本发明涉及一种貉犬瘟热冻干活疫苗及其制备方法和应用，本发明属于兽用生物制品技术领域。
背景技术：
犬瘟热是由副黏病毒科麻疹病毒属犬瘟热病毒引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，幼龄动物多为急性、致死性经过，成年动物可成慢性、持续性感染，临床症状以双相体温升高，伴有卡他性肺炎、胃肠炎为主要特征，偶有神经症状出现，容易继发其他细菌病毒的混合感染和二次感染，死亡率可高达80％，是危害我国毛皮动物养殖业的最严重的疫病之一。
貉犬瘟热全年任何季节都能够发生，尤其是仔貉在断乳前后以及育成期更加敏感，具有非常高的发病率和死亡率，老龄貉具有一定的抵抗力。带毒动物是貉犬瘟热的主要传染源，通过眼及鼻分泌物、唾液、尿、粪便排出病毒，主要经消化道、呼吸道传染。由于貉犬瘟有发病急、缺乏特效治疗方法的特点，貉犬瘟热仍以疫苗接种作为主要的防控手段，然而目前市场上并没有貉犬瘟热疫苗销售，很多养殖户以犬、水貂等动物的犬瘟热疫苗用以预防貉犬瘟热，无法取得较好的免疫保护效果。因此，开发安全、免疫效果良好的貉犬瘟热疫苗，不仅是行业和市场的迫切需求，具有广阔的市场应用前景，对于防控貉犬瘟热具有重要的意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种貉犬瘟热冻干活疫苗及其制备方法。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明通过貉体连续传代的方式，人工驯化了犬瘟热疫苗株cdv-o2，获得了一株对貉安全、免疫原性良好、滴度稳定的犬瘟热病毒弱毒疫苗株cdv-or12，并以此毒株制备了貉犬瘟热冻干活疫苗。
本发明的一种貉犬瘟热冻干活疫苗，其有效成分为貉犬瘟热病毒弱毒疫苗株，所述的貉犬瘟热病毒弱毒疫苗株命名为cdv-or12株，分类命名为犬瘟热病毒caninedistempervirus，该疫苗株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，微生物保藏号为cgmccno.13793，保藏时间为2017年04月21日。
在本发明所述的貉犬瘟热冻干活疫苗中，优选的，所含有的貉犬瘟热病毒弱毒疫苗株的含量tcid50≥104.5/头份，更优选的，所含有的貉犬瘟热病毒弱毒疫苗株的tcid50为104.5-105.5/头份。
在本发明所述的貉犬瘟热冻干活疫苗中，优选的，还包括冻干保护剂，所述的冻干保护剂中包括明胶、水解乳蛋白和蔗糖。
进一步的，本发明还提出了一种制备所述貉犬瘟热冻干活疫苗的方法，其包括以下步骤：
(1)取所述的貉犬瘟热病毒弱毒疫苗株cdv-or12株以吸附接毒的方式接种vero细胞上进行病毒扩增培养，每日观察细胞病毒情况，待细胞病变达到75-85％时通过反复冻融的方法收获病毒液，并进行病毒含量、纯净性检验，将检验合格的病毒液保存于-20℃；
(2)将明胶、水解乳蛋白和蔗糖溶解于水中，按照质量百分比计，使明胶的终浓度为2～7％，水解乳蛋白的终浓度为10～25％，蔗糖终浓度为15～30％，于116℃、20min高压灭菌后得到冻干保护剂；
(3)按照3～5体积份病毒液加入2体积份冻干保护剂的比例，将步骤(1)得到的病毒液与冻干保护剂充分混合，定量分装于无菌的青瓶内，加盖置于冻干机内预冻、干燥，即得。
在本发明所述的方法中，优选的，步骤(1)中所述的病毒液中貉犬瘟热病毒弱毒疫苗株的含量tcid50≥106.0/ml。
在本发明所述的方法中，优选的，制备得到的疫苗成品中貉犬瘟热病毒弱毒疫苗株的含量tcid50≥104.5/头份，更优选的，所含有的貉犬瘟热病毒弱毒疫苗株的tcid50为104.5-105.5/头份。
更进一步的，本发明还提出了所述的貉犬瘟热冻干活疫苗在制备预防貉犬瘟热药物中的用途。
实验证明，以此毒株制备得到的貉犬瘟热冻干活疫苗可有效保护貉免于犬瘟热病毒强毒的攻击，免疫3周和3个月后保护率均为100％，免疫6个月后保护率为90％，因此，该疫苗可有效预防貉犬瘟热的发生，免疫期为6个月。-15℃以下貉犬瘟热冻干活疫苗的保存期为15个月。本发明的提出为貉犬瘟热的防控提供了一种新的技术手段。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1犬瘟热病毒疫苗株cdv-o2的驯化及鉴定
1.犬瘟热病毒疫苗株cdv-o2的驯化
(1)将保存的犬瘟热病毒疫苗株cdv-o2以吸附接毒的方式接种于非洲绿猴肾细胞(vero)上进行病毒扩增培养，每日观察细胞病毒情况，待细胞病变达到80％左右时通过反复冻融的方法收获病毒液，并进行病毒含量(tcid50≥105.0/ml)、无菌检验。将检验合格的病毒液分装，并保存于-20℃。
(2)将扩增的cdv-o2病毒液原液后肢肌肉接种抗体阴性健康貉3只，每只5ml，分三点接种，隔离饲养并每天观察接种貉各项生理指标。接种后第3、5天分别剖杀貉1只，无菌条件下采集脾脏，并利用vero细胞进行病毒分离，并通过犬瘟热病毒特异性引物及犬瘟热病毒阳性血清进行鉴定。
(3)将分离到的犬瘟热病毒标记为cdv-or3，即为貉体内驯化第1代(f1)，将cdv-or3以吸附接毒的方式接种于vero细胞上进行病毒扩增培养，每日观察细胞病毒情况，待细胞病变达到80％左右时通过反复冻融的方法收获病毒液，并进行病毒含量(tcid50≥105.0/ml)、无菌检验。将检验合格的病毒液分装，并保存于-20℃。
(4)重复步骤(2)、(3)，将犬瘟热病毒在貉体内再连续驯化9次，得到犬瘟热病毒弱毒疫苗株，其为在貉体内驯化的第10代(f10)毒株，将该毒株命名为cdv-or12株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，微生物保藏号为cgmccno.13793，保藏时间为2017年04月21日。
2.犬瘟热病毒弱毒疫苗株cdv-or12对貉免疫原性测定
取保存的犬瘟热病毒弱毒疫苗株cdv-or12，调整病毒含量为104.5tcid50/ml，后肢肌肉接种抗体阴性健康貉5只，每只1ml，接种21天后测定血清中犬瘟热病毒中和抗体效价，并用犬瘟热病毒强毒hbf-1株攻毒，测定保护率。结果表明，犬瘟热病毒弱毒疫苗株cdv-or12接种貉血清中犬瘟热病毒中和抗体效价分别为：1:256、1:362、1:256、1:181、1:362，攻毒保护率为100％(5/5)。
3.犬瘟热病毒弱毒疫苗株cdv-or12对貉的毒力返强试验
取保存的犬瘟热病毒弱毒疫苗株cdv-or12连续5代肌肉接种抗体阴性貉，每代连续观察14天。结果显示每代接种貉体温、食欲、精神状态、粪便等生理指标均表现正常，未出现犬瘟热症状，说明该犬瘟热病毒弱毒疫苗株cdv-or12无毒力返强现象，可用于貉犬瘟热疫苗的研究。
实施例2貉犬瘟热冻干活疫苗(cdv-or12株)的制备
1.犬瘟热病毒制苗液的制备
取保存的犬瘟热病毒弱毒疫苗株cdv-or12株以吸附接毒的方式接种vero细胞上进行病毒扩增培养，每日观察细胞病毒情况，待细胞病变达到80％左右时通过反复冻融的方法收获病毒液，并进行病毒含量、纯净性检验，得到的病毒液中貉犬瘟热病毒弱毒疫苗株的含量tcid50≥104.5/ml。将检验合格的病毒液保存于-20℃。
2.制备冻干保护剂
将明胶、水解乳蛋白和蔗糖溶解于水中，按照质量百分比计，使明胶的终浓度为5％，水解乳蛋白的终浓度为15％，蔗糖终浓度为25％，于116℃、20min高压灭菌后得到。
3.貉犬瘟热冻干活疫苗的制备
按照4体积份病毒液加入2体积份冻干保护剂的比例，将收获的犬瘟热病毒制苗液与冻干保护剂充分混合，定量分装于无菌的青瓶内，加盖置于冻干机内预冻、干燥。
4.疫苗成品中犬瘟热病毒含量的测定
疫苗成品进行病毒含量测定，犬瘟热病毒含量tcid50为104.5-105.5/头份。
实施例3貉犬瘟热冻干活疫苗(cdv-or12株)的安全性试验
取检验合格的貉犬瘟热冻干活疫苗(实施例2制备)，后肢肌肉接种抗体阴性貉，设单剂量(接种1头份，犬瘟热病毒含量tcid50＝104.5/头份)、单剂量重复和超剂量(10倍)接种免疫组，同时设不接种疫苗貉作为阴性对照。疫苗接种后，连续14天观察貉的体温、食欲、精神状态、粪便等生理指标，并剖检观察接种貉主要脏器病变情况。试验结果表明，貉经单剂量、单剂量重复和超剂量接种后，各项生理指标均正常，未表现出任何临床症状，剖检观察接种貉主要脏器无病变。说明貉犬瘟热冻干活疫苗对貉安全。
实施例4貉犬瘟热冻干活疫苗(cdv-or12株)的效力及免疫期试验
取检验合格的貉犬瘟热冻干活疫苗(实施例2制备)，后肢肌肉接种抗体阴性貉，每只1ml(含1头份，犬瘟热病毒含量tcid50＝104.5/头份)，同时设接种vero细胞培养液对照组。接种3周、3个月、6个月和9个月后采血、分离血清，测定血清中犬瘟热病毒中和抗体，同时使用100个半数致死量(ld50)的犬瘟热检验用强毒hbf-1进行攻击，连续14天观察攻毒貉体温、食欲、精神状态、粪便等生理指标。
结果表明，接种3周和3个月后，接种貉血清中犬瘟热病毒中和抗体效价均在1:256以上，貉对犬瘟热病毒强毒的保护率均为100％(10/10)；接种6个月后，貉对犬瘟热病毒强毒的保护率为90％(9/10)；接种9个月后，貉对犬瘟热病毒强毒的保护率为70％(7/10)。因此，该疫苗的免疫期定为6个月。
实施例5貉犬瘟热冻干活疫苗(cdv-or12株)与同类疫苗(cdv3-cl株)对貉的免疫效力比较试验
取检验合格的貉犬瘟热冻干活疫苗(实施例2制备)，以及市场上销售的水貂犬瘟热活疫苗(cdv3-cl株)分别后肢肌肉接种抗体阴性貉，每只接种1头份(犬瘟热病毒含量tcid50＝104.5/头份)，同时设未接种疫苗的对照组。接种3周、3个月、6个月和9个月后采血、分离血清，测定血清中犬瘟热病毒中和抗体，同时使用100个半数致死量(ld50)的犬瘟热检验用强毒hbf-1进行攻击，连续14天观察攻毒貉体温、食欲、精神状态、粪便等生理指标。
结果表明，接种3周和3个月后，貉犬瘟热冻干活疫苗免疫组血清中犬瘟热病毒中和抗体效价均在1:256，接种貉对犬瘟热病毒强毒的保护率为100％(10/10)，水貂犬瘟热活疫苗免疫组血清中犬瘟热病毒中和抗体效价均在1:128以上，接种貉对犬瘟热病毒强毒的保护率为100％(10/10)；接种6个月后，貉犬瘟热冻干活疫苗免疫组接种貉对犬瘟热病毒强毒的保护率为100％(10/10)，水貂犬瘟热活疫苗免疫组接种貉对犬瘟热病毒强毒的保护率为80％(8/10)；接种9个月后，貉犬瘟热冻干活疫苗免疫组接种貉对犬瘟热病毒强毒的保护率为70％(7/10)，水貂犬瘟热活疫苗免疫组接种貉对犬瘟热病毒强毒的保护率仅为50％(5/10)。因此，本发明所制备的貉犬瘟热冻干活疫苗(cdv-or12株)的免疫效力优于临床上应用的水貂犬瘟热活疫苗。
实施例6貉犬瘟热冻干活疫苗(cdv-or12株)保存期测定
将检验合格的貉犬瘟热冻干活疫苗(实施例2制备)保存于-15℃以下，每3个月测定疫苗样品中犬瘟热病毒的含量。结果表明，貉犬瘟热冻干活疫苗在-15℃以下保存9个月后病毒含量开始下降，下降幅度为100.13～100.17；保存15个月后疫苗病毒含量仍在104.5tcid50/头份以上；保存18个月后疫苗病毒含量降到104.5tcid50/头份以下。因此，该疫苗在-15℃以下的保存期为15个月。
以上实验结果表明本发明制备得到的貉犬瘟热冻干活疫苗可有效保护貉免于犬瘟热病毒强毒的攻击，有效预防貉犬瘟热的发生。