狂犬病毒核蛋白单克隆抗体及其应用
【技术领域】
[0001 ]本发明属于病毒蛋白免疫分析技术领域，具体涉及狂犬病毒核蛋白单克隆抗体及 其应用。
【背景技术】
[0002] 狂犬病是我国法定报告管理的乙类传染病，是迄今为止人类死亡率最高的急性传 染病之一，其病原是狂犬病毒(Rabies virus)，人和所有温血动物对该病毒均易感。据我国 疾病预防控制中心统计，2014年我国共发生狂犬病例969例，死亡病例873例。狂犬病的致死 率接近100%，虽然人源抗狂犬病毒抗体药近年来有了很大的发展，但是目前仍然没有开发 出非常有效的治疗性药物，因此，狂犬疫苗仍然是目前防治狂犬病的最有效的手段。
[0003] 世界卫生组织(WHO)推荐的狂犬病暴露后预防措施，对狂犬病三级暴露后的预防 主要是采用狂犬疫苗注射结合抗狂犬病毒免疫球蛋白的方法。疫苗质量的好坏直接影响到 狂犬病的防治，但是目前普遍采用动物实验来进行疫苗的检测，费时费力，并且不同检测批 次之间受动物状态的影响非常大，因此检测标准不容易控制，所以急需要一种更加简便的 疫苗定量方法，能够简便、准确、重复性高地进行疫苗的定量。2014年，Ma等人开发了双抗体 夹心法来定量检测EV71疫苗的方法，双抗体夹心法依托单克隆抗体特异性强、灵敏度高的 特点，能够有效地检测并定量疫苗中的有效成分，逐渐成为疫苗定量的主要方法。
[0004] 狂犬病毒基因组为不分节段的单股负链RNA，全长约12kb，分别编码酶蛋白（L)、糖 蛋白（G)、基质蛋白（M)、磷酸化蛋白（P)、核蛋白（N)五个主要结构蛋白。其中，G蛋白和N蛋白 含有多个抗原位点，能够诱导产生抗狂犬病毒抗体。自1978年Wiktor和Koprowski首次制备 了狂犬病病毒的单克隆抗体以来，越来越多的实验室建立了狂犬病病毒的单抗杂交株，并 探讨了单抗在狂犬病病毒的免疫保护机制、流行病学、蛋白的各种功能以及狂犬病诊断等 方面的应用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对目前狂犬病依然困扰着人类的健康，且防治过程中依然存在 各种难处的现状，而提供一种能与狂犬病病毒中的核蛋白特异性结合的单克隆抗体以及产 生该抗体的杂交瘤细胞。本发明的单克隆抗体与狂犬病病毒的其他蛋白以及其他抗原和病 原体无交叉反应，具有高特异性、高敏感性的优点，可以准确检测狂犬病毒疫苗中的有效成 分的含量，具有良好的应用前景。
[0006] 为实现上述目的，本发明提供下述技术方案。
[0007] 本发明提供的技术方案之一是:狂犬病毒核蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体的 轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所 示;或者，所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，重链可变区的 氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0008] 本发明提供的技术方案之二是:产生如前所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞。
[0009] 本发明提供的技术方案之三是:如前所述的单克隆抗体经生物标记或化学标记得 到的标记复合物。
[0010] 本发明中，所述的生物标记为本领域常规，如可以是以酶、生物素等标记抗体，优 选地，所述的生物标记为酶标记，更优选地，所述的酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。
[0011] 本发明提供的技术方案之四是:如前所述的单克隆抗体在制备检测狂犬病毒的试 剂盒中的应用。
[0012] 本发明提供的技术方案之五是:如前所述的单克隆抗体在制备检测狂犬病毒抗体 的试剂盒中的应用。
[0013] 本发明提供的技术方案之六是:如前所述的单克隆抗体在制备预防或治疗狂犬病 的药物中的应用。
[0014] 本发明提供的技术方案之七是:如前所述的单克隆抗体在狂犬病毒疫苗质检中的 应用。
[0015] 本发明提供的技术方案之八是:包含如前所述的单克隆抗体的药物。
[0016] 本发明提供的技术方案之九是:特异性检测狂犬病毒核蛋白的ELISA试剂盒，其是 以单克隆抗体5H7作为包被抗体，以酶标记的单克隆抗体1C7作为检测抗体，或者，其是以单 克隆抗体1C7作为包被抗体，以酶标记的单克隆抗体5H7作为检测抗体;其中，所述单克隆抗 体5H7的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述单克隆抗体1C7的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，重链可变 区的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
[0017] 本发明提供的能够识别狂犬病毒核蛋白的单克隆抗体5H7和1C7具有良好的特异 性，实验表明，各克隆间识别没有交叉反应。间接ELISA表明这两个抗体具有较高的效价，因 此可用于狂犬病病毒及疫苗组分的检测。此外，由于5H7和1C7分别识别狂犬病病毒核蛋白 上不同的抗原决定簇。因此，可以采用双抗夹心法，分别利用特异识别的两个单克隆抗体对 狂犬病病毒核蛋白进行精确定量检测。
[0018] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。
[0019] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0020] 本发明的积极进步效果在于:本发明提供的单克隆抗体与狂犬病病毒其他蛋白以 及其他抗原和病原体无交叉反应，用于检测具有高特异性、高敏感性的优点，可以准确检测 样品中狂犬病联合疫苗中各有效成分的含量，在疫苗和临床检测中将会得到广泛应用。
【附图说明】
[0021] 图1是单克隆抗体的SDS-PAGE电泳图，其中，M是蛋白分子量标准（kDa )，泳道1为 85八，泳道2为107，泳道3为5!17。
[0022] 图2为单克隆抗体的Western blot结果图。
[0023] 图3为单克隆抗体的免疫荧光结果图。
[0024] 图4为检测狂犬病病毒核蛋白的ELISA法拟合曲线。
【具体实施方式】
[0025]以下实施例用于说明本发明，但并不用来限制本发明的范围。除特殊说明的之外， 各实施例中所用的设备和试剂均常规市售可得。
[0026]实施例1杂交瘤细胞系的建立 [0027] -、实验材料
[0028] 1、免疫原：以狂犬病病毒SRV9株作为免疫原。
[0029] 2、培养基:DMEM培养基购于Hyclone公司；HAT、HT选择培养基、降植烷购于sigma公 司。
[0030] 3、实验动物:Balb/c小鼠，8-12周龄，雌性，SPF级动物培养。
[0031] 4、其他材料：弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购于Sigma公司；PEG4000购于Fluka 公司;HRP-山羊抗小鼠 IgG抗体购于JacksonImmune公司；其余试剂均为国产分析纯产品。 [0032]二、杂交瘤细胞系的建立 [0033] 1、动物免疫
[0034] 1)基础免疫:将免疫原与弗氏完全佐剂等体积混合并充分乳化，分点皮下注射，每 只Balb/c小鼠每次注射量为100yg。
[0035] 2)加强免疫:加强免疫采用抗原与弗氏不完全佐剂的乳化液。在进行细胞融合前3 天，经腹腔注射含150yg抗原的生理盐水溶液。
[0036] 2、杂交瘤细胞的制备
[0037]按常规方法收集小鼠的脾细胞与SP2/0细胞按10:1的比例以500g/L的PEG4000进 行融合。用HAT培养液选择培养，融合后10~15天，取上清采用间接ELISA法筛选识别狂犬病 病毒的杂交瘤细胞株。对所得阳性克隆株采用有限稀释法进行亚克隆。间接ELISA法的操作 步骤如下：用200yL的SP55和SP70包板，用免疫小鼠血清1:2000作为阳性对照，无克隆生长 的培养基上清和正常小鼠血清作为阴性对照，每孔加1:2000HRP-山羊抗小鼠IgG IOOyU最 后测定450nm OD值。凡0D450值大于阴性对照2倍以上者，即可初步判定为阳性克隆。
[0038] 3、杂交瘤细胞系的建立
[0039] 重复步骤2,进行2次细胞融合，经过4次亚克隆和间接ELISA筛选，得到5株分别针 对SP55、2株针对SP70的，稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系。筛选得到的2株杂交瘤细胞 分泌的抗体分别命名为5H7和IC7。
[0040] 4、应用上述杂交瘤细胞系所得单抗的效价检测，结果如表1和表2所示。
[0041] 表1狂犬病病毒抗体效价检测(腹水）
[0043]表2狂犬病病毒抗体效价检测(纯化抗体）
[0045] I)细胞培养液上清效价测定：间接ELI SA法检测上述杂交瘤细胞培养上清效价为： 1:50000~1:100000。