠的平均值士标准误差。关于 非放射性标记物BrdU、血管形成、氧气供应和坏死现象(用免疫组化方法进行检测；数据在 此不显示)无法测出Pinch 1 fl/fl和Pinchl-/-肿瘤之间有明显区别。PINCH-I对于接 受照射时的细胞存活率有决定性影响，与细胞外基质、生长条件在活体外还是在活体内以在的微环境无关。
权利要求
使用可以锁定或限制PINCH 1蛋白功能的物质，从而提高肿瘤细胞对放射和/或化学疗法的敏感性。
2.根据权利要求1所述的物质，其特征是，这种物质是PINCH-I抗体。
3.根据权利要求2所述的物质，其特征是，PINCH-I抗体是名为KlonPINCH-C58的 IgGl 同型鼠抗单克隆 PINCH-I 蛋白抗体(Sigma-Aldrich，DE)、名为 Klon PINCH-N173 的 IgM同型鼠抗单克隆PINCH-I蛋白抗体(Sigma-Aldrich，DE)和名为Klon 49的IgG2a同 型鼠抗单克隆PINCH蛋白抗体(Becton Dickinson，DE)。
4.根据权利要求1所述的物质，其特征是，这种物质可以抑制PINCH-I基因的表达。
5.根据权利要求4所述的物质，其特征是，这种物质可以在转录后抑制PINCH-I基因的 表达。
6.根据权利要求4所述的物质，其特征是，这种物质是PINCH-1-siRNA，并且siRNA既可以由a.一个由一个与人体PINCH-l-cDNA(SEQ ID No. 1)序列相同的单链组成，或者b.由一个RNA双链组成，其中一链与PINCH-I基因(SEQID No. 1)的部分序列相同，另一链与第一链互补。
7.根据权利要求4所述的物质，其特征是，从SEQID No. 2、SEQ IDNo. 3、SEQ ID No. 4 和/或SEQ ID No. 5的序列中选择使用PINCH-1-siRNA。
全文摘要
本发明指的是使用提高肿瘤细胞对放射疗法和/或化学疗法敏感性的物质。这是通过使用可以锁定或限制PINCH-1蛋白功能的物质，从而提高肿瘤细胞对放射疗法和/或化学疗法的敏感性而实现的。
文档编号C12N15/113GK101970495SQ200980105841
公开日2011年2月9日 申请日期2009年2月20日 优先权日2008年2月20日
发明者尤里克·科赫, 尼尔斯·科德斯, 维特·桑德福特, 艾丽丝·艾科, 迈克尔·鲍曼 申请人:德累斯顿工业大学