流脑多糖结合疫苗可溶性微针贴片及其制备方法与流程

本发明涉及透皮给药技术领域，特别是涉及一种流脑多糖结合疫苗可溶性微针贴片及其制备方法。

背景技术：

接种疫苗已经成为预防和治疗大规模传染性疾病、超敏反应性疾病和自身免疫性疾病等的最有效和最主要的手段。多糖结合疫苗为目前比较前沿的组分疫苗类，是疫苗研究热点。流脑即流行性脑脊髓膜炎(meningococcalmeningitis)，是由脑膜炎双球菌(脑膜炎奈瑟菌，neisseriameningitides(nm)bacteria.)引起的化脓性脑膜炎，是世界范围的一个严重公共健康问题，可造成流行性的脑膜炎疾病,具有高致死率和致残率，分布广全世界每年流脑病例可达30万到35万，病原体的发现至今已超过100年。根据不同的地理分布和流行潜力不同，2015年世界卫生组织流行病学调查结果表明，以从塞内加尔到埃塞俄比亚的撒哈拉沙漠以南地区为主要流行区，被称为“脑膜炎地带”。我国由于长期受经济和技术因素的限制，20世纪60年代，均有试图研究无毒活疫苗，但未获成功。1972年开始研制提纯疫苗，但纯度差未广泛使用。同年，开始研究a群流脑多糖疫苗。直到1979年，按照1976年who要求的疫苗标准，中国才能生产符合应用的流脑疫苗。2001年a+c群流脑多糖结合疫苗获得生产批准。对两岁以下婴幼儿，由于流脑多糖疫苗在机体内仅能诱导短期的t细胞非依赖性免疫反应，所以其所发生的保护效果差。而结合了蛋白的疫苗可以提高婴幼儿的保护作用。为了多糖抗原结合到某种蛋白载体上，从而扩大了适用人群，增强了免疫学效果，并且通过多糖与蛋白质载体的结合，完全改变了多糖抗原的免疫学特性，使多糖刺激产生的抗体由igm为主向igg为主转变，而且产生的抗体亲和力更高，滴度更好，持续时间也更长。

通过皮肤免疫的方式又是免疫学者研究的一个重要阵地，也是近年来疫苗工作者一直在寻找的更好免疫途径和最佳免疫器官。而经皮免疫(transcutaneousimmunization，tci)是在原有基础上发展起来的一种新型免疫接种方式，主要是通过免疫源性抗原和佐剂组合起来通过皮肤输入表皮免疫靶点诱导产生全身免疫反应的新方法。皮肤具有独特的免疫功能且与全身免疫系统密切相关。bos于1986年提出了皮肤免疫系统(sis)，包括角朊细胞、郎格罕细胞、组织细胞(树枝状细胞和巨噬细胞)、t细胞、粒细胞、肥大细胞、内皮细胞等细胞部分和抗微生物肽类、纤维蛋白溶酶、花生四烯酸、补体、免疫球蛋白、细胞因子等体液部分。皮肤能参与机体特异性免疫的抗原识别、免疫细胞的激活及皮肤免疫应答的全过程。

皮肤作为人体最大的免疫器官，表皮层存大量在与免疫反应相关的抗原提呈细胞，是人体天然的屏障，当有外源性物质进入时，会激发体内免疫应答，是人体最关键的免疫途径之一。最外层的角质层厚度为10-15μm，由致密的角质细胞组成，是阻碍药物输送皮内产生免疫反应的最大屏障；从外向内依次有表皮层，厚度为50-100μm，含有免疫活性细胞和少量的神经组织，没有血管。表皮层以下是真皮层，是皮肤的主要组成部分，含有大量的免疫活性细胞、神经组织和血管组织，主要是人体受到外界刺激产生痛觉的地方。而能产生免疫反应的功能细胞主要分布在表皮层和真皮层，尤其是树突状细胞(dcs)是体内功能最强的专职抗原提呈细胞，在经皮在免疫系统对抗原的捕获、处理及提呈过程中居于中心地位。在其它表皮层和真皮层还有大量树突状细胞未成熟亚型郎格汉氏细胞(lcs)和皮肤内树突状细胞(ddcs)，都能有效的摄取、处理和提呈外来抗原，参与机体的细胞和体液免疫应答。其中lcs覆盖了人类皮肤表皮总表面积的约25％，密度约为500-1000细胞/mm2，占表皮细胞的3％-5％。同时，10个捕获抗原的dcs即足以产生细胞毒性t淋巴细胞反应，500-1000个dcs就可导致广泛的免疫反应。因此皮肤也被认为是疫苗接种的最佳部位之一。

经皮免疫新技术作为一种确证有效且有药物传输领域新兴代表的免疫新方法，已成为国际新型疫苗递送系统研究的热点之一。在进行经皮免疫时，疫苗既可以通过体液循环直接进入外周淋巴结，被外周淋巴结中的dcs细胞识别并呈递，也可以直接被皮肤中的dcs细胞处理后直接呈递到外周淋巴结中的免疫细胞，两种不同的途径也会诱导不同的免疫反应。经皮免疫给药其具备的主要的优点有以下几个方面(1)安全性高：能显著降低给药过程中因给药器械所引起的感染几率以及血源性疾病的传播。(2)顺应性良好：微针经皮免疫疼痛感低，不良反应少，尤其适用于儿童经皮免疫。(3)方便性：可自行操作，无需专业人员；(4)接种效率高：单位时间内接种人数多，尤适于较大规模的群体免疫接种；(5)免疫应答高效性：其它条件相同的情况下，较少剂量的抗原可达到大剂量注射免疫的效果，降低使用剂量和投入成本；(6)不经过胃肠道吸收，减少药物不良反应，完全避免药物的首过效应，达到局部或系统的药物控制释放的目的。因此经皮免疫作为一种免疫接种方式，有着广阔的应用前景。

微针阵列技术的透皮给药方法能有效的克服皮肤表面的角质层对药物的阻挡，能很好的促进大分子抗原药物透皮吸收，该技术已不断发展成熟并得到了研究者的公认。从2005年首个可溶微针经皮释药文献报道起，可溶微针经过了近十年的研究，主要集中于可溶微针的制备方法和蛋白、多肽、疫苗等药物的经皮释药研究等方面。皮下或肌肉注射接种疫苗，尤其在儿童存在顺应性差、免疫效率低等问题，因此从药物给药领域来讲，更需要一种顺应性好、方便、高效的新的疫苗接种途径。而经皮免疫(transcutaneousimmunization，tci)有望实现和改善疫苗接种现阶段所遇到的困难，它可以将抗原和佐剂局部应用于皮肤而诱导产生全身免疫反应，可以克服目前注射接种方式存在的缺陷，有着广阔的应用前景。目前国外针对微针给药技术开发的经皮免疫制剂已经进入临床实验阶段。如法国研发的麻疹减毒活疫苗贴剂rouvax，美国iomai公司研制针对流感和旅行者腹泻的两种透皮免疫贴剂，分别进入了临床i和ⅲ期试验。因此微针经皮免疫方法因其具有独特的优点，已成为目前国际新型疫苗递送系统研究的热点之一。目前微针透皮免疫贴剂的应用，主要是采用微针阵列刺入皮肤形成通道后再移走，然后在治疗部位上涂疫苗液或者贴上普通透皮制剂；或者通过在微针表面包裹带有药物的膜衣，当微针刺入皮肤的时候将药物一起带入体内，提高药物的吸收率；上述两种方法存在给药剂量不准确，药物释放速度不可控等问题，因此对一种给药剂量准确和释药速度可控的可溶性微针免疫贴片的研究具有很好前瞻性。

技术实现要素：

基于此，本发明提供了一种流脑多糖结合疫苗可溶性微针贴片。

具体技术方案如下：

一种流脑多糖结合疫苗可溶性微针贴片，由可溶性微针基底与可溶性微针针体组成，所述可溶性微针基底由第一水溶性高分子材料的水溶液制备而成，所述可溶性微针针体由第二水溶性高分子材料的水溶液和a+c群流脑多糖结合疫苗制备而成；所述a+c群流脑多糖结合疫苗在所述可溶性微针针体中的重量百分比为不大于8％，且不为0；所述第二水溶性高分子材料由透明质酸钠、右旋糖酐和聚维酮组成，所述水溶性高分子材料的分子量为7000-630000。

在其中一些实施例中，所述右旋糖酐为右旋糖酐40，所述聚维酮为聚维酮k30；所述透明质酸钠的分子量为7500-8000，所述右旋糖酐40的分子量为32000～42000，所述聚维酮k30的分子量为35000-45000。

在其中一些实施例中，所述第二水溶性高分子材料中各组分的质量比为：

透明质酸钠8-15

右旋糖酐405-12

聚维酮k300.8-2。

在其中一些实施例中，所述第二水溶性高分子材料中各组分的质量比为：

透明质酸钠10-12

右旋糖酐407-9％

聚维酮k300.8-1.2。

在其中一些实施例中，所述第二水溶性高分子材料中各组分的质量比为：

透明质酸钠11

右旋糖酐408

聚维酮k301。

在其中一些实施例中，所述可溶性微针基底由质量比为1:95-105的透明质酸钠和水制备而成，所述基底中的透明质酸钠的分子量为1.80×10⁶-2.01×10⁶。

在其中一些实施例中，所述可溶性微针基底由质量比为1:99-101的透明质酸钠和水制备而成。

在其中一些实施例中，所述可溶性微针基底由质量比为1:100的透明质酸钠和水制备而成。

在其中一些实施例中，所述a+c群流脑多糖结合疫苗在所述可溶性微针针体中的重量百分比为5-8％。

在其中一些实施例中，所述可溶性微针针体的高度为400um-800um，所述可溶性微针针体的底部直径为160-200um。

在其中一些实施例中，所述可溶性微针针体的高度为600um-800um。

本发明还提供了上述流脑多糖结合疫苗可溶性微针贴片的制备方法。

具体技术方案如下：

一种流脑多糖结合疫苗可溶性微针贴片的制备方法，包括以下步骤：

(1)将所述a+c群流脑多糖结合疫苗和所述第二水溶性高分子材料溶解在水中，所得水溶液a作为针体制作液，然后将所述针体制作液覆盖到阴模模具中，离心，去除阴模模具上方多余的针体制作液；

(2)将所述第一水溶性高分子材料溶解在水中，所得水溶液b作为基底液，然后将所述基底液倒入步骤(1)覆盖有针体制作液的阴模模具中，离心；

(3)将覆盖有基底液的阴模模具干燥，即得所述流脑多糖结合疫苗可溶性微针贴片。

在其中一些实施例中，所述针体制作液中第二水溶性高分子材料的重量百分比为25％-45％。

在其中一些实施例中，所述针体制作液中第二水溶性高分子材料的重量百分比为30％-35％。

在其中一些实施例中，所述离心的转数为2800-3200rpm/min，温度为0-8℃，离心时间为5-15min。

在其中一些实施中，所述干燥包括将覆盖有基底液的阴模模具置于温度为2～25℃、湿度为8-12％的干燥柜中干燥20-28h。

本发明的流脑多糖结合疫苗可溶性微针贴片及其制备方法具有以下优点和有益效果：

本发明的发明人以其长期的经验积累和大量的实验研究发现，通过选择特定的安全的具有生物相容性的水溶性高分子材料，可以制备含有流脑多糖结合疫苗的可溶性微针贴片，该微针贴片具有良好的机械性能，具有足够的硬度和强度以及延展性，以保证可溶性微针针体部分可以有效刺穿皮肤；同时，进入皮肤内部的可溶性微针针体部分又能快速溶解，从而将可溶性微针针体中含有的a+c群流脑多糖结合疫苗释放入皮肤中，从而起到调节疫苗免疫应答的效果。

本发明的可溶性微针贴片免疫小鼠后，小鼠血清抗体阳转率大于80％，能有效的对机体产生免疫保护作用，且效果优于同等条件下的皮下注射免疫方式。

本发明的疫苗可溶性微针贴片的针体可以在15～60分钟内将目标药物释放到皮肤内，给药时间优选为30分钟，此时可以保证刺入皮肤部分的可溶性微针针体完全溶解在皮肤中并将a+c群流脑多糖结合释放入皮肤。

本发明的a+c群流脑多糖结合疫苗是均匀地分布在可溶性微针贴片的针体部分，同时可溶性微针贴片的背衬中不含有a+c群流脑多糖结合疫苗，避免了背衬不能进入皮肤释放药物而造成的药物浪费，实现药物利用效率最大化。均匀分布于针体中疫苗可完全释放于皮肤中，给药剂量准确，且释药速度可控。

本发明的流脑多糖结合疫苗可溶性微针贴片在使用时，将可溶性微针贴片的针体对准所作用的皮肤位置，用手按压可溶性微针贴片的背衬，可溶性微针贴片的针体刺穿皮肤角质层后进入表皮，即可进行疫苗药物释放，使用简单方便，不需要技术熟练的医生或护士来操作，适用于病人自己给药。

本发明的流脑多糖结合疫苗可溶性微针贴片的制备方法简单有效。

附图说明

图1为实施例1制备的金属阳模模具的示意图。

图2为与图1所示的金属阳模模具相适配的阴模模具的示意图。

图3为本发明的通过阴模模具所制备的可溶性微针贴片的示意图。

图4为本发明的可溶性微针贴片的整体示意图，其中1为基底(背衬)，2为针体(针尖)。

图5为实施例2中激光共聚焦扫描图。

图6为实施例3中a和c群脑膜炎球菌夹膜多糖抗体滴度柱状图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的流脑多糖结合疫苗可溶性微针贴片及其制备方法做进一步阐述。

a群流脑多糖结合疫苗冻干粉、c群流脑多糖结合疫苗冻干粉、a+c群流脑多糖结合疫苗冻干粉均由江苏无锡罗益生物制药提供。

实施例1微针模具的制备

(1)阳模模具的制备：采用计算机辅助设计(cad)设计阳模模具的形状、高度、间距，以及排布微针阵列的密度，模具的具体规格为：微针针高800μm，针尖间距900μm，针底直径300μm，阵列10×10行，100个锥形微针，微针阵列尺寸为1cm×1cm，可根据模具大小不同，适应性设计微针阵列的数目。通过数模转化将设计图纸转化数字化机床设备的数字化信息，分别选择黄铜和不锈钢作为加工材料按照设计尺寸进行加工成型；如图1所示。

(2)阴模模具的制备：将已制备的黄铜和不锈钢阳模，置于无水乙醇中，超声20min清洗掉在制备过程中表面残留的有机冷却液，置于室温下至表面乙醇挥净为止。取聚二甲基硅氧烷和单体固化剂以11:1(w/w)，用涡旋混合物仪混匀，置于真空箱内真空脱气15min，排尽气泡后，将液体慢速倒入已制备的黄铜和不锈钢阳模中，倒入过程避免气泡的产生，将其放置在烘箱中，烘箱温度设置为100℃，保温1.5小时，取出，脱模，即得pmds阴模，如图2所示。

实施例2

本实施例中，考察不同含量的a+c群流脑多糖结合疫苗对微针机械性能的影响。

(1)不同剂量的流脑多糖结合疫苗微针针尖液制备：取a+c群流脑多糖结合疫苗分别用去离子水稀释浓度为50mg/ml，40mg/ml，30mg/ml，20mg/ml，15mg/ml，10mg/ml，5mg/ml的七个不同浓度的a+c群流脑多糖结合疫苗，分别吸取2.0ml上述六种浓度的疫苗液，分别加入透明质酸钠0.55g、右旋糖酐40(dex40)0.40g、聚维酮k30(pvpk30)0.05g，涡旋混匀，充分溶胀后，放置过夜溶解，即得可溶性微针针尖液(透明质酸钠：右旋糖酐40：聚维酮k30：水的质量比为11:8:1：40)。所加入的透明质酸钠的分子量为7775，右旋糖酐40的分子量为37000，聚维酮k30的分子量为40000。

(2)流脑多糖结合疫苗可溶性微针制备：用注射器吸取步骤(1)制备的可溶性微针针尖液，每个微针阴模孔放入150ul针尖液，铺平后于冷冻离心机中设置转速3000rpm/min，温度为4℃，离心10min，取出吸取多余针尖液，用注射器吸取900ul基底液(透明质酸钠：水＝1:100，透明质酸钠的分子量为1.90×10⁶)，置于覆盖有针尖液的阴模模具中，于离心机中设置转速3000rpm/min，温度为4℃，离心5min，取出，放入干燥器中干燥固化24小时(温度为室温25℃，湿度为10％)，脱模，即得a+c群流脑多糖结合疫苗可溶性微针贴片(微针针体的高度为800um，直径为180um)。

(3)不同载药量微针贴片机械性能测试：分别用质构仪、冷场电子显微镜测试观察不同载药量疫苗微针的强度和外观，应用明胶模拟皮肤体外溶解时间，激光共聚焦观察插入的深度，评价各项指标的差异性。

(4)不同载药量的可溶性微针贴片的硬度和延展性见表1：

表1

注：固含量占比是指a+c群流脑多糖结合疫苗占可溶性微针针体的重量百分比。

(5)不同载药量可溶性微针样品的溶解时间见表2：

表2

注：固含量占比是指a+c群流脑多糖结合疫苗占可溶性微针针体的重量百分比。

(6)不同载药量可溶性微针样品插入皮肤深度的激光共聚焦实测值见表3,激光共聚焦扫描图见图5：

表3

注：固含量占比是指a+c群流脑多糖结合疫苗占可溶性微针针体的重量百分比。

结果分析：当以质量比为11:8:1的透明质酸钠、右旋糖酐40和聚维酮k30为骨架材料，a+c群流脑多糖结合疫苗占可溶性微针针体的重量百分比在8％以内时，所制得的a+c群流脑多糖结合疫苗对可溶性微针的硬度、延展性、溶解时限、皮肤插入深度均可满足使用要求，可保证可溶性微针针体部分有效刺穿皮肤，插入深度适中，同时，进入皮肤内部的可溶性微针针体部分又能快速溶解。综合考虑流脑疫苗的剂量要求，优选a+c群流脑多糖结合疫苗占可溶性微针针体的重量百分比为为5％-8％。当a+c群流脑多糖结合疫苗的载量过大时，针体成型后，硬度较低，刺入皮肤深度不够，无法满足流脑疫苗的正常剂量要求，且综合溶解时间过长，不能满足快速溶解的要求。

对比例1

本对比例的a+c群流脑多糖结合疫苗的可溶性微针的制备方法同实施例2，a+c群流脑多糖结合疫苗占可溶性微针针体的重量百分比为6％，不同在于水溶性高分子材料为透明质酸钠(分子量为7775)，透明质酸钠与水的质量比为20：40。

对比例2

本对比例的a+c群流脑多糖结合疫苗的可溶性微针的制备方法同实施例2，a+c群流脑多糖结合疫苗占可溶性微针针体的重量百分比为6％，不同在于水溶性高分子材料为右旋糖酐40(分子量为37000)，右旋糖酐40与水的质量比为20：40。

对比例3

本对比例的a+c群流脑多糖结合疫苗的可溶性微针的制备方法同实施例2，a+c群流脑多糖结合疫苗占可溶性微针针体的重量百分比为6％，不同在于水溶性高分子材料为透明质酸钠(分子量为7775)和聚维酮k30(分子量为40000)，透明质酸钠、聚维酮k30与水的质量比为11:9：40。

对比例4

本对比例的a+c群流脑多糖结合疫苗的可溶性微针的制备方法同实施例2，a+c群流脑多糖结合疫苗占可溶性微针针体的重量百分比为6％，不同在于水溶性高分子材料为聚乙烯醇1788(124000)和葡聚糖(分子量为7000)，聚乙烯醇1788、葡聚糖与水的质量比为11:9：40。

将对比文件1-4制备得到的a+c群流脑多糖结合疫苗的可溶性微针按实施例2的方法测试其机械性能和溶解性能，结果如表4所示，对比例制备得到的可溶性微针，其硬度和延展性均比实施例2差，插入皮肤深度远小于实施例2，不能满足使用要求。

表4

实施例3

本实施例中，通过可溶性微针经皮免疫和注射免疫两种不同给药方式对比研究，评价可溶性微针经皮免疫方式与皮下注射免疫方式免疫作用的差异性。同时考察针体高度不同的可溶性微针对免疫效果的影响，主要包括以下步骤：

本实施例中，透明质酸钠的分子量为7775，右旋糖酐40的分子量为37000，聚维酮k30的分子量为40000。

(1)流脑多糖结合疫苗注射对照组的制备：

a+c群流脑多糖结合疫苗注射对照组(ci1)：取a群流脑多糖结合疫苗冻干粉和c群流脑多糖结合疫苗冻干粉各5瓶，20μg/瓶，加生理盐水4.0ml溶解，即得a、c群流脑多糖结合疫苗浓度分别为25μg/ml的疫苗溶液，作为a+c群流脑多糖结合疫苗注射对照组备用(ci1)。

a+c群流脑多糖结合疫苗注射干预对照组(ci2)：取a群流脑多糖结合疫苗冻干粉和c群流脑多糖结合疫苗冻干粉5瓶，20μg/瓶，加生理盐水4.0ml溶解，即得a、c群流脑多糖结合疫苗浓度分别为25μg/ml的疫苗溶液，再精密称取透明质酸钠1.507mg，右旋糖酐1.096mg，聚维酮0.137mg，加入上述疫苗溶液中，混匀放置4℃冰箱充分溶胀过夜，溶解后备用。作为a+c群流脑多糖结合疫苗注射干预对照组备用(ci2)。

a+c群流脑多糖疫苗注射组(si)：精密称取a、c群精制多糖各5.0mg，生理盐水溶解至20.0ml，精密吸取1.0ml，生理盐水继续稀释至10.0ml，得25μg/mla+c群流脑多糖疫苗溶液作为多糖疫苗对照组(si)。

(2)流脑多糖结合疫苗可溶性微针针尖液的制备

a+c群流脑多糖结合疫苗可溶性微针800μm组针尖液：取a群流脑多糖结合疫苗34.00mg，c群流脑多糖结合疫苗39.00mg，加入生理盐水2.0ml溶解后，再精密称取透明质酸钠0.55g，右旋糖酐0.4g，聚维酮0.05g，加入上述溶液，混匀放置4℃冰箱充分溶胀过夜，溶解后备用。即得a、c群流脑多糖结合疫苗浓度分别为17mg/ml、19.5mg/ml的针尖液。

a+c群流脑多糖结合疫苗可溶性微针600μm组针尖液：取a群流脑多糖结合疫苗34.00mg，c群多糖结合流脑疫苗39.00mg，加入生理盐水2.0ml溶解后，再精密称取透明质酸钠0.55g,右旋糖酐0.4g，聚维酮0.05g，加入上述溶液，混匀放置4℃冰箱充分溶胀过夜，溶解后备用。即得a和c群流脑多糖结合疫苗浓度分别为17mg/ml、19.5mg/ml的针尖液。

a+c群流脑多糖结合疫苗可溶性微针400μm组针尖液：取a群流脑多糖结合疫苗34.00mg，c群流脑多糖结合疫苗39.00mg，加入生理盐水2.0ml溶解后，再精密称取透明质酸钠0.55g，右旋糖酐0.4g，聚维酮0.05g，加入上述溶液，混匀放置4℃冰箱充分溶胀过夜，溶解后备用。即得a和c群流脑多糖结合疫苗浓度分别为17mg/ml、19.5mg/ml的针尖液。(3)流脑多糖结合疫苗可溶性微针贴片的制备

取a+c群流脑多结合疫苗可溶性微针800μm组针尖液200μl，注入800μm的pmds阴模模具，使针尖液完全覆盖整个模具上表面，置于离心机中，设置转数3000rpm/min，温度4℃，离心10min。离心完毕后，将模具上方多余的针尖液移去，再注入900μl基底液(透明质酸钠：水＝1:100，透明质酸钠的分子量为1.90×10⁶)，再置于离心机中，设置转数3000rpm/min，温度4℃，离心10min。离心结束后取出，将模具整体放置于常温干燥器中(温度为室温25℃、湿度为10％)，干燥24小时。即得a+c群流脑多糖结合疫苗可溶性微针贴片800μm组(8cm)(即可溶性微针针体的高度为800um，直径为180um)，将所得微针贴片裁剪至贴合小鼠皮肤的小贴片，其中疫苗含量折合a和c群流脑多糖各10μg/片，密闭保存备用。

取a+c群流脑多糖结合疫苗可溶性微针600μm组针尖液200μl，注入600μm的pmds阴模模具，使针尖液完全覆盖整个模具上表面，置于离心机中，设置转数3000rpm/min，温度4℃，离心10min。离心完毕后，将模具上方多余的针尖液移去，再注入900μl基底液(透明质酸钠：水＝1:100，透明质酸钠的分子量为1.90×10⁶)，再置于离心机中，设置转数3000rpm/min，温度4℃，离心10min。离心结束后取出，将模具整体放置于常温干燥器中(温度为室温25℃、湿度为10％)，干燥24小时。即得a+c群流脑多糖结合疫苗可溶性微针贴片600μm组(6cm)(即可溶性微针针体的高度为600um，直径为180um)，将微针贴片裁剪至贴合小鼠皮肤的小贴片，其中疫苗含量折合a和c群流脑多糖各10μg/片，密闭保存备用。

取a+c群流脑多糖结合疫苗可溶性微针400μm组针尖液200μl，注入400μm的pmds阴模模具，使针尖液完全覆盖整个模具上表面，置于离心机中，设置转数3000rpm/min，温度4℃，离心10min。离心完毕后，将模具上方多余的针尖液移去，再注入900μl基底液(透明质酸钠：水＝1:100，透明质酸钠的分子量为1.90×10⁶)，再置于离心机中，设置转数3000rpm/min，温度4℃，离心10min。离心结束后取出，将模具整体放置于常温干燥器中(温度为室温25℃、湿度为10％)，干燥24小时。即得a+c群流脑多糖结合疫苗可溶性微针贴片400μm组(4cm)(即可溶性微针针体的高度为400um，直径为180um)，将微针贴片裁剪至贴合小鼠皮肤的小贴片，其中疫苗含量折合a和c群流脑多糖各5μg/片，密闭保存备用。

(4)可溶性微针空白对照组(bm)微针的制备

取200μl空白针尖液(透明质酸钠0.55g，右旋糖酐0.4g，聚维酮0.05g溶解于2.0ml生理盐水)，注入800μm的pmds阴模模具，使针尖液完全覆盖整个模具上表面，置于离心机中，设置转数3000rpm/min，温度4℃，离心10min。离心完毕后，将模具上方多余的针尖液移去，再注入900μl基底液(透明质酸钠：水＝1:100，透明质酸钠的分子量为1.90×10⁶)，再置于离心机中，设置转数3000rpm/min，温度4℃，离心10min。离心结束后取出，将模具整体放置于常温干燥器中(温度为室温25℃、湿度为10％)，干燥24小时。即得可溶性微针贴片空白对照组(bm)样品，密闭保存备用。

(5)流脑多糖结合疫苗免疫小鼠

动物分组：选取4-6周龄balb/c雌性小鼠，共48只，适应性饲养及检疫期为3天。将小鼠随机分为8组，每组6只，每组用苦味酸染色，用以区别各组，防止饲养和用药过程中发生混淆。

试样分组：生理盐水注射对照组(yi)、可溶性微针贴片空白对照组(bm)、a+c群流脑多糖结合疫苗注射组(ci1)、a+c群流脑多糖结合疫苗注射干预组(ci2)、a+c群流脑多糖结合疫苗可溶性微针贴片800μm组(8cm)、a+c群流脑多糖结合疫苗可溶性微针贴片600μm组(6cm)、a+c群流脑多糖结合疫苗可溶性微针贴片400μm组(4cm)、a+c群流脑多糖疫苗注射组(si)共8组。

免疫程序:生理盐水注射对照组(yi)，a+c群流脑多糖结合疫苗注射组(ci)，a+c群流脑多糖结合疫苗注射干预组(ci2)，a+c群流脑多糖疫苗注射组(si)分别于0、14、28天皮下注射0.2ml，注射剂量为10μg/剂，其中含a群流脑多糖疫苗、c群流脑多糖疫苗当量各5μg。

免疫程序:可溶性微针贴片空白对照组(bm)、a+c群流脑多糖结合疫苗可溶性微针贴片800μm组(8cm)、a+c群流脑多糖结合疫苗可溶性微针贴片600μm组(6cm)、a+c群流脑多糖结合疫苗可溶性微针贴片400μm组(4cm)分别于给药前一天对背部两侧皮肤进行脱毛处理，于0、14、28天在背部脱毛部位使用可溶性微针贴片给药。将微针贴片按压至皮肤表面，使用透气胶带粘附在背部，防止贴片脱落，待贴片完全溶解吸收后，取出透气胶带，全程免疫共3次。

免疫程序：微针给药剂量控制，a+c群流脑多糖结合疫苗可溶性微针贴片800μm组(8cm)，a+c群流脑多糖结合疫苗可溶性微针贴片600μm组(6cm)含有a群流脑多糖结合疫苗、c群流脑多糖结合疫苗当量各5.0μg，每次贴1片。a+c群流脑结合疫苗可溶性微针贴片400μm组(4cm)含有a群流脑多糖结合疫苗、c群流脑多糖结合疫苗当量各2.5μg，每次贴2片。

(6)流脑多糖结合疫苗免疫小鼠所得血清的制备：小鼠免疫第35天时或末次免疫后一周，将小鼠摘除眼球后于眼眶采血，37℃放置1h后，4℃放置过夜。置于离心机中，设置转数为3000rpm，离心8min，收集血清，2～8℃冷藏，分离血清于-20℃保存，用于elisa测定抗体滴度。

(7)酶联免疫吸附法检测小鼠血清中igg体液应答水平：

①液体制备

包被液配制：0.05mol/碳酸盐缓冲液(cbs，ph9.6)；na2co3，1.60g；nahco3，2.93g，调节ph至9.6，用超纯水定容1000ml；

抗体稀释液配制：0.01mol/l磷酸盐缓冲液(pbs，ph7.4)；nacl8.0g；kcl0.2g；na2hpo41.44g；kh2po40.24g，调节ph至9.6，用超纯水定容1000ml；

封闭液配制：称取1g牛血清白蛋白，溶于100ml抗体稀释液，混匀；

洗涤液配制：将磷酸盐溶于1lddh2o，混匀后加入500μltween20，再将ph调至7.4。

终止液配制：终止液(2mh2so4)的配制：将22.2ml浓硫酸缓慢注入177.8mlddh2o中，混匀

②具体步骤：

包被：用碳酸盐缓冲液分别稀释a和c群脑膜炎球菌多糖(抗原)至5μg/ml，分别用100μl/孔包被酶标板，4℃过夜(14～16h)；

封闭：将已包被好的酶标板取出，弃掉液体，用洗液洗板3次，拍干，每次加入300μl/孔洗液洗板，然后加入封闭液，150μl/孔，置37℃封闭2小时；

加入一抗：取出已封闭好的酶标板，甩掉液体，用洗液洗板3次，拍干。先将供试品血清1:100倍稀释。对照组血清先用稀释液稀释至1：100，然后加到酶标板中，100μl/孔，依次从该孔吸出100μl，梯度稀释至1：12800。所有血清加入后将酶标板放入37℃放置1小时；

加入二抗：取出已加样的酶标板，甩掉液体，用洗液洗板3次，拍干。将羊抗鼠igg-hrp按适当浓度，然后每孔加入100μl该稀释液，37℃放置1小时。

加入tmb底物显色液，100μl/孔，避光显色10min；

加入终止液(2mh2so4)，50μl/孔，立即置于酶标仪上于450nm波长处测定od值；

结果判断：a样品/a阴性≥2.1为阳性值

③实验结果：

所有阳性对照组血清产生抗a和抗c体抗体阳性率均≥80％时，说明微针经皮免疫和皮下注射免疫均已达预期免疫效果。各组血清抗体滴度除a+c群流脑多糖结合疫苗可溶性微针贴片400μm组(4m)外，a和c群抗体几何滴度均达到对应a+c群流脑多糖疫苗注射(si)对照组的8倍以上，说明流脑多糖结合疫苗的两种小鼠接种疫苗方式均到预期效果。并且a+c群流脑多糖结合疫苗可溶性微针贴片800μm组(cm)的血清抗体滴度明显高于同等剂量的注射组抗体滴度，血清a和c抗体几何平均滴度分别为注射组的1.8倍和1.7倍，表明可溶性微针贴片作为疫苗的传递方式能有效的对机体产生免疫保护作用，且优于皮下注射免疫。a和c群脑膜炎球菌夹膜多糖抗体滴度见图6。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。