本发明涉及药物用途的
技术领域：
，具体地说，本发明涉及一种阿魏菇多糖在疫苗佐剂中的应用。
背景技术：
：由于流浪犬生育无法控制，致使许多大城市流浪犬数量激增，伤人、咬死家畜和传播疾病时有发生，过去控制流浪犬数量多是采用诱杀、棒打等不为人道的方法，这种捕杀方法方式较为残忍，极容易引起爱狗人士的不满以及社会舆论的压力。采用犬zp3(caninezonapellucida3，czp3)为靶抗原，研制犬zp3dna疫苗pcdna3-czp3，不仅具有一定的抗生育效果，也具有广泛的应用前景。但该疫苗存在抗原性不高，在使用过程中出现了免疫效果不佳，且疫苗抗原用量较高，不能达到对流浪犬的数量进行有效控制的目的。佐剂是指加入疫苗制剂后能促进、增强或延长机体对抗原特异性免疫应答的物质。佐剂也是一种抗原辅助剂,与疫苗共同使用可以明显提高疫苗的免疫效果。佐剂被用来增强疫苗免疫作用已有80多年的历史。免疫佐剂可辅佐免疫原刺激机体产生较早、较强、持久的免疫应答,现有的免疫佐剂存在免疫增强效果不理想，免疫力不持久等问题。阿魏菇，学名阿魏侧耳，是一类食药两用珍稀真菌，因专性寄生或腐生于药用植物阿魏的根茎上而得名。阿魏菇的子实体含有丰富的多糖、蛋白质、碳水化合物、多种维生素及矿物质等活性成分，具有较高的营养和药用价值。多糖是一类特殊的生物活性物质，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、增强免疫力、抗辐射、降血脂等多种活性，被称为生物反应调节剂，是继核酸、蛋白质之后的另一种有待深入研究色生物大分子。阿魏菇多糖(pleurotusferulaepolysaccharide,pflp)是阿魏菇中的一种重要有效成分，能够增强t细胞功能，促进抗体形成，诱导干扰素产生，从而使机体的免疫系统得到激活。王金辉、黄健等人对阿魏菇多糖免疫活性进行研究，发现阿魏菇多糖能显著提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力，并且呈现明显的剂量依赖性。此外，之前的研究表明纯化的阿魏菇多糖可以有效的激活树突状细胞疫苗，但利用阿魏菇多糖作为佐剂联合犬透明带3dna免疫不育疫苗佐剂影响疫苗的免疫效果未见有报道。技术实现要素：为解决现有的犬透明带3dna疫苗存在的抗原性不高，在使用过程中免疫效果不佳，且疫苗抗原用量较高，不能达到对流浪犬的数量进行有效控制的目的的问题，本发明提供阿魏菇多糖在制备犬透明带3dna疫苗佐剂中的应用，能有效提高疫苗免疫效果，降低疫苗抗原用量。本发明通过以下技术方案实现的:阿魏菇多糖在制备犬透明带3dna疫苗佐剂中的应用。优选的，本发明中的阿魏菇多糖由新鲜阿魏菇或阿魏菇冻干粉中提取获得。优选的，本发明中的阿魏菇多糖的纯度为96％。优选的，本发明应用中的阿魏菇多糖与犬卵透明带3dna疫苗的质量比为1:1～10:1。更优选的，本发明应用中的阿魏菇多糖与犬卵透明带3dna疫苗的质量比为2:1。进一步，阿魏菇多糖在制备犬透明带3dna疫苗佐剂中的应用，接种步骤为先注射阿魏菇多糖，后注射pcdna3-czp3dna疫苗。阿魏菇多糖在制备犬透明带3dna疫苗佐剂中的应用，接种步骤为pcdna3-czp3dna疫苗和阿魏菇多糖同时注射。阿魏菇多糖在制备犬透明带3dna疫苗佐剂中的应用，免疫动物为犬类、小鼠、大鼠中的任意一种。通过实施本发明的技术方案，可以达到以下有益效果:(1)用阿魏菇多糖作为犬透明带3dna疫苗佐剂，在用大鼠进行效果验证实验时，igg抗体水平相比于单用pcdna3-czp3组明显升高，总产仔数相比于单用pcdna3-czp3组的41只阿魏菇多糖配伍之后下降至最低13只，展现出了良好的有效性，能够更好的提高抗原的免疫原性，增强免疫效果。(2)用阿魏菇多糖制备的佐剂与犬透明带3dna疫苗配合使用，不仅佐剂效果明显，而且佐剂易获得，质量容易控制。具体实施方式下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。本发明中选用的所有材料、试剂和仪器都为本领域熟知的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。实施例一：阿魏菇多糖在制备犬透明带3dna疫苗佐剂中的应用，其中，阿魏菇多糖与犬卵透明带3dna疫苗的质量比为10:1。实施例二：阿魏菇多糖在制备犬透明带3dna疫苗佐剂中的应用，其中，阿魏菇多糖与犬卵透明带3dna疫苗的质量比为1:1。实施例三：阿魏菇多糖在制备犬透明带3dna疫苗佐剂中的应用，其中，阿魏菇多糖与犬卵透明带3dna疫苗的质量比为2:1。实施例四：阿魏菇多糖在制备犬透明带3dna疫苗佐剂中的应用，其中，阿魏菇多糖与犬卵透明带3dna疫苗的质量比为5:1。实施例五：阿魏菇多糖在制备犬透明带3dna疫苗佐剂中的应用，其中，阿魏菇多糖与犬卵透明带3dna疫苗的质量比为7:1。实施例六：阿魏菇多糖在制备犬透明带3dna疫苗佐剂中的应用，其中，阿魏菇多糖与犬卵透明带3dna疫苗的质量比为9:1。实施例七：阿魏菇多糖在制备犬透明带3dna疫苗佐剂中的应用，其中，阿魏菇多糖与犬卵透明带3dna疫苗的质量比为3:1。实施例八：阿魏菇多糖在制备犬透明带3dna疫苗佐剂中的应用，其中，阿魏菇多糖与犬卵透明带3dna疫苗的质量比为8:1。实施例九：阿魏菇多糖在制备犬透明带3dna疫苗佐剂中的应用，其中，阿魏菇多糖与犬卵透明带3dna疫苗的质量比为6:1。实施例十：阿魏菇多糖在制备犬透明带3dna疫苗佐剂中的应用，其中，阿魏菇多糖与犬卵透明带3dna疫苗的质量比为4:1。实施例十一：阿魏菇多糖在制备犬透明带3dna疫苗佐剂中的应用，其中，接种步骤为先注射阿魏菇多糖，后注射pcdna3-czp3dna疫苗。实施例十二：阿魏菇多糖在制备犬透明带3dna疫苗佐剂中的应用，其中，接种步骤为先注射pcdna3-czp3dna疫苗，后注射阿魏菇多糖。实施例十三：阿魏菇多糖在制备犬透明带3dna疫苗佐剂中的应用，其中，接种步骤为pcdna3-czp3dna疫苗和阿魏菇多糖同时注射。实施例十四：将上述实施例一至十提供的十个不同方案分别按照实施例十三提供的注射步骤进行系列效果验证试验，随机抽取样本实验结果如下所示：1、取40只6～8周龄雌性balb/c小鼠随机分为4组，每组小鼠10只。具体划分为:1注射生理盐水对照组；2注射质粒pcdna3-czp3组(100μg/鼠)；31:1注射组：注射pcdna3-czp3(100μg/鼠)+阿魏菇多糖(100μg/鼠)，；42:1注射组：注射pcdna3-czp3(100μg/鼠)+阿魏菇多糖(200μg/鼠)然后对小鼠后肢肌内进行注射；在小鼠初次免疫后14d进行第2次加强免疫、第2次免疫后14d进行第3次加强免疫，在初次免疫14d、二免后14d和三免14d后，分别在小鼠眼后眶采血，测定免疫小鼠血清igg的抗体水平。结果如表1所示：表1：小鼠血清中igg抗体的间接elisa检测的od值注：*p＜0.05，***p＜0.001，均与pcdna3-czp3实验组相比由表1可知，较pcdna3-czp3组相比阿魏菇多糖组小鼠血清igg的抗体水平显著升高，从第2次免疫开始就有极显著差异(p＜0.001)，pcdna3-czp3+pfp(200μg)组igg升高水平更为显著。2、取免疫小鼠的脾细胞悬液测定cd4+、cd8+、cd4+和cd8+细胞的比值，结果如表2所示：表2：对免疫小鼠脾中cd4+和cd8+细胞亚群的影响组别cd4+(％)cd8+(％)cd4+/cd8+0.9％nacl27.37±1.5711.13±0.282.45±0.08pcdna3-czp332.37±0.9611.47±0.502.83±0.08pcdna3-czp3+pfp(100μg)39.30±1.40*16.23±0.69**2.42±0.05**pcdna3-czp3+pfp(200μg)45.87±0.90***19.42±0.24***2.19±0.03***注：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，均与pcdna3-czp3实验组相比由表2可知，阿魏菇多糖组能同时提高小鼠脾cd4+t淋巴细胞和cd8+t淋巴细胞的百分比，同时降低cd4+/cd8+的比值，pcdna3-czp3+pfp(200μg)组的变化更为显著，可见加入阿魏菇多糖作为佐剂有利于cd4+t淋巴细胞和cd8+t淋巴细胞向ctl细胞的分化。3、三次免疫后的14d，将具有正常生育能力的balb/c雄鼠按照1：3的比例与免疫过的雌鼠进行合笼，每天轮换雄鼠。21d后将雄鼠取出，观察统计雌鼠的窝仔数，计算抗生育率，结果如表3所示：表3：小鼠抗生育免疫实验结果由表3可知，免疫阿魏菇多糖组相比于pcdna3-czp3疫苗单独免疫组免疫小鼠的不育率明显增加，总产仔数相比于pcdna3-czp3组的41只阿魏菇多糖配伍之后下降到17只，pcdna3-czp3+pflp(200μg)组低至13只。此外，用斯皮尔曼相关系数分析小鼠抗体水平和产仔数之间的关系，结果表明无论是单独免疫pcdna3-czp3组、阿魏菇多糖佐剂组小鼠抗体水平和产仔数均呈负相关。继续用犬类和大鼠以上述步骤进行实验，得出相同的实验结论：用阿魏菇多糖作为犬透明带3dna疫苗佐剂，igg抗体水平相比于单用pcdna3-czp3组升高明显，不育率显著升高。实施例十五：按照实施例十四所述的试验方法进行多次重复试验，采用阿魏菇多糖的纯度为96％，将小鼠按注射阿魏菇多糖与犬卵透明带3dna疫苗的不同质量比分为1：1组、2:1组、3:1组、4:1组、5:1组、6:1组、7:1组、8:1组、9:1组和10:1组，不同组别的不育率如表4所示：表4：不同阿魏菇多糖与犬卵透明带3dna疫苗的质量比小鼠不育率组别1:1组2:1组3:1组4:1组5:1组6:1组7:1组8:1组9:1组10:1组不育率(％)41.6156.2950.5848.4345.3246.7349.6539.4741.2230.57由表4可知，在阿魏菇多糖与犬卵透明带3dna疫苗的质量比为1:1至10:1之间，小鼠的不育率与质量比不呈正相关关系，在2:1时不育率最高，免疫效果最佳。综上所述通过实施本发明的技术方案，本发明提供的用阿魏菇多糖作为犬透明带3dna疫苗佐剂，用阿魏菇多糖作为犬透明带3dna疫苗佐剂，在进行效果验证实验时，igg抗体水平相比于单用pcdna3-czp3组升高明显，总产仔数相比于单用pcdna3-czp3组的41只阿魏菇多糖配伍之后下降至最低13只，展现出了良好的有效性，能够更好的提高抗原的免疫原性，增强免疫效果；用阿魏菇多糖制备的佐剂与犬透明带3dna疫苗配合使用，不仅佐剂效果明显，而且佐剂易获得，质量容易控制。如上所述，即可较好地实现本发明,上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。当前第1页12