专利名称：一种检测狂犬病毒属病毒的codehop rt-pcr试剂及方法
技术领域：
本发明涉及狂犬病毒的检测技术，具体涉及ー种检测狂犬病毒属病毒的C0DEH0PRT-PCR试剂及方法。
背景技术：
狂犬病毒属分为7个基因型狂犬病病毒(classical rabies virus),拉各斯蝙幅病毒(Lagos bat virus),莫科拉病毒(Mokola virus),杜文海格病毒(Duvenhagevirus),欧洲蝙蝠狂犬病毒I型(European bat lyssavirus types I),欧洲蝙蝠狂犬病毒 2 型(European bat lyssavirus types 2 ),澳大利亚蝙幅狂犬病毒(Australian batlyssavirus).国内流行的野毒株为基因I型，近十年来中国狂犬病的发病率及死亡率一直 維持在毎年超过2000人的高位。基因2型飞型仅在非洲和欧洲发现，5型和6型在欧洲蝙蝠中比较普遍，虽感染人的病例不多，但几乎每型病毒都曾致死人。考虑到欧亚大陆的连续性和国际贸易的频繁往来，无法排除其余基因型狂犬病毒的传入。目前，狂犬病毒的检测方法主要有病毒分离、实验动物攻毒、血清学检测方法和基因检测方法。基因检测方法主要是反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，如授权公告号为CN 101153344，名称为狂犬病毒套式RT-PCR检测方法及检测试剂盒的发明专利，就公开了以外套PCR预混体系和内套PCR预混体系的RT-PCR技术，可以完成全部7个基因型的检测，外套引物扩增产物大小是845bp，内套引物扩增产物大小是371bp，内套引物是以不同基因型RV特点设计的简并引物。该发明专利虽然可检测所有狂犬病毒属的基因型，但需要外套PCR预混体系和内套PCR预混体系ニ种检测试剂共同检测，检测方法复杂，检测时间也较长，且不能有效确认具体基因型，更无法鉴定狂犬病毒属内的未知病毒或可能出现其他基因型的病毒。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种检测狂犬病毒属病毒的C0DEH0P RT-PCR试剂及方法，该C0DEH0P RT-PCR试剂只用一组引物下，特异性更；用该C0DEH0P RT-PCR试剂检测狂犬病毒属时间较短，方法简便，灵敏性高，且可以确认具体基因型，以及鉴定狂犬病毒属内的未知病毒或可能出现其他基因型的病毒。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为一种检测狂犬病毒属的C0DEH0P RT-PCR试剂，包括引物溶液，所述引物溶液中含有核苷酸序列为5’ -TTTGTTTTCTGACAAGAATG ACAAATatha ayathaa -3’ 的上游引物 KQZ1，和核苷酸序列为 5’ -TTTTGCTGCATGTCTAACTT Cttgrtcnac cca -3’的下游引物KQZ2，上述序列中其中h含义为a或c或t/u, y含义为c或tAi，r含义为g或a, η含义为g或a或c或tAl或其它。检测狂犬病毒属病毒的方法，其步骤如下
a、RNA提取用RNA提取试剂盒(购自Qiagen公司)提取病毒的RNA，得到RNA，具体提取方法依说明书进行；
b、RNA逆转录用RNA逆转录试剂盒(购于Promega公司)对上述RNA进行RNA逆转录，得到PCR模板,具体逆转录方法依说明书进行在0.2mL eppendorf管中加入oligo d (T)15primers (50mM) I μ L，上述RNA 10μ L,72°C 10. min，再加入反应试剂，20 μ L反应体系中AMV反转录酶终浓度为O. 5U/ μ L，RNA酶抑制剂终浓度为O. 5U/ μ L，dNTP终浓度为O. 5mM,4μ L RT-buffer 5 X，反应条件为42°C 60min，72°C IOmin ;反应产物即为后续的PCR模板；
c、PCR反应在 O. 2mL 印pendorf 管中加入 10 XPCR 缓冲液(PCR buffer)2· 5 μ L、浓度为25mM的MgCl2溶液I. 5 μ L、浓度为IOmM的dNTP液0. 5 μ L、浓度为5U/ μ L的Taq酶液
0.5 μ L、含浓度都为25 μ M的上游引物KQZl和下游引物KQZ2的引物溶液I μ L、上述PCR模板2yL，灭菌去离子水16yL，组成PCR反应体系；反应条件为94°C预变性5min，94°C变性30s，52°C退火 30s，72°C 延伸 lmin，35 个循环，72°C延伸 7min，4°C保存 PCR 产物；
d、琼脂糖凝胶电泳将上述PCR产物用重量百分浓度为1-1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测目标条带，电泳条件电压IOOv, 30min,将电泳结果用凝胶成像系统分析,若结果出现548bp大小片段的条带，则为狂犬病毒属病毒，对548bp大小片段的条带测序，若548bp条带的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :3所示则为阿拉万病毒，若548bp条带的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :4所示则为澳大利亚蝙蝠狂犬病毒，若548bp条带的核苷酸序列如序列表SEQID NO :5所示则为杜文海格病毒，若548bp条带的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :6所示则为欧洲蝙蝠狂犬病毒，若548bp条带的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :7所示则为伊尔库特病毒，若548bp条带的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :8所示则为苦盏病毒，若548bp条带的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:9所示则为拉各斯蝙蝠病毒，若548bp条带的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: 10所示则为奥泽尔狂犬病毒，若548bp条带的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :11所示则为莫科拉病毒，若548bp条带的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO12所示则为经典狂犬病病毒，若548bp条带的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:13所示则为希莫尼蝙蝠病毒，若548bp条带的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO : 14所示则为高加索蝙幅病毒。以上PCR buffer、MgCl2、dNTP液、Taq酶液等反应试剂均购自大连宝生生物，引物由上海生工合成。根据Genbank上已有已分类具有L片段全片段基因7个基因型病毒株，选取12株代表性病毒株计引物对。从genbank中下载狂犬病毒属各种病毒的L基因组片段的蛋白质序列。将蛋白序列以FASTA格式保存，将下载的FASTA格式的氨基酸序列信息输入进行Block比对，得到高度保守的连续氨基酸区域。使用CodeHop引物捜索，筛选合适上下游引物。要求简并度低，上下游引物位置间距在500bp左右。利用primer和oligo软件进行引物分析，得到C0DEH0P引物I对KQZl和KQZ2。与现有技术相比，本发明的优点在于ー种检测狂犬病毒属病毒的C0DEH0P RT-PCR试剂及方法，引物溶液中含有核苷酸序列为TTTGTTTTCT GACAAGAATG ACAAATatha ayathaa的上游引物KQZ1，和核苷酸序列为TTTTGCTGCA TGTCTAACTT Cttgrtcnac cca的下游引物KQZ2，其中5'端非兼并共有序列夹和很短的3 '端根据保守氨基酸设计的核心简并区组成，5'端非兼并共有序列在不增加引物简并度的情况下其稳定3 '兼并核心区与模板结合作用，允许在较高退火温度下进行，提高了兼并PCR反应的特异性，通过RNA提取、RNA逆转录、PCR反应和琼脂糖凝胶电泳，扩增产物序列长度为548bp ;对特异性扩增序列进行测序，可以确认阿拉万病毒、澳大利亚蝙蝠病毒、杜文海格病毒、欧洲蝙蝠狂犬病毒、伊尔库特病毒、苦盏病毒、拉各斯蝙 蝠病毒、奥泽尔狂犬病毒、莫科拉病毒、经典狂犬病病毒、希莫尼蝙蝠病毒和西高加索蝙蝠病毒等，同时能对狂犬病毒属内基因同源的未知病毒进行检測，所获得的生物信息学数据可以用于狂犬病毒的分子流行病学调查研究。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进ー步详细描述。实施例I :RT_PCR方法检测狂犬病毒细胞培养物
1、RNA提取用RNA提取试剂盒(购自Qiagen公司)提取狂犬病毒疫苗株Vero细胞(宁波荣安生物药业有限公司馈赠)的RNA，得到RNA，具体提取方法依说明书进行，同时用正常VeiO细胞提取RNA作为阴性对照。用微量分光光度计测量RNA浓度和纯度，0D260/280 ^ 1.9,表明RNA纯度较高，无DNA和蛋白质污染；
2、RNA逆转录用RNA逆转录试剂盒对上述RNA进行RNA逆转录，得到PCR模板在O. 2mL eppendorf 管中加入 oligo d (T) 15 primers IyL (50 μ M) , RNA 10 μ L, 72°C 10.min，加入 4yL RT buffer 5X、lyL dNTP (10mM)、AMV 反转录酶 I μ L (IOU/μ L)、RNaseInhibitor 0· 5 μ L、Rnase-free Water I. 5μ L,42°C lh,72°C IOmin0 反应产物作为后续的PCR模板；
3、PCR反应在 0. 2mL 印 pendorf 管中加入 10 XPCR buffer2. 5 μ L, MgCl2L 5μ L(25mM)、dNTP (IOmM) 0· 5 μ L、Taq (5U/μ L) O. 5 μ L、引物溶液(上、下游引物都为 25 μ M)14し？0 模板2レし,DDff 16 μし94°C预变性5min，94°C变性30s，52°C退火30s，72°C延伸Imin，35个循环，72 °C延伸7min，4°C保存PCR产物；
4、琼脂糖凝胶电泳将RT-PCR产物用1-1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测目标条帯，电泳条件电压100v，30min，将电泳结果用凝胶成像系统分析。结果狂犬病毒疫苗株Vero细胞培养物出现548bp大小片段，而正常Vero细胞培养物无特异性目的条带，测序其序列如序列表SEQ ID NO : 12所示，为经典狂犬病病毒。RT-PCR方法灵敏性按照上述步骤1-4的方法进行检测，用分光光度计检测提取狂
犬病毒疫苗株感染的VeiO细胞，步骤I提取的RNA浓度为SOng/yL，将RNA用Rnase-free Water 10倍梯度稀释。结果显示本检测方法可以检测出的最高稀释度为1θΛ相当于浓度50pg核酸的病毒RNA都可以检測。RT-PCR方法特异性按照上述步骤1-4的方法，用狂犬病毒疫苗株RNA、汉坦病毒 RNA、甲型HlNl流感病毒RNA、柯萨奇病毒RNA、流行性こ型脑炎RNA，正常Vero细胞
RNA，作为检测对象，用KQZl/ KQZ2引物对扩增，结果只有狂犬病毒疫苗株核酸扩增产物出现一条548bp特异性条带外，汉坦病毒、甲型HlNl流感病毒、柯萨奇病毒、流行性こ型脑炎病毒及正常Vero细胞RNA扩增产物均未见特异性核酸条带。实施例2、利用PCR方法检测杜文海格病毒阳性质粒将人工合成的杜文海格病毒核酸(SEQ ID勵:5)片段(宝生物合成)，连接至？1 18づ载体，转化至DH5a大肠杆菌，挑取克隆酶切鉴定，选取阳性克隆和阴性克隆增菌培养，使用质粒提取试剂盒(购自上海生エ)提取质粒作为阳性模板和阴性对照模板；再按实施例I步骤3的方法进行PCR反应，步骤4的方法进行琼脂糖凝胶电泳，结果也得到548bp特异性条带，阴性对照无目的条带。实施例3、利用PCR方法检测拉各斯蝙蝠病毒阳性质粒其方法与实施例2基本相同，所不同的只是为人工合成的拉各斯蝙蝠病毒核酸(SEQ ID N0:9)片段(宝生物合成)，结果也得到548bp特异性条带，阴性对照无目的条带。实施例4、利用PCR方法检测莫科拉病毒阳性质粒其方法与实施例2基本相同，所不同的只是为人工合成的莫科拉病毒核酸(SEQ ID NO: 11)片段(宝生物合成)，结果也得到548bp特异性条带，阴性对照无目的条带。实施例5、利用PCR方法检测澳大利亚蝙蝠狂犬病毒阳性质粒其方法与实施例2基本相同，所不同的只是为人工合成的澳大利亚蝙蝠狂犬病毒核酸(SEQ ID N0:4)片段(宝生物合成)，结果也得到548bp特异性条带，阴性对照无目的条带。实施例6、利用PCR方法检测阿拉万病毒阳性质粒其方法与实施例2基本相同，所不同的只是为人工合成的阿拉万病毒核酸(SEQ ID N0:3)片段(宝生物合成)，结果也得 到548bp特异性条带，阴性对照无目的条带。实施例7、利用PCR方法检测欧洲蝙蝠狂犬病毒阳性质粒其方法与实施例2基本相同，所不同的只是为人工合成的欧洲蝙蝠狂犬病毒核酸(SEQ ID N0:6)片段(宝生物合成)，结果也得到548bp特异性条带，阴性对照无目的条带。实施例8、利用PCR方法检测伊尔库特病毒阳性质粒其方法与实施例2基本相同，所不同的只是为人工合成的伊尔库特病毒核酸(SEQ ID N0:7)片段(宝生物合成)，结果也得到548bp特异性条带，阴性对照无目的条带。实施例9、利用PCR方法检测苦盏病毒阳性质粒其方法与实施例2基本相同，所不同的只是为人工合成的苦盏病毒核酸(SEQ ID N0:8)片段(宝生物合成)，结果也得到548bp特异性条带，阴性对照无目的条带。实施例10、利用PCR方法检测奥泽尔狂犬病毒阳性质粒其方法与实施例2基本相同，所不同的只是为人工合成的奥泽尔狂犬病毒核酸(SEQ ID N0:10)片段(宝生物合成)，结果也得到548bp特异性条带，阴性对照无目的条带。实施例11、利用PCR方法检测希莫尼蝙蝠病毒阳性质粒其方法与实施例2基本相同，所不同的只是为人工合成的希莫尼蝙蝠病毒核酸(SEQ ID N0:13)片段(宝生物合成)，结果也得到548bp特异性条带，阴性对照无目的条带。实施例12、利用PCR方法检测高加索蝙蝠病毒阳性质粒其方法与实施例2基本相同，所不同的只是为人工合成的高加索蝙蝠病毒核酸(SEQ ID N0:14)片段(宝生物合成)，结果也得到548bp特异性条带，阴性对照无目的条带。
权利要求
1.一种检测狂犬病毒属病毒的CODEHOP RT-PCR试剂，包括引物溶液，其特征在于所述引物溶液中含有核苷酸序列为TTTGTTTTCT GACAAGAATG ACAAATatha ayathaa的上游引物KQZ1，和核苷酸序列为TTTTGCTGCA TGTCTAACTT Cttgrtcnac cca的下游引物KQZ2，上述序列中其中h含义为a或c或tAi，y含义为c或tAi，r含义为g或a,η含义为g或a或c或t/u或其它。
2.利用权利要求I所述的ー种检测狂犬病毒属病毒的C0DEH0PRT-PCR试剂检测狂犬病毒属病毒的方法，其特征在于步骤如下 a、RNA提取用RNA提取试剂盒提取病毒的RNA，得到RNA，具体提取方法依说明书进行； b、RNA逆转录用RNA逆转录试剂盒对上述RNA进行RNA逆转录，得到PCR模板，具体 逆转录方法依说明书进行； c、PCR反应在O.2mL eppendorf管中加入10XPCR缓冲液2. 5 μ L、浓度为25mM的MgCl2溶液I. 5 μ L、浓度为IOmM的dNTP液O. 5 μ L、浓度为5U/ μ L的Taq酶液O. 5 μ L、含浓度都为25 μ M的上游引物KQZl和下游引物KQZ2的引物溶液I μ L、上述PCR模板2 μ L，灭菌去离子水16 μ L，反应条件为94°C预变性5min，94°C变性30s，52°C退火30s，72°C延伸Imin，35个循环，72 °C延伸7min，4°C保存PCR产物； d、琼脂糖凝胶电泳将上述PCR产物用重量百分浓度为1-1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测目标条带，电泳条件电压IOOv, 30min,将电泳结果用凝胶成像系统分析,若结果出现548bp大小片段的条带，则为狂犬病毒属病毒，若548bp条带的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO3所示则为阿拉万病毒，若548bp条带的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :4所示则为澳大利亚蝙蝠狂犬病毒，若548bp条带的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :5所示则为杜文海格病毒，若548bp条带的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :6所示则为欧洲蝙蝠狂犬病毒，若548bp条带的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :7所示则为伊尔库特病毒，若548bp条带的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :8所示则为苦盏病毒，若548bp条带的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :9所示则为拉各斯蝙蝠病毒，若548bp条带的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO10所示则为奥泽尔狂犬病毒，若548bp条带的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :11所示则为莫科拉病毒，若548bp条带的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO : 12所示则为经典狂犬病病毒，若548bp条带的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :13所示则为希莫尼蝙蝠病毒，若548bp条带的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :14所示则为西高加索蝙蝠病毒。
全文摘要
本发明公开了一种检测狂犬病毒属病毒的CODEHOPRT-PCR试剂及方法，引物溶液中含有核苷酸序列为TTTGTTTTCTGACAAGAATGACAAATathaayathaa的上游引物KQZ1，和核苷酸序列为TTTTGCTGCATGTCTAACTTCttgrtcnaccca的下游引物KQZ2，其中5＇端非兼并共有序列夹和很短的3＇端根据保守氨基酸设计的核心简并区组成，5＇端非兼并共有序列在不增加引物简并度的情况下其稳定3＇兼并核心区与模板结合作用，允许在较高退火温度下进行，提高了兼并PCR反应的特异性，通过RNA提取、RNA逆转录、PCR反应和琼脂糖凝胶电泳，扩增产物序列长度为548bp；对特异性扩增序列进行测序，可以确认已知病毒，同时能对狂犬病毒属内基因同源的未知病毒进行检测，所获得的生物信息学数据可以用于狂犬病毒的分子流行病学调查研究。
文档编号C12R1/93GK102643929SQ201210097098
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月5日 优先权日2012年4月5日
发明者倪红霞, 胡群, 谢东华, 郭利平, 马思杰 申请人:中华人民共和国大榭出入境检验检疫局