Gaussia荧光素酶作为检测流感基因组复制的报告基因。Gaussia荧光素酶不仅灵敏度 高，而且是分泌型荧光素酶，能够很容易实现对病毒复制情况的实时监测。在Gaussia荧光 素酶表达的同时，杀稻瘟菌素抗性同时表达，只需在培养细胞时加入杀稻瘟菌素即可维持 A549-5PS细胞系所有外源蛋白的表达。
[0018] 本发明建立的稳定共表达甲型流感病毒RNA聚合酶PB2、PBUPA亚基和NP蛋白以 及Gaussia荧光素酶/杀稻瘟菌素抗性报告基因的细胞系，具有实时监测胞内甲型流感病 毒RNA复制表达的特点。为进一步揭示甲型流感病毒在细胞中的转录复制机制，阐明病毒 和宿主间的相互作用以及抗甲型流感病毒药物的研发提供了简便灵敏的方法。
【附图说明】
[0019] 图1为本发明实施例1中构建的表达质粒pWPXLd-puro。
[0020] 图2为本发明实施例1中构建的表达质粒pWPXLd-PB2。
[0021] 图3为本发明实施例1中构建的表达质粒pWPXLd-PBl。
[0022] 图4为本发明实施例1中构建的表达质粒pWPXLd-PA。
[0023] 图5为本发明实施例1中构建的表达质粒pWPXLd-NP。
[0024] 图6为本发明实施例1中构建的表达质粒pWPXLd-Gluc-IRES-blasticidin。
[0025] 图7为本发明A549-5PS细胞系形态。
[0026] 图8为Gaussia荧光素酶/杀稻瘟菌素抗性报告基因工作原理。
[0027] 图9为本发明A549-5PS细胞系中PB2、PBl和NP mRNA表达及Gaussia荧光素酶 /杀稻瘟菌素抗性报告基因负链表达。
[0028] 图10为本发明A549-5PS细胞沉默PBl基因后Gaussia荧光素酶活性变化。
[0029] 图11为本发明A549-5PS细胞沉默Tat-SFl和cyclinTl基因后Gaussia荧光素 酶活性变化。
【具体实施方式】
[0030] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0031] 实施例1表达载体的构建
[0032] 在pWPXLd载体上插入核糖体介入位点和嘌呤霉素抗性基因元件（IRES/puro)，构 建 pWPXLd-puro 载体。以质粒 pHW181-PB2、pHW182-PBl、pHW183-PA 和 pHW185-NP 为模板， 将编码流感PB2、PB I、PA和NP蛋白的基因分别克隆至pWPXLd-puro载体上，构建蛋白表达 质粒 pWPXLd-PB2、pWPXLd-PBl、pWPXLd-PA 和 pWPXLd-NP，质粒图谱如图 1-5 所示。
[0033] 在 pHH21_Gluc 质粒中插入 IRES-blasticidin 序列，构建 pHH21-Gluc-IRES_blasticidin 质粒。以 pHH21-Gluc-IRES_blasticidin 质粒为模板，PCR 扩增Gluc-IRES-blasticidin片段，连接至载体pWPXLd-puro,构建Gaussia突光素酶/杀 稻瘟菌素抗性报告基因的负链RNA产生质粒pWPXLd-Gluc-IRES-blasticidin，质粒图谱如 图6所示。
[0034] 构建的载体均测序正确。
[0035] 实施例2细胞培养
[0036] A549和A549-5PS细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中。293FT细胞培养 于添加2mM谷氨酰胺，0. ImM MEM非必需氨基酸和10%胎牛血清的DMEM培养基中。
[0037] 实施例3慢病毒产生和转导
[0038] 6孔板每孔铺I X 106293FT细胞。铺板24h后共转染慢病毒包装质粒pMD2. Glug、 psPAX21ug和核心质粒pWPXLd-gene2ug，转染6h后换培养液，转染48h后收获慢病毒，完成 慢病毒产生过程。收获的慢病毒用0. 45um无菌滤膜过滤后存于-80°C备用。
[0039] 6孔板每孔铺2 X 105A549细胞，培养液中加入终浓度8ug/mL聚凝胺。铺板24h后 上述病毒液感染A549细胞，每孔ImL病毒液，感染8h后换培养液，即完成慢病毒介导的转 导。
[0040] 实施例4稳定表达甲型流感病毒RNA聚合酶PB2、PB1、PA亚基和NP蛋白以及 Gaussia荧光素酶/杀稻瘟菌素抗性报告基因的细胞系的筛选
[0041] 将实施例1中表达载体均包装成慢病毒，先感染携带Gaussia荧光素酶/杀稻瘟 菌素抗性报告基因的慢病毒，随后细胞同时感染其余四个分别携带PB2、PBl、PA和NP基因 的慢病毒，慢病毒感染后待细胞在6孔板中融合度95%?100%时传代至细胞培养瓶，加入 终浓度l〇ug/mL杀稻瘟菌素筛选。得到多克隆后进行细胞单克隆化，最后选取一株Gaussia 荧光素酶表达量最高的细胞系，定名为A549-5PS细胞系。A549-5PS细胞系形态如图7所 不。Gaussia突光素酶/杀稻癌菌素抗性报告系统在A549_5Ps细胞系中工作原理如图8所 /Jn 〇
[0042] 实施例5RT-PCR检测稳定表达细胞系中病毒基因的mRNA表达水平
[0043] TRIzol提取A549和A549-5PS细胞中的总RNA，使用随机引物通过M-MLV反转录 酶反转录为cDNA，以反转录的cDNA为模板PCR扩增检测。
[0044] PCR扩增使用的引物如表1所示：
[0045] 表IPCR扩增引物
[0046]
【主权项】
1. 一种稳定共表达甲型流感病毒RNA聚合酶PB2、PB1、PA亚基和NP蛋白以及Gaussia 荧光素酶/杀稻瘟菌素抗性报告基因的A549-5PS细胞系，其特征在于，该细胞系保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏日期为2013年9月30日，保 藏编号为 CGMCC No. 8259。
2. -种稳定共表达甲型流感病毒RNA聚合酶PB2、PB1、PA亚基和NP蛋白以及Gaussia 荧光素酶/杀稻瘟菌素抗性报告基因的细胞系的构建方法，其特征在于，其是将编码 Gaussia荧光素酶/杀稻瘟菌素抗性报告基因和流感PB2、PBl、PA以及NP蛋白的基因分 别克隆至出发载体上，包括如下步骤：首先在A549细胞中转导能够同时表达Gaussia荧光 素酶/杀稻瘟菌素抗性报告基因的慢病毒质粒pWPXLd-Gluc-IRES-blasticidin，然后将表 达流感PB2、PBUPA和NP蛋白的质粒共转导上述细胞；然后加入杀稻瘟菌素筛选后得到能 够稳定表达甲型流感病毒RNA聚合酶PB2、PB1、PA亚基和NP蛋白以及Gaussia荧光素酶 /杀稻瘟菌素抗性报告基因的多克隆细胞系；再经过单克隆化筛选，得到能够稳定高表达 Gaussia荧光素酶的A549-5PS细胞系。
3. 根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述编码流感PB2、PBl、PA和NP蛋 白的基因来自甲型流感病毒毒株A/WSN/33。
4. 根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述出发载体为pWPXLd-puro。
5. 权利要求1所述的细胞系在高通量筛选甲型流感病毒转录复制抑制剂中的应用。
6. 权利要求1所述的细胞系在筛选与甲型流感病毒相互作用的宿主因子中的应用。
【专利摘要】本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种稳定共表达甲型流感病毒RNA聚合酶PB2、PB1、PA亚基和NP蛋白以及Gaussia荧光素酶/杀稻瘟菌素抗性报告基因的A549-5Ps细胞系及其构建方法和应用。所述细胞系具有实时监测胞内甲型流感病毒基因组RNA复制表达的特点，为进一步揭示甲型流感病毒在细胞中的转录复制机制，阐明病毒和宿主间的相互作用以及抗甲型流感病毒药物的研发提供了简便灵敏的方法。CGMCC No825920130930
【IPC分类】C12N5-10, C12R1-91, C12N15-63, C12Q1-02
【公开号】CN104560879
【申请号】CN201310502694
【发明人】岑山, 王臻, 张永欣, 高茜, 刘振龙, 李晓宇
【申请人】中国医学科学院医药生物技术研究所
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2013年10月23日