专利名称：Dna疫苗－pcv的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码和表达猪circovirus免疫原(猪CircoVirus的PCV)质粒构建体，猪circovirus免疫原与PMWS综合症(猪全身消瘦综合症或断奶后全身消瘦综合症)有关，也涉及免疫接种的方法和DNA疫苗，还涉及生产和制备这些疫苗的方法。本文引用的所有文件，以及本文引用的文件中引用的所有文件本文一并参考。
PCV最初作为猪肾细胞系PK/15中非细胞病原性污染物检测，这种病毒与鸡贫血症病毒(鸡贫血症病毒CAV)和PBFDV病毒(Pscittacine Beak和羽毛疾病病毒)一起分在Circoviridae中。这些是小的非包膜病毒(15至24nm)，其共同特征是含有一种1.76至2.31千碱基对(kb)的环形单链DNA形式的基因组。开始认为这一基因组编码大约30kDa多肽(Todd等，Arch.Virol.，1991，117129-135)。然而最近的工作显示存在更复杂的转录(Meehan B.M.等，J.Gen.Virol.，1997，78221-227)。此外，在三种已知的circoviruses中，已知在核苷酸序列或共同抗原决定簇中没有明显的同源性。
来源于PK/15细胞的PCV被认为不是致病性的。从B.M.Meehan等J.Gen.Virol.1997(78)221-227已知其序列。仅在最近一些作者认为PCV毒株可能是病原性的，并且与PMWS综合症有关(G.P.S.Nayar等，Can.Vet.J.，1997，38385-387和Clark E.G.，Proc.Am.Assoc.Swine Prac.1997499-501)。Nayar等利用PCR技术在患有PMWS综合症的猪中已检测到PCV DNA。
针对具有PMWS综合症症状的猪中所发现的circoviruse的单克隆和多克隆抗体能够说明这些circoviruses和从PK-15细胞培养物分离的猪circoviruses之间的区别(Allan G.M.等Vet Microbiol.，1999，66115-123)。
在加拿大，美国和法国所发现的PMWS综合症以重量逐渐丧失和以例如呼吸急促、呼吸困难和黄疸表现为临床特征。根据病理观点，它由淋巴细胞或肉芽肿渗入，淋巴结病，少数情况下由肝炎和淋巴细胞或肉芽肿肾炎证明(Clark E.G.，Proc.Am.Assoc.Swine Prac.1997499-501；La Semaine Veterinaire No.26，La Semaine Veterinaire 1996(834)增刊；La Semaine Veterinaire 1997(857)54；G.P.S.Nayer等，Can.Vet.J.，1997，38385-387)。
从北美和欧洲获得的这些circoviruses非常近缘相关，它们的核苷酸序列具有96％的等同程度，而当这些circoviruses的核苷酸序列与从PK-15细胞分离的猪circoviruses比较时，等同性程度不到80％。因此，有人提出了两个病毒子群，PCV-1用于与PMWS综合症相关的circoviruses，PCV-2用于从PMWS细胞分离的circoviruses(Meehan B.M.等，J.Gen.Virol.，1998，792171_2179；WO-A9918214)申请人已发现编码和表达PCV-2免疫原的质粒构建体可以用来针对PMWS综合症免疫猪。
PCV-2免疫原可以与PCV-1免疫原结合使用，也可针对PCV-2免疫这些动物。
根据不太优选的方式，PCV-1免疫原可以单独地使用。
本发明的主体是编码和表达PCV-1或PCV-2免疫原，特别是PCV-1的开放读框(ORFs)1和/或2，PVC-2的ORFs 1和/或2(ORF意思是开放读框)的质粒构建体。
不言而喻，本发明自动覆盖编码和表达等同核苷酸序列的质粒，所说的等同核苷酸序列是这样的序列既非改变所考虑的基因或这一基因编码的多肽的功能性，也非改变它们的毒株特异性(即1型毒株和2型毒株)。当然会包括因密码子简并性产生的不同的序列。
用于实施例的PCV-2序列来源于Meehan等，同上(毒株Imp.1010 ORF1核苷酸398-1342；ORF2核苷酸1381-314；分别符合1998年9月25日的US 09/161,092中的ORF4和ORF13和WO-A-9918214中的COL4和COL13)。其它PCV-2毒株和它们的序列在以下文献中已出版WO-A-9918214(称为Imp1008，Imp999，Imp1011-48285和Imp1011-48121)；A.L.Hamel等J.Virol.June 1998，vol72，65262-5267(GenBankAF027217)；I.Norozov等J.ClinicalMicrob.Sept.1998 vol.36，92535-2541；以及GenEank AF086834，AF086835和AF086836，并且给出等同的ORF序列索取号。
本发明也覆盖了这种意义上的等价序列，它们在高严格条件下能够与所考虑的基因的核苷酸序列杂交。在所说的等价序列中，也可以是所提到的基因的保留完整序列免疫原性的片段。
1型和2型之间全基因组的同源性约75％。对于ORF1，大约86％，对于ORF2，大约66％。相反，基因组之间和2型内ORFs之间的同源性一般高于95％。
根据本发明，以下的序列也是等价的序列，对于ORF1，与毒株Imp1010的ORF1具有等于或大于88％，特别是90％，优选地是92％或95％同源性的那些序列，对于ORF2，与毒株Imp1010的ORF2具有等于或大于80％，特别是85％，优选地是90％或95％同源性的那些序列。
根据Meehan 1998的ORF1和ORF2分别具有编码具37.7kD和27.8kD之预料分子量的蛋白质的潜力。ORF3和ORF4(根据Meehan等1998，分别符合WO-A-9918214中ORF7和ORF10)分别具有编码具11.9和6.5kD之预料分子量的蛋白质的潜力。这些ORFs序列也可以从Genbank AF055392中获得。它们也可以掺入质粒中，并且按照本发明单独或者与例如ORF1和/或ORF2组合使用。
1998年9月25日的US 09/161,092中的其它ORFs1-3和5，6，8-9，11-12(WO-A-9918214中的COLs 1-3和5，6，8-9，11-12)，在这里所描述的条件下，可以组合或相互或与这里定义的ORFs1和2一起使用。
以上叙述也是围绕等价序列的使用，特别是来源于本文所引用的各种PCV-2毒株的那些ORFs。
对于同源性，人们可以精确说明那些等同的序列，其来源于具有ORF2和/或ORF1的PCV毒株，与毒株1010相应ORFs具有本文所限定的同源性。对于根据Meehan的ORF3，也可以说，与毒株Imp1010的ORF3具有等于或大于80％，特别是85％，优选地是90％或95％的同源性。对于根据Meehan 1998的ORF4，与毒株Imp1010的ORF4具有等于或大于86％，特别是90％，优选地是95％的同源性。
从基因组核苷酸序列，在WO-A-99 18214中公开的那些序列，采用标准软件，MacVector确定ORFs是常规技术。同时，与毒株1010基因组的序列对比和与毒株1010 ORFs的比较使得本领域技术人员易于确定另一毒株的基因组ORFs(例如在WO-A-99 18214中所公开的那些)。利用软件或进行序列对比不是过度实验，直接给出等价的ORFs。
术语质粒在这里意欲包括多核苷酸序列形式的任何DNA转录单位，包含待表达的PCV序列和其体内表达必需的元件。环形质粒形式，超卷曲的或其它方式的，是优选的。线性形式也包括在本发明的范围之内。
本发明的主题更具体地说是被称为pJP109(包含PCV-2的ORF2基因，
图1)，pJP111(包含PCV-2的ORF1基因，图2)，pJP120(包含PCV-1的ORF2基因，图3)和pJP121(包含PCV-1的ORF1基因，图4)的质粒。
每一质粒包含在其控制下能够确保所插入的基因在宿主细胞中表达的启动子。一般来说它是一个强大的真核启动子，特别是巨细胞病毒早期启动子CMV-IE，人或鼠源的，也可以是其它来源的，如大鼠或天竺鼠。更一般地，启动子或是病毒来源的或是细胞来源的。作为病毒的启动子而不是CMV-IE，可以提及的是SV40病毒早期或晚期启动子或Rous肉瘤病毒LTR启动子。它也可以是基因所来源的病毒的启动子，例如，对基因特异性的启动子。作为细胞启动子，可以提及的是细胞支架基因启动子，例如结蛋白启动子或肌动蛋白启动子。当几个基因在相同的质粒中存在时，它们可以在相同的转录单位或两个不同的转录单位中提供。
质粒也可以包含其它转录调节元件，例如，内含子型的稳定序列，优选的是兔β-珠蛋白基因的内含子II(van Ooyen等科学，1979，206337-344)，由组织纤溶酶原活化基因编码的蛋白质的信号序列(tPA；Montgomery等，Cell.Nol.Biol.1997，43235-292)，以及多聚腺苷酸化信号(polyA)，特别是牛生长激素(bGH)基因(US-A-5,122,458)的或兔β-珠蛋白基因的。
本发明的主题也是免疫原性制剂和DNA疫苗，它们包含至少一种根据本发明的编码和表达PCV-1或PCV-2免疫原中的一个，优选地是以上提到的ORFs的质粒，以及兽医学上可接受的载体或稀释剂，可以也可以不包含兽医学上可接受的佐剂。
本发明的主题更具体地说是包含至少一种编码和表达PCV-1或PCV-2免疫原的质粒的免疫原性制剂和疫苗，与佐剂配制的组合物，所说的佐剂特别是含有下式的季铵盐的阳离子脂 其中R1是一个具有12至18个碳原子的饱和的或不饱和的线性脂肪族基团，R2是另一个包含2至3个碳原子的脂肪族基团，并且X是羟基或氨基。
优选的是DMRIE(N-(2-羟乙基)-N，N-二甲基-2，3-双(十四烷氧基)-1-丙铵(WO-A-9634109)，最好与中性脂，例如优选的是DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)连接，形成DMRIE-DOPE。优选的，与这一佐剂的质粒混合物就在使用之前制成，最好是在施用于动物之前制成。由此产生的混合物使得可以形成复合物，例如在10至60分钟，特别是30分钟时间内。
当DOPE存在时，DMRTE∶DOPE摩尔比例优选的范围是95∶5到5∶95，更优选的是1∶1。
质粒DMRIE或DMRIE-DOPE佐剂的重量比范围是50∶1到1∶10，优选的是10∶1到1∶5，更优选的是1∶1到1∶2。
根据另一个本发明的有利的方式，可能的是利用作为佐剂的佐剂化合物，其选自丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，顺丁烯二酸酐的共聚物和链烯基衍生物的共聚物。特别是与糖的或多元醇的聚链烯基醚连接的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物是优选的。这些混合物被称作carbomer(Pharmeuropa vol.8，No.2，June 1996)。本领域技术人员也可以参考US-A-2,909,462(本文一并参考)，该文献描述了与聚羟基化的化合物交联的这样的丙烯酸聚合物，所说的化合物具有至少3个羟基，优选地不多于8个羟基，至少3个羟基的氢原子由具有至少2个碳原子的不饱和脂肪族基团取代。优选的的基团是那些包含2至4个碳原子的基团，例如乙烯基，丙烯基和其它烯键不饱和基团。不饱和基团本身可以包含其它取代基，如甲基。以名称Carbopol(GF Goodrich，俄亥俄，美国)出售的产品特别适当。它们与丙烯基蔗糖或者与丙烯基季戊四醇交联，在它们中，可以提到的是Carbopol974P，934P和971P。
在顺丁烯二酸酐的共聚物和链烯基衍生物的共聚物中，EMAs(Monsanto)是优选的，它是顺丁烯二酸酐和乙烯的共聚物，线性或交联的，例如与二乙烯基醚交联的，可以参见J.Fields等，自然，186778-780，4 June 1960(本文一并参考)。从它们的结构的观点看，丙烯酸或甲基丙烯酸和EMAs的聚合物优选地含有下式的基本单位 其中-R1和R2，相同或不同，代表氢或甲基。-X＝0或1，优选的X＝1-Y＝1或2，当X+Y＝2时对于EMAs，X＝0，Y＝2。对carbomers，X＝Y＝1。
这些聚合物在水中的分解形成酸性溶液，其会被中和，优选的是至生理pH，以给出佐剂溶液，实际的疫苗将掺入其中。聚合物的羧基部分以COO-形式。
对于这种类型的佐剂，较好的是制备佐剂，特别是carbomer在蒸馏水中的溶液，优选的是氯化钠存在下，所获得的溶液在酸性pH下。通过添加至所需的数量稀释该储备溶液(由此获得所需的最终浓度)或其溶解有氯化钠的水，优选的是生理盐水(NaCl 9g/l)的实质性部分，具有伴随的或后续中和(pH 7.3至7.4)，优选的是用氢氧化钠中和的一个或多个部分。当其与质粒混合时，就使用这种在生理pH下的溶液，特别是以冷冻干燥，液体或冻结形式贮存。
在最终疫苗组合物中的聚合物浓度将是0.01％至2％w/v，特别是0.06至1％w/v，优选的是0.1至0.6％w/v。
在一特定的实施方案中，免疫原性或疫苗制剂包含一种质粒或编码和表达PCV-20RF1和ORF2的质粒的混合物。
本发明也提供了将针对猪circovirus的免疫接种和针对其它猪病原体的免疫接种联合的方法，所说的病原体特别是可能与PMWS综合症相关的那些。举例来说，可以指出奥耶斯基氏病毒，猪流感病毒，PRRS，猪细小病毒，猪霍乱病毒，大叶性肝炎的线杆菌。
因此，本发明的主题是含有至少一种按照本发明的质粒和至少另一种编码和表达猪免疫原的质粒的质粒混合物，所说的免疫原选自，例如，奥耶斯基氏病毒(假狂犬病毒或PRV)的糖蛋白gB和gD，猪流感病毒H1N1的血细胞凝集素和核蛋白，猪流感病毒H3N2的血细胞凝集素和核蛋白，Lelystad与美国毒株的PRRS病毒的ORF5和ORF3基因，猪细小病毒的VP2蛋白质，猪霍乱病毒(HCV)的E1和E2蛋白质，从大叶性肝炎的线杆菌缺失的apxI，apxII以及apxIII基因(参见例如WO-A-9803658的质粒)。
这些质粒混合物夹带在兽医学上可接受载体或稀释剂，可有可无的前面描述的兽医学上可接受的佐剂中，由此形成免疫原性制剂或多价DNA疫苗。这些免疫原性制剂或多价DNA疫苗用以上描述的阳离子脂(特别是DMRIE，最好是与中性脂，DOPE连接，形成DMRIE-DOPE)配制可以特别有利。
所配制的或者用以上描述的佐剂配制的根据本发明的制剂或单价或多价DNA疫苗用细胞因子(优选的是猪来源的，特别是猪GM-CSF)补充也可以是有利的。这种猪GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子；Clark S.C.等科学1987，2301229；Grant S.TA.等药物，1992，53516)的添加可以通过掺入到制剂中或者掺入到疫苗中实现，可以是猪GN-CSF蛋白质，也可以是编码和表达猪GN-CSF基因的质粒(Inumaru S.和TakamatsuH.免疫细胞生物学，1995，73474-476)。
尤其是，编码和表达猪GM-CSF的质粒可以是质粒pJP058(图5)。
根据本发明的免疫原性制剂和多价或多价DNA疫苗也可以与针对至少一种不同的或相同的猪病原体的至少一种常规的疫苗(减毒的活疫苗，灭活的疫苗或亚单位疫苗)或重组疫苗(病毒载体)组合使用。本发明特别提供了与含佐剂的常规疫苗(减毒的活疫苗，灭活的疫苗或亚单位疫苗)组合的方法。对于灭活的疫苗或亚单位疫苗，可以提到特别包含单独的氧化铝凝胶或与作为佐剂的皂角甙混合的那些，或者以水包油乳剂形式配制的那些。
本发明的主题也是免疫方法，其使得可能在猪中针对按照本发明的circoviruses诱导免疫反应。其主题具体地说是在猪中有效的免疫接种的方法。这些免疫和免疫接种的方法包括施用以上描述的制剂的一种或者单价或多价DNA疫苗的一种。这些免疫和免疫接种的方法包括施用一个或多个这些制剂或DNA疫苗的后续剂量。在这种免疫或免疫接种方法的上下文中，可以通过现有技术中提出的用于多核苷酸免疫接种的各种施用路线施用所说的制剂和DNA疫苗。特别是肌内和真皮内路线，并且借助已知的施用技术，特别是施用有针的注射器进行液体推注式的注射(Furth等，分析生物化学，1992，205365-368)或者通过涂布有一层DNA的金微粒投射注射(Tang等，自然，1992，356152-154)。
这种方法不仅使得可以施用到成年猪，而且也可以施用到幼年和怀孕猪；在后一种情况下，其使得可以将被动免疫赋予新生猪(母性的抗体)。优选的，雌性猪在饲养前和/或出栏前和/或在妊娠期间接种。有利地，在出栏之前至少接种一次，在妊娠期间(例如在妊娠中期，在妊娠的约6-8周)和/或在妊娠的最后(妊娠的约11-13周)完成后续接种是优选的。这样，一种有利的用药办法是在出栏之前接种，妊娠期间加强接种。此后，在每一次出栏前和/或在约妊娠中期和/或在妊娠的最后再接种。优选的，在妊娠期间再接种。
小猪(piglet)，例如免疫接种过的雌性猪(如按照本文的讨论接种的)来源的小猪在出生后的头几周接种，例如，在出生后的第一和/或第二和/或第三和/或第四和/或第五周。优选的，小猪在出生后的第一周或出生后的第三周内接种(例如，在断奶时)。有利地，这样的接种在两到四周进行加强。
用于根据本发明的疫苗的DNA的数量在约10μg和约2000μg之间，优选的约50μg和大约1000μg之间。本领域技术人员有能力精确限定用于每一免疫或免疫接种方案的DNA的有效剂量。
剂量体积可以在0.5和5ml之间，优选的在2和3ml之间。
免疫和免疫接种的优选方法包括通过肌内路线施用根据本发明的DNA疫苗。
现在将参照附图，借助非限制性例证性实施方案详细的描述本发明。
对克隆ORFs有用的PCV-2毒株是例证性毒株，保藏在ECACC，具有以下保藏号V97100219(Imp1008)，V97100218(Imp1010)和V97100217(Imp 999)(其于1997年10月2日保藏)，V98011608(Imp1011-48285)和V98011609(Imp1011-48121)(其于1998年1月16日保藏)。
这些实施例采用毒株Imp1010构建。本领域技术人员可以将该过程用于其它PCV-2毒株。
用由自连接的EcoRI-EcoRI片段组成的的模板，以使用下列寡核苷酸的聚合酶链反应(PCR)技术扩增PCV-2病毒株1010-Stoon的ORF2基因(B.Meehan等J.Gen.Virol.1998.79.2171-2179；GenBank序列登记号AF055392)Jp779(SEQ ID NO 1)(35聚体)5’CATCATCATGTCGACATGACGTATCCAAGGAGGCG3’JP780(SEQ ID NO 2)(36聚体)5’TACTACTACAGATCTTTAGGGTTTAAGTGGGGGGTC3’以产生730bp PCR片段。将该片段以SalI与BglII消化，以便在琼脂糖凝胶电泳后，分离715bp SalI-BglII限制片段。将该片段事先用SalI和BglII消化，然后与质粒pVR1012(Hartikka J.等，人类基因治疗，1996.7.1205-1217)连接，给出质粒pJ 109(5567pb)(图1)。
用由自连接的PstI-PstI片段组成的的模板，以使用下列寡核苷酸的聚合酶链反应(PCR)技术扩增PCV-1病毒株PK-15(B.Meehan等J.Gen.Virol.1997，78，221-227；GenBank序列登记号U49186)JF785(SEQ ID NO 7)(35聚体)5’CATCATCATGTCGACATGCCAAGCAAGAAAAGCGG3’JP786(SEQ ID NO 8)(36聚体)5’TACTACTACAGATCTTCAGTAATTTATTTTATATGG3’以产生包含PCV-1病毒(毒株PK-15)的ORF1基因的965bp PCR片段。将该片段以SalI与BglII消化，以便在琼脂糖凝胶电泳后，分离946bpSalI-BglII限制片段。然后将该片段与质粒pVR1012(实施例1)连接，给出质粒pJP121(5804bp)(图4)
采用对PCV-2病毒特异性的多克隆血清观察到相同的表达结果。在这种情况下，荧光标记的抗-猪IgG缀合物用于检测特定荧光。采用以质粒pVR1012单独转染的CHO细胞或未转染的CHO细胞中的这种多克隆血清检测不到任何荧光。
小猪用单独的质粒pJP109或质粒pJP109与pJP111的混合物或质粒pJP109与pJP058的混合物或质粒pJP109，pJP111和pJP058的混合物接种。
疫苗溶液含有每一质粒500μg。
体积疫苗溶液经肌内路线以2ml总体积注射疫苗溶液。在实施中，给定接种小猪的年龄(1-2天)，在颈两侧的每一边给予1毫升的一次注射(＝2×1ml)。
两次疫苗注射在两周间隔进行，这就是说在方案的D2天和D14天进行。
在方案的D21天用口鼻施用毒性PCV-2毒株病毒悬液进行激发。然后监测小猪三周，观察小猪断奶后全身消瘦综合症的特定临床征候的出现。观测的的症候是直肠温度头14天每日测量，然后，在激发后的第三周测量两次。重量就在激发之前称量小猪，在激发后的3周期间每周称量一次。试验病毒血症和抗体之血样的收集在D2，D14，D21，D28，D35和D42天采集血样。尸体解剖在D42天，温和地处死存活的小猪，进行尸体解剖，以研究病理解剖学损伤，并从肝脏，淋巴结，脾，肾以及胸腺进行组织学制备，以研究在这些组织中的损伤。8.2.5-7周大猪崽不再具有对PCV-2病毒特异性的母性抗体的5-7周大猪崽经肌内路线接种单独质粒pJP109，或者质粒pJP109与pJP111的混合物，或者质粒pJP109与pJP058的混合物或者质粒pJP109，pJP111和pJP058的混合物。
接种剂量与实施例8.1中所指出的那些相同(每个质粒500μg)。以2ml体积经肌内路线注射疫苗溶液(一次施用2ml到颈肌肉)。
两次免疫接种间隔21天。通过肌内施用毒性PCV-2毒株的病毒悬液，在最后一次接种后的14天(D35)进行激发。
监测小猪八周，观察小猪断奶后全身消瘦综合症的特定临床征候的出现。激发后小猪的临床监测与实施例8.1中描述的相同，只是总的观察期是8周这一时间。
通过用0.9％NaCl中的1mg/ml DNA溶液等份稀释0.75mM DMRIE-DOPE溶液达到形成质粒DNA-阳离子脂复合物。借助装有26G针的注射器，沿着包含阳离子脂溶液的药瓶的壁，慢慢引入DNA溶液，避免形成泡沫。两种溶液混合，迅速轻轻振荡。最终获得包含0.375mM DMRIE-DOPE和500μg/ml DNA的组合物。
对在以上描述的所有操作，在室温下使用溶液是合乎需要的。在免疫猪之前30分钟，在室温下形成DNA/DMRIE-DOPE复合物。
然后根据实施例8.1和8.2中描述的条件接种猪。
在log10转化之后，所给出的数据相应于组织匀浆中的病毒滴度。PCV-2滴度组支气管LN 肠系膜LN平均值 Std 平均值 StdNpJP109 0.90.8 0.9 0.84pJP109+ 0.70.6 0.2 0.23pJP111对照2.01.1 1.8 1.14支气管淋巴结似乎包含最大感染性的病毒。在以pJP109或pJP109+pJP111质粒混合物免疫的小猪的支气管和肠系膜淋巴结中，观察到病毒载量的降低。对质粒混合物，这种降低是明显的(P≤0.05)。●病毒的排泄经基于PCV-2 ORF2扩增的PCR就PCV-2评估后激发粪便擦棒。每一次试验用2毫升样品的三次重复完成。未接种的对照激发前为PCV-2阴性，激发后为阳性，证实PCR试验的有效性。
测定值以log10(2μl样品中PCV-2 DNA的分子数量)表示。
log10PCV-2 DNA分子数量组 平均值 std NpJP109 3.3 0.3 4pJP109+pJP111 2.9 0.7 3对照 3.6 0.6 4组之间的差异不明显。第2实验14天龄的常规小猪在第0天和第20天两次用由DMRIE DOPE配制的pJP109和pJP111质粒混合物免疫。对每一次施用，经肌内路线在耳后颈侧面注射2毫升。疫苗组合物是每毫升生理溶液(0,9％ NaCl)250μg各种质粒和0.375mM DMRIE DOPE。
对对照组小猪注射生理溶液。
第32天，小猪经口鼻路线激发，在每个鼻孔中用注射器引入5毫升每毫升滴度105.8TCID50的PCV-2病毒悬液。
监测小猪的临床症状，虚脱，呕吐，气促，咳嗽，厌食以及过热(在激发后28天期间内每天记录直肠温度)，减慢生长(在第32，40，46，53，60天称量小猪)。按照下列标准记录症状附录1(每一小猪的得分等于相应于不同观察天数得分的总和)。
第60天，进行尸体剖检，按照下列标准进行损伤计分附录2(每一小猪的得分等于相应于各观察器官得分的总和)。
收集组织样品，特别是淋巴结。
在病毒排泄后第32，39，42，46，49，53，56，60天，收集直肠擦棒。●临床症状与对照比较，在免疫小猪组中观察到临床症状的明显减弱。在对照组中，一头小猪死于PMWS，而在接种组中没有。
临床得分组 平均值 std N接种组 13.57.1 8对照组 29.315.6 8(P＜0.01 Kruskal-Wallis检验)在免疫小猪组观察到后激发过热延续时间明显缩短(P＜0.05)。
直肠温度≥40℃的天数组 平均值 std N接种组 1.9 2.0 8对照组 8.4 3.9 8在接种组和对照组之间，激发后每日重量增长没有明显区别。●尸体剖检损伤与对照组比较，在免疫小猪中观察到损伤明显降低，特别是淋巴结病(P≤0.05)。
综合损伤和淋巴结病得分组平均值 stdN综合损伤接种组7.6 3.38对照组13.1 7.58淋巴结得分接种组3.1 2.78对照组5.7 2.98●淋巴结组织中病毒载量通过免疫化学确定肠系膜和纵隔淋巴结中的病毒载量。
下列标准用于计分-0＝缺乏荧光-1＝在某些器官切片上有一些荧光点-2＝每次拍摄一个荧光点-3＝全部荧光器官在免疫组中观察到病毒载量的明显降低(P≤0.05)。
病毒载量组 肠系膜LN 纵隔LNN平均值 std 平均值 std -接种组 0.5 0.6 1.3 0.2 8对照组 1.8 0.8 2.0 0.8 8●病毒排泄经PCR估测粪便擦棒的PCV-2排泄。按照下列标准计量结果0＝没有PCV-21＝存在PCV-2在免疫小组中，38％的小猪在粪便中排泄PCV-2，对照组中为88％排泄。与对照组比较，在接种组中病毒排泄的期限明显缩短。
病毒排泄平均期限(天)组平均值std N接种组1.2 2.1 8对照 11.4 6.3 8应该清楚，由权利要求书限定的本发明不受以上说明书所提出的特定实施方案的限制，并且包括不偏离本发明范围和精神的各种变化的情况。
附录1临床症候得分症候 得分虚脱 0无，1有，2不能确定呕吐 0无，1有呼吸困难 0无，1中度，2重度咳嗽 0无，1有厌食 0无，1有过热 0无，1≥40℃，2≥41℃生长 0无，1周DWGx≤周DWGx-1并且＞100克/天2周DWG≤100克/天死亡 0无，x死亡前一天的得分对一天而言，得分是每次症候得分的总和附录2目视损伤得分皮肤 正常 0(颜色) 白色 1黄色 2肥胖 正常 0瘦 1非常瘦 2恶病质性 3粘液 正常 0白色 1黄色 2sub.cut.conjonctif 正常 0发亮 1黄色 2神经节(gg) 正常 0I大的和或充血 1＞I大的和或充血2＞I非常大 3胸液 正常 0发亮 1可见 2心脏 正常 0损伤 1肺 正常 0损伤≤41损伤＞4≤6 2损伤＞63胸膜 正常 0损伤 1腹水 正常0发亮1可见2腹膜 正常0可见1胃正常0损伤1溃疡2小肠 正常0损伤1大肠 正常0损伤1派伊尔氏淋巴集结 正常0在小肠的1部分可见 1在小肠的2部分可见 2非常明显3肝正常0损伤1肾正常0损伤1膀胱 正常0损伤1
序列表<110>MERIAL<120>DNA疫苗-PCV<130>DNA疫苗PCV<140>numéro brevet<141>date dépót brevet<160>10<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>35<212>ADN<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>1catcatcatg tcgacatgac gtatccaagg aggcg 35<210>2<211>36<212>ADN<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>2tactactaca gatctttagg gtttaagtgg ggggtc36<210>3<211>35<212>ADN<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>3catcatcatg tcgacatgcc cagcaagaag aatgg 35<210>4<211>36<212>ADN<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>4tactactaca gatcttcagt aatttatttc atatgg36<210>5<211>35<212>ADN<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>5catcatcatg tcgacatgac gtggccaagg aggcg 35<210>6<211>40<212>ADN<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>6tactactaca gatctttatt tatttagagg gtcttttagg40<210>7<211>35<212>ADN<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>7catcatcatg tcgacatgcc aagcaagaaa agcgg 35<210>8<211>36<212>ADN<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>8tactactaca gatcttcagt aatttatttt atatgg36<210>9<211>33<212>ADN<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>9tatgcggccg ccaccatgtg gctgcagaac ctg 33<210>10<211>34<212>ADN<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>10tatgcggccg ctacgtatca cttctgggct ggtt 3权利要求
1.一种免疫原性制剂或疫苗，它们一方面包含编码和表达选自PCV-2的ORF1、PCV-2的ORF2、PCV-1的ORF1以及PCV-1的ORF2的基因的质粒，另一方面包含能够增强针对所说基因表达产物之免疫反应的元件。
2.根据权利要求1的免疫原性制剂或疫苗，其特征在于能够增强免疫反应的元件包括作为佐剂的下式的阳离子脂 其中R1是一个具有12至18个碳原子的饱和的或不饱和的线性脂肪族基团，R2是另一个包含2至3个碳原子的脂肪族基团，并且X是羟基或氨基。
3.根据权利要求2的免疫原性制剂或疫苗，其特征在于阳离子脂是DMRIE。
4.根据权利要求3的免疫原性制剂或疫苗，其特征在于DMRIE连接到一中性脂上。
5.根据权利要求4的免疫原性制剂或疫苗，其特征在于DMRIE连接到DOPE上。
6.根据权利要求1的免疫原性制剂或疫苗，其特征在于能够增强免疫反应的元件包括作为佐剂的carbomer。
7.根据权利要求1的免疫原性制剂或疫苗，其特征在于能够增强免疫反应的元件包括猪细胞因子。
8.根据权利要求7的免疫原性制剂或疫苗，其特征在于其中所说的猪细胞因子是GM-CSF。
9.根据权利要求7或8的免疫原性制剂或疫苗，其特征在于其包含编码和表达猪细胞因子的质粒。
10.根据权利要求1的免疫原性制剂或疫苗，其特征在于能够增强免疫反应的元件包括作为佐剂的猪细胞因子和选自由DMRIE，DMRIE/DOPE和carbomer组成的组的化合物。
11.根据权利要求1到10之任一的免疫原性制剂或疫苗，其特征在于其包含编码和表达另一个猪免疫原的质粒。
全文摘要
本发明涉及免疫原性制剂或疫苗,它们一方面包含编码和表达来源于PCV的基因(特别是选自PCV－2的ORF1、PCV－2的ORF2、PCV－1的ORF1以及PCV－1的ORF2)的质粒,另一方面包含能够增强针对所说基因表达产物之免疫反应的元件,其可以是carbomer,猪细胞因子(如GM－CSF)或式(1)的阳离子脂:其中R
文档编号A61K48/00GK1376200SQ00809668
公开日2002年10月23日 申请日期2000年6月8日 优先权日1999年6月10日
发明者J－C·F·奥顿内特, M·巴布洛特, J·M·佩里兹, C·E·查雷尔 申请人:梅瑞尔公司