专利名称：一种高纯度提取土壤微生物总dna的方法
技术领域：
本发明涉及分子生态学技术领域，具体涉及ー种桑园土壌微生物总DNA的提取方 法。
背景技术：
长期以来，有关土壤微生物的多祥性研究是通过分离培养来实现的。然而，绝大多数微生物种群尚不能实现纯培养，这成为土壤微生物多祥性研究的一个限制性因素。随着土壌微生物群落结构研究的不断深入，借助现代分子生物学技术的研究方法如PCR-RFLP、PCR-SSCP、PCR-DGGE等避免了传统研究方法不能全面获取土壤微生物多样性信息的缺陷，可以通过土壤微生物DNA表现出的多样性，真实地反映土壤微生物种群结构情况，而土壤微生物群落基因组总DNA的高效、高品质提取，是从分子生物学水平对土壤微生物群落结构进行研究的前提条件。由于土壤理化成分复杂，常含有腐殖酸、酚类化合物、重金属离子等影响DNA分子操作的物质，土壤样品处理和实验条件较复杂，耗时长，以致从土壤环境中获得高纯度微生物基因组DNA具有一定难度，DNA提取技术创新因此备受关注。目前已经报道了多种土壤微生物总DNA提取方法。从土壤提取微生物总DNA的方法大致分为两类直接提取法和间接提取法。间接法提取的DNA纯度高，但其缺点是得到的细菌只占总菌群的25 % 50 %，而直接法提取的DNA超过细菌总DNA的60 %。直接法由于能够提取到较全的细菌DNA、省力、DNA产量高，因而发展很快。Tsai等使用SDS和溶菌酶裂解细胞提取总DNA，Tiedje等使用PVP (聚こ烯吡咯烷酮)和CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)去除腐殖酸，效果很好，Bourrain等人采用该方法从活性污泥中提取了 DNA，Reddy等人从堆肥中提取了 DNA。桑园土壤微生物的多祥性及生命活动与桑园土壤结构的形成和改良、土壌肥力演变、桑树根部病害的发生、桑树营养物质供给和植株生长发育等密切相关，但目前尚未见应用免培养法研究桑园土壤微生物多祥性的报道。
发明内容
本发明是基于建立桑树根围土壌微生物群落结构的分子生态学试验技术体系，借鉴已有的土壌微生物总DNA的提取方法，提供一种高效的可直接用于PCR分析的桑园土壤微生物总DNA提取方法。为实现上述目的，本发明公开了如下的技术方案一 .材料选择供试土壤于2011年3月7日采自湖北省农业科学院经济作物研究所生产桑园(东经114° 19'，北纬30° 29'，海拔29m)的桑树根围，桑树品种为湖桑32号。采集土壤为黄粘土，采样深度为5 IOcm表土层，按5点法取样，混匀后放入无菌袋中，4°C保存，24h内完成土壌微生物基因组总DNA的提取。ニ.试剂选择
本发明采用的主要试剂 中十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十二烷基磺酸钠(SDS)、聚こ烯吡咯烷酮K30(PVP K30)、聚こニ醇8000 (PEG8000)、脲、去离子甲酰胺均购自华美生物工程有限公司；溶菌酶、蛋白酶均购自Sigma公司；硝酸银购自中国人民解放军第九五零九エ厂；λ DNA/HindIII digest DNA Marker,2000DL DNA Marker 和 Taq HS 均购自大连宝生物工程有限公司；16SrDNA通用引物由上海英骏生物工程有限公司合成；土壤提取试剂盒 E.Z.N.A. Soil DNA Kit (50)购自 Omega 公司。三.土壤微生物总DNA直接裂解方法方法一 CTAB-蛋白酶-SDS-反复冻融法取5g 土样，向其中加入 13. 5mL DNA 提取液 I (Tris-HCl I OOmmo I/L, EDTA
IOOmmo I/L, Na3PO410 Ommo I/L, NaCl I. 5mol/L, 1% CTAB ；pH 8. O)和少许石英砂，漩涡振荡器振荡3min ;再加入20mg/mL蛋白酶Κ15μ L，混匀，37 °C、230r/min摇床中温育Ih ;加入
I.5mL 10% SDS,65°C水浴Ih ;反复冻融3次,8500r/min离心IOmin ;取上清液,加入等体积的酹/氯仿/异戍醇(体积比25 : 24 : I)抽提，8500r/min离心IOmin ;取上清液,カロ入等体积的氯仿/异戊醇(体积比24 I)再次抽提，8500r/min离心lOmin，取上清液，备用。方法ニ PVP预处理-CTAB-溶菌酶-蛋白酶-SDS-反复冻融法取5g 土样加入20g/L偏磷酸钠缓冲液(含10g/L PVP-K30 ；pH 8. 5) 30mL,摇床振荡15min,8500r/min离心5min,取沉淀，重复洗漆3次；取沉淀，加入13. 5mL DNA提取液 I (Tris-HCl IOOmmoI/L，EDTA IOOmmoI/L，Na3PO4 100mmol/L, NaCl I. 5mol/L, 1% CTAB ；pH 8. 0)和少许石英砂，漩涡振荡器振荡3min ;加入100mg/mL溶菌酶150 μ L，混匀，37°C、230r/min摇床中温育Ih ;再加入20mg/mL蛋白酶K15 μ L，混匀，37°C水浴Ih ;加入I. 5mL10% SDSJS1O水浴Ih ;反复冻融3次,8500r/min离心IOmin ;取上清液,加入等体积的酹/氯仿/异戍醇(体积比25 24 I)抽提，8500r/min离心IOmin ;取上清液,加入等体积的氯仿/异戍醇(体积比24 I)再次抽提，8500r/min离心IOmin,取上清液,备用。方法三PVP预处理-CTAB、CaCl2, BSA-溶菌酶-蛋白酶-SDS-反复冻融法取5g 土样加入20g/L偏磷酸钠缓冲液(含10g/L PVP-K30 ；pH 8. 5) 30mL,摇床振荡15min,8500r/min离心5min,取沉淀，重复洗漆3次；取沉淀,加入13. 5mL DNA提取液
II(Tris-HCl IOOmmoI/L，EDTA IOOmmoI/L，Na3PO4 100mmol/L, NaCl I. 5mol/L, 1% CTAB,2% CaCl2,1 μ g/mL BSA ；pH 8. 0)和少许石英砂，漩涡振荡器振荡3min。后续操作与方法ニ相同。方法四CTAB、PVP、CaCl2、BSA_溶菌酶、蛋白酶-SDS-反复冻融法取5g 土样，加入 13. 5mL DNA 提取液 III (Tris-HCl IOOmmoI/L，EDTA IOOmmoI/L,Na3PO4 IOOmmoI/L, NaCl I. 5mol/L, 1% CTAB, 2% CaCl2,1 μ g/mL BSA,2% PVP ；pH 8. 0)和少许石英砂，镟润振荡器震荡3min ;加入150 μ L 100mg/mL溶菌酶、15 μ L 20mg/mL蛋白酶K，混匀，37°C、230r/min摇床中温育lh。后续操作与方法二相同。方法五CTAB、CaCl2, BSA-溶菌酶、蛋白酶_SDS、PVP-反复冻融法取5g 上样，加入 13. 5mL DNA 提取液 II (Tris-HCl IOOmmoI/L，EDTA IOOmmoI/L,Na3PO4 IOOmmoI/L, NaCl I. 5mol/L, 1% CTAB, 2% CaCl2,1 μ g/mL BSA ；pH 8. 0)和少许石英砂，镟润振荡器振荡3min ;加入100mg/mL溶菌酶150 μ L、20mg/mL蛋白酶K15 μ L,混勻，37°C、230r/min 摇床中温育 Ih ;加入 I. 5mL 10% SDS 和 O. 3g PVP，混匀，65°C水浴 Ih ;反复冻融3次。后续操作与方法二相同。方法六试剂盒法采用Omega公司的土壤提取试剂盒E.Z.N.A. Soil DNA Kit (50)进行提取。四.土壤微生物总DNA沉淀方法方法一异丙醇沉淀法在上清液中加入O. 7倍体积异丙醇和O. I倍体积NaAc，_20°C放置过夜，8500r/min,4°C离心20min,沉淀用70%こ醇洗漆，12500r/min离心IOmin,沉淀室温晾干，加入200 μ LTE溶解沉淀，_20°C保存。方法ニ PEG8000沉淀法在上清液中加入O. 5倍体积25% PEG 8000和O. I倍体积5mol/LNaCl，4°C放置过夜,8500r/min, 4°C离心20min,沉淀用70 %こ醇洗漆，12500r/min离心IOmin,沉淀室温晾干，加入200 μ L TE溶解沉淀，_20°C保存。五.土壤微生物总DNA的质量检测I. DNA的纯度和定量检测用紫外分光光度计测量DNA溶液的D (230nm)、D (260nm)、D(280nm)值，根据公式dsDNA = D(260nm) X稀释的倍数X50计算DNA的质量浓度(ng/μ L)，换算出每克土提取的 DNA 量，且根据 D (260nm) /D (230nm)、D (260nm) /D (280nm)检测DNA的纯度。同时用I %琼脂糖凝胶电泳检测分析。2. 16SrDNAV3片段PCR以提取的桑园土壤微生物总DNA为模板直接进行PCR。正、反向引物分别为GC-F341(5' -CGCCCGCCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGGGCACGGGGGG CCT ACG GGA GGC AGC AG-3/ )和 R518(5' -ATTACC GCG GCT GCTGG-3')。反应体系10XPCR buffer (含 Mg2+)3y L，2. 5mmol/L dNTPs 2. 4 μ L，10 μ mol/L 上、下游引物各
O.6 μ L，Taq 酶 1U，模板 DNA 30ng，最后加 ddH20 至 30 μ し PCR程序:94°C预变性 5min ；94°C变性lmin,退火lmin, 72 °C延伸lmin, 36个循环(退火温度从65 °C 55 °C,姆ー循环降低
O.5°C，随后15个循环保持55°C ) ;72°C最终延伸7min。PCR产物通过2%琼脂糖凝胶电泳检测。重复三次。3.变性梯度凝胶电泳分离16SrDNA V3片段PCR产物应用JY-TD331变性梯度凝胶电泳仪(北京君意东方电泳设备有限公司)分离PCR产物。取15yL PCR产物，加入10 μ L6X loading buffer进行变性梯度凝胶电泳(DGGE),电泳条件8%聚丙烯酰胺，电泳缓冲液为1XTAE，50% 80%变性剂(尿素和去离子甲酰胺)，温度60°C，电压100V，电泳时间17h。电泳结束后银染显色。六.结果分析I.桑树根围土壤微生物总DNA提取方法的初步筛选采用5种不同的细胞裂解方法和2种DNA沉淀方法进行组合，从而得到8种不同的直接提取桑树根围土壤微生物总DNA的方法，并以试剂盒法提取的桑树根围土壤微生物总DNA为參照，利用紫外分光光度法测定其D (230nm)、D (260nm)、D (280nm)值。以D (260nm) /D (280nm)代表DNA的纯度与质量，以D (260nm)/D (230nm)代表DNA中腐殖酸污染的程度。表I数据显示了不同提取方法的效果。方法2以CTAB-蛋白酶-SDS-反复冻融裂解细胞，获得DNA产率较高，但是腐殖酸、污染严重；方法3、4、5、6在方法2的基础上均采用2%偏磷酸钠缓冲液(含1% PVP-K30 ；PH8. 5)预洗涤，使微生物从土壤中充分释放，以期提高DNA产率，但方法3、6并未达到理想效果，方法4、5效果较好，且对去除腐殖酸则起到了一定作用。其中，方法4和方法5在方法2的基础上进一步采用BSAXaCl2去除腐殖酸，使得DNA的纯度有所提高，腐殖酸的污染程度有所降低。方法8、9省去了 PVP预处理，PVP在其后的裂解步骤中加入，但影响并不大。试剂盒提取的DNA纯度高，腐殖酸污染程度低，但是，DNA产率低，且试剂盒价格昂贵。
由图I可知，不同方法提取的DNA的分子质量都在23kb以上，是基因组DNA，且DNA未被打断，均为大片段DNA，可用于后续的分子生物学分析。综合考虑DNA纯度与质量、腐殖酸污染程度和产率，方法4、5、8、9结合物理、化学、生物3种方法裂解细胞，在DNA提取液中添加PVP、BSA、CaCl2进ー步去除腐殖酸，省去繁琐的预洗涤步骤，获得的DNA产率高于
11.2 μ g/g, D (260nm) /D (230nm)大于 2. ll，D(260nm)/D(280nm)大于 I. 71，在纯度和腐殖酸污染程度上都达到了直接进行PCR的要求。表I几种桑树根围土壤微生物总DNA提取方法的比较
DNA沉淀方ハm… DNA产率
、卞D(260.1
编号细胞裂解方法1)(260 nm)/ nm)/ ^g'g胸)
DNA.DNA
No.Cell lysis methodsD(230 nm) ￡)(280
sedimentatioproduction
nm)
n methodsrate
1试剂盒法试剂盒法
1, ,1.771.7010.0 Kit method Kit method
CTAB-蛋白酶-SDS-反复冻异丙醇
融/NaAc
20.841.2371.6 CTAB-proteinaseK- Isopropanol/
SDS-freezing thawNaAc
PVP预处理-CTAB-溶菌酶 B
-蛋白酶-SDS-反复冻融に
3PVP Oretreatment-CTAB-1.27 ‘1.6955.4
Isopropanol/
lvsosome-protemaseK-SDS
NaAc
-rreezmg thaw
权利要求
1.一种高纯度提取土壌微生物总DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤 采用CTAB、CaCl2, BSA-溶菌酶、蛋白酶_SDS、PVP-反复冻融法；取5g桑树根围土样，加入13. 5mL DNA提取液II和少许石英砂，漩涡振荡器振荡3min ;加入100mg/mL溶菌酶150μ L、20mg/mL 蛋白酶 Κ15μ L，混匀，37°C、230r/min 摇床中温育 Ih ;加入 I. 5mL 10% SDS和O. 3g PVP,混勻，65°C水浴Ih ;反复冻融3次；8500r/min离心IOmin ;取上清液,加入等体积的酹/氯仿/异戍醇抽提，酹/氯仿/异戍醇体积比25 24 l,8500r/min离心IOmin ;取上清液，加入等体积的氯仿/异戊醇再次抽提，氯仿/异戊醇体积比24 l,8500r/min离心lOmin，取上清液；在上清液中加入O. 7倍体积异丙醇和O. I倍体积NaAc，_20°C放置过夜,8500r/min, 4°C离心20min,沉淀用70%こ醇洗漆，12500r/min离心IOmin,沉淀室温晾干，加入200 μ L TE溶解沉淀，_20°C保存，即获得桑树根围土壤微生物总DNA ； 所述 DNA 提取液 II 成分为 Tris-HCl IOOmmoI/L，EDTA IOOmmoI/L，Na3P04 IOOmmol/L, NaCl I. 5mol/L, 1% CTAB, 2% CaCl2,1 μ g/mL BSA ；pH8. O ;所述的土样，采自桑树根围土壤，深度为5 IOcm表土层，按5点法取样，混匀后放入无菌袋中，4°C保存。
2.如权利要求I所述的提取DNA的方法的用途，其特征在于该方法在进行16SrDNA的扩增及DGGE图谱分析，与RDP数据库中已有的序列进行比对，或通过建立新的序列探针识别未知菌，从而确定微生物群落结构组成、结构多样性及其生态功能。
全文摘要
本发明公开了一种高纯度提取土壤微生物总DNA的方法，利用CTAB、溶菌酶、蛋白酶和SDS共同作用以裂解细胞的同时对其反复冻融，获得了良好的细胞裂解效果。利用PVP、CaCl2、BSA去除腐殖酸，异丙醇沉淀DNA，获得的DNA纯度高。所用方法简单方便，不经纯化即可用于后续的PCR分析和DGGE分析。提取的DNA纯度达到直接进行后续分子生物学研究的需要，提取的DNA片段可进行16SrDNA的扩增及DGGE图谱分析，并可对DGGE谱带的特异条带切胶回收、碱基测序，与RDP数据库中已有的序列进行比对，或通过建立新的序列探针识别未知菌，从而确定微生物群落结构组成，为今后研究桑树根围土壤微生物群落结构多样性与生态功能奠定基础。
文档编号C12N15/10GK102643797SQ201210096840
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月5日 优先权日2012年4月5日
发明者于翠, 叶楚华, 彭波, 李勇, 熊超, 胡兴明, 邓文 申请人:湖北省农业科学院经济作物研究所