专利名称：微生物收集芯片、微生物收集试剂盒、微生物收集用过滤器的制作方法
技术领域：
本发明是收集附着在检查对象上的微生物的装置，涉及到用于使该微生物发色以及发光、发荧光，对存在于检查对象的活细胞和死细胞或特定的微生物进行有效捕集、检测、测定的微生物收集芯片、微生物收集试剂盒、使用该微生物收集试剂盒的微生物计量方法、微生物计量装置的正常状态检查确认用检体以及微生物计量装置。
背景技术：
以往，作为这样的微生物收集装置，都是通过泵运转产生的压力变化从含有微生物的液体检体过滤微生物后，将微生物捕集在过滤器上，对该部件进行分解，使用象镊子那样的能够进行精细操作的工具，回收附着的收集微生物的过滤器，进行测定。
以往那样的微生物收集装置在收集微生物时需要泵等大的装置。另外，在有异物等直接影响那样的检体的情况时，需要另外去除异物的过程。进一步为了检查收集在过滤器上的微生物，需要只回收过滤器。在该作业中，由于需要进行精细操作的镊子等工具，所以效率低，不能处理大量的样品。另外，由于使用泵，机器大，在食品检查工序等作业空间狭窄场所不能操作。这些方面在要求迅速的微生物检查中都需要一定程度的检查时间和技术。因此，存在着无论谁都不能简便迅速地进行检查的课题。
本发明就是要解决以往那样的课题，目的在于提供通过使用使除去异物用过滤器的微生物收集用过滤器一体化的装置，谋求迅速化、简易化的微生物收集芯片。
另外，作为本发明的目的还提供通过将除去异物用过滤器的孔径做成5至20μm，使微生物通过，在尽可能除去异物的同时，通过将微生物收集用过滤器的孔径做成0.2至0.8μm，确实捕集微生物的微生物收集芯片。
还有，作为本发明的目的还提供通过设置以除去异物用过滤器为底部的液体检体注入容器，即使液体检体的容量多的情况也可以对应的微生物收集芯片。
另外，作为本发明的目的还提供通过在除去异物用过滤器的前端设置液体检体注入容器，将液体检体注入容器与含有除去异物用过滤器的部位做成可装卸，液体检体注入容器可以重复使用的微生物收集芯片。
另外，作为本发明的目的还提供通过附加盖在液体检体注入容器开口部的带有棉签的盖，从难于收集处于检查对象的角落和间隙等那样的微生物的场所能够简便地收集到微生物的微生物收集芯片。
另外，作为本发明的目的还提供通过将含有微生物收集用过滤器的部位单独做成可卸下的装置，在微生物计量装置中可将微生物收集用过滤器在每一部位设置的微生物收集芯片。
另外，作为本发明的目的还提供通过将微生物收集用过滤器做成暗色的过滤器，抑制背景的发光，可以高精度地进行微生物计量的微生物收集芯片。
另外，作为本发明的目的还提供通过在微生物收集用过滤器上形成由某种成分构成的薄膜，抑制背景(バツクグランド)发光，可以高精度地进行微生物计量的微生物收集芯片。
另外，作为本发明的目的还提供通过将薄膜的膜厚度做成适当的值，做成更确实表现出形成薄膜出现的效果的微生物收集芯片。
进一步，作为本发明的目的还提供备有上述那样的微生物收集芯片和抽滤手段的微生物收集试剂盒。
还有，作为本发明的目的还提供在抽滤手段中通过使用负压管，不需要泵等装置或特别技术的微生物收集试剂盒。
另外，作为本发明的目的还提供通过在负压管的口部设置橡皮塞，从外部将管插过橡皮塞，进行抽滤的微生物收集试剂盒。
另外，作为本发明的目的还提供通过使用中心部成薄层的橡皮塞，从外部容易插过管的微生物收集试剂盒。
另外，作为本发明的目的还提供通过在微生物收集用过滤器的下部设置通到负压管内部的中空针，贯通橡皮塞，容易达到负压管内部的微生物收集试剂盒。
进一步，作为本发明的目的还提供使用上述那样的微生物收集芯片，将染色的微生物捕集到微生物收集用过滤器上，同时对活细胞和死细胞两方，或任一方和特定微生物进行检测的微生物计量方法。
还有，作为本发明的目的还提供使用上述那样的微生物收集芯片，将微生物捕集到微生物收集用过滤器上，对微生物进行染色，同时对活细胞和死细胞两方，或任一方和特定微生物进行检测的微生物计量方法。
另外，作为本发明的目的还提供通过向液体检体添加墨汁，在将微生物捕集到微生物收集用过滤器上时，使过滤器变黑，抑制背景和异物的发光，可以高精度地进行微生物计量的微生物计量方法。
另外，作为本发明的目的还提供通过从捕集了微生物的微生物收集用过滤器的上面添加墨汁，与上述同样可以高精度地进行微生物计量的微生物计量方法。
另外，作为本发明的目的还提供通过使用微生物计量装置的正常状态检查确认用检体，确认装置处于正常状态之后，进行微生物计量，不会得出由于装置异常出现的不正确计量结果的那样的微生物计量方法。
另外，作为本发明的目的还提供通过在微生物计量装置的正常状态检查确认用检体中使用表面固定了高分子荧光粒子的基体材料，对装置状态的确认能够反复多次正确进行的微生物计量方法。
另外，作为本发明的目的还提供通过在微生物计量装置的正常状态检查确认用检体中使用表面固定了染色的微生物的基体材料，对装置状态的确认能够正确进行的微生物计量方法。
进一步，作为本发明的目的还提供通过使用表面固定了由特定波长的激发光引起发光的发光体的基体材料，对装置状态的确认正确进行的微生物计量装置的正常状态检查确认用检体。
还有，作为本发明的目的还提供通过将基体材料做成暗色，抑制背景发光，对装置状态的确认正确进行的微生物计量装置的正常状态检查确认用检体。
另外，作为本发明的目的还提供通过形成由处于固定了发光体的基体材料上的某种成分构成的薄膜，抑制背景发光，对装置状态的确认正确进行的微生物计量装置的正常状态检查确认用检体。
另外，作为本发明的目的还提供通过将薄膜的膜厚度做成适当的值，做成更确实表现出形成薄膜出现的效果的微生物计量装置的正常状态检查确认用检体。
进一步，作为本发明的目的还提供用于对被捕集到位于微生物收集芯片中微生物进行计量的微生物计量装置，能够确认装置处于正常状态的装置。
发明内容
本发明的微生物收集芯片为了完成上述目标，设置了除去异物的过滤器以及微生物收集用过滤器，其特征是通过过滤将微生物捕集在微生物收集用过滤器上。而利用本发明，可以得到检查对象即使是食品材料屑或环境中沙尘等特殊检体，也能够有效除去蔬菜屑或肉片等异物，将大小比这些异物更小、能够通过除去异物用过滤器的微生物捕集到微生物收集用过滤器上，通过预先对这些捕集的微生物进行染色或捕集后进行染色，使检测变得容易的微生物收集芯片。
还有，将除去异物用过滤器的孔径做成5至20μm，将微生物收集用过滤器的孔径做成0.2至0.8μm为本发明的特征。那么，利用本发明通过将除去异物用过滤器的孔径做成5至20μm，最大可能地除去异物，将微生物收集用过滤器的孔径做成0.2至0.8μm，可以得到能够确实将微生物捕集到微生物收集用过滤器上的微生物收集芯片。
另外，将除去异物用过滤器做在液体检体注入容器的底部为本发明的特征。那么，利用本发明即使液体检体容量多的时候，过滤也变得容易，还可以使液体检体往除去异物用过滤器上注入变得容易的微生物收集芯片。
另外，在除去异物用过滤器的前段设置液体检体注入容器为本发明的特征。那么，利用本发明通过将液体检体注入容器与含有除去异物用过滤器的部位做成可装卸，可以得到液体检体注入容器能够重复使用的微生物收集芯片。
另外，备有盖在液体检体注入容器开口部的带有棉签的盖为本发明的特征。那么，利用本发明可以得到从处于菜板上的划痕或检查对象的角落等难于检测部位的微生物的收集变得容易的微生物收集芯片。
另外，将含有微生物收集用过滤器的部位做成可单独卸下装置为本发明的特征。那么，利用本发明通过将含有微生物收集用过滤器做成可单独卸下装置，就可以得到不必只将过滤器卸下，使为了进行微生物计量的操作变得容易的微生物收集芯片。
另外，将微生物收集用过滤器做成暗色的过滤器为本发明的特征。那么，利用本发明可以得到对背景发光后妨碍正确微生物计量能够进行有效抑制的微生物收集芯片。
另外，在过滤器上形成含有从金、铜、铬、铂、钯中至少选出一种金属成分的薄膜为本发明的特征。那么，利用本发明可以得到对背景发光后妨碍正确微生物计量能够进行有效抑制的微生物收集芯片。
另外，将薄膜的膜厚度做成10至50nm为本发明的特征。那么，利用本发明可以得到使形成薄膜出现的效果更确实的微生物收集芯片。
进一步，本发明的微生物收集试剂盒为了完成上述目标，其特征是由上述那样的微生物收集芯片和抽滤手段构成。那么，利用本发明可以得到在食品工厂等现场无论谁都能够简单而且确实进行微生物收集和计量的微生物收集试剂盒。
另外，将抽滤手段做成负压管为本发明的特征。那么，利用本发明通过在抽滤手段上使用负压管，就不需要泵等特殊而且大的装置，可以得到能够简易、而且迅速收集微生物的微生物收集试剂盒。
另外，在负压管的口部设置橡皮塞为本发明的特征。那么，利用本发明通过在负压管的口部设置橡皮塞，在从外部将管插过橡皮塞能够抽滤的同时，插管子时不容易滑等操作变得容易，抽滤后的滤液的废弃变得容易。还有，由于使用橡皮塞可以得到能够使位于微生物收集试剂盒内的负压管保持密闭性的微生物收集试剂盒。
另外，将负压管口部的橡皮塞的中心部做成薄层为本发明的特征。那么，利用本发明，由于负压管口部的橡皮塞的中心部做成薄层，可以得到能够在较小的阻力下将中空针等扎入的微生物收集试剂盒。
另外，在微生物收集用过滤器的下部设置通到负压管内部的中空针为本发明的特征。那么，利用本发明，由于设置中空针，可以得到从中空针容易抽滤处于上部的液体检体的微生物收集试剂盒。
进一步，本发明的微生物计量方法的特征是为了完成上述目标，通过使活细胞和死细胞两者发色的第1化合物、在与上述发色不同的波长下使死细胞发色的第2化合物和在与上述发色不同的波长下使活细胞发色的第3化合物中的1种或多种，以及与来自特定微生物的物质进行反应，在与上述发色不同的波长下发色的至少一种以上的第4化合物接触液体检体，在液体检体含有微生物情况下对微生物进行染色后，使用上述那样的微生物收集芯片，将微生物捕集到微生物收集用过滤器上后，从该波长差以及发色量，同时对活细胞和死细胞两方或任一方与特定微生物进行检测。那么，利用本发明可以获得能够高精度、而且简单地对活细胞和死细胞、特定微生物进行计量的微生物计量方法。
还有，本发明的微生物计量方法为了完成上述目标，其特征是由使用微生物收集芯片从含有微生物的液体检体中将微生物捕集到微生物收集过滤器上之后，通过使被捕集的微生物中的活细胞和死细胞两者发色的第1化合物、在与上述发色不同的波长下使死细胞发色的第2化合物和在与上述发色不同的波长下使活细胞发色的第3化合物中的1种或多种，以及与来自特定微生物的物质进行反应，在与上述发色不同的波长下发色的至少一种以上的第4化合物接触液体检体，对微生物进行染色后，从该波长差以及发色量，同时对活细胞和死细胞两方或任一方与特定微生物进行检测。那么，利用本发明，即使在液体检体的容量多的时候，可以获得由于第1至第4化合物的使用量少，可以精度高、而且简单地对活细胞或死细胞、以及特定微生物进行计量的微生物计量方法。
另外，向液体检体添加墨汁为本发明的特征。那么，利用本发明，即使在微生物收集用过滤器上由于制造上的问题，存在微细的塌陷线等情形时，墨汁从根本上或抑制背景发光，或抑制异物发光，可以得到精度更高地进行微生物计量的微生物计量方法。
另外，在将微生物捕集到微生物收集用过滤器上后，从微生物收集用过滤器的上面添加墨汁，使微生物收集用过滤器变黑为本发明的特征。那么利用本发明，与上述同样可以获得能够精度高地进行微生物计量的微生物计量方法。
另外，使用含有表面固定了经特定波长的激发光进行发光的发光体的基体材料的微生物计量装置的正常状态检查确认用检体，预先对该发光体进行检测，在确认微生物计量装置处于正常状态后，同时对活细胞和死细胞两方或任一方与特定微生物进行检测为本发明的特征。那么，利用本发明，如果装置出现异常不能正确对发光体进行检测时，通过对装置的状态进行确认，可以获得能够正确进行微生物计量的微生物计量方法。
另外，将发光体做成高分子荧光粒子为本发明的特征。那么，利用本发明，由于高分子荧光粒子稳定时间长，而且维持均一发光，所以对装置的状态的确认可以正确地多次反复进行，而且确保对人体安全性的微生物计量方法。
进一步，为了达到上述目标，本发明的微生物计量装置的正常状态检查确认用检体的特征是对含有表面固定了由特定波长的激发光进行发光的发光体的基体材料在进行微生物计量之前，对微生物计量装置处于正常状态进行确认。那么，利用本发明可以得到能够正确判定微生物计量装置是否处于正常状态的该装置的正常状态的检查确认用检体。
另外，将基体材料做成暗色为本发明的特征。那么，利用本发明可以得到抑制背景发光、能够正确进行装置状态确认的微生物计量装置的正常状态检查确认用检体。
另外，在表面固定了经特定波长的激发光进行发光的发光体的基体材料上形成含有从金、铜、铬、铂、钯中至少选出一种金属成分的薄膜为本发明的特征。那么，利用本发明可以得到能够有效抑制背景发光，正确进行装置状态确认的同时，可以进行发光体的发光强度的调整，例如，当发光强度过强时使发光强度减弱，以及防止固定在基体材料表面的发光体的脱落等的微生物计量装置的正常状态检查确认用检体。
另外，将薄膜的膜厚度做成10至1000nm为本发明的特征。那么，利用本发明可以得到使形成薄膜出现的效果更确实的微生物计量装置的正常状态检查确认用检体另外，为了完成上述目标，本发明的微生物计量装置是具有在预定的波长区对位于上述那样的微生物收集芯片中的微生物收集用过滤器的微小的一定面积进行照射激发光的光源；接受由上述激发光进行发光的预定的波长区的光的受光手段；在设定的一定时间内接受被上述光源照射后发光的光，该受光的光量处于设定的阈值的范围内时，判断为微生物的微生物判断手段；使上述微小的一定面积连续或断续地移动的移动手段；根据微生物判断手段判断为微生物的信号计算微生物的数量的计算手段的微生物计量装置，其特征是含有表面固定了由特定波长的激发光进行发光的发光体的基体材料，在进行微生物计量之前能够确认微生物计量装置处于正常状态。那么，利用本发明可以得到在正常状态下能够高精度、而且简单地对活细胞或死细胞、以及特定微生物进行计量的微生物计量装置。
附图的简单说明
图1是本发明的微生物收集试剂盒一种方式的剖面图。
图2是本发明的微生物收集试剂盒其他方式的剖面图。
图3是使用本发明的微生物收集试剂盒，用于进行微生物计量的装置的一种方式的概略图。
图4是本发明的微生物计量装置的正常状态检查确认用检体的一种方式的斜视图(部分透视图)。
图5是图4所示检查用检体中的树脂片的正面图。
发明的最佳实施方式以下用图对微生物收集芯片、微生物收集试剂盒、微生物计量方法、微生物计量装置的正常状态检查确认用检体以及微生物计量装置进行说明。然而，本发明并不限定于以下的说明。
图1(a)是本发明微生物收集试剂盒一种方式的剖面图。微生物收集试剂盒A由微生物收集芯片B和抽滤手段C构成。微生物收集芯片B，作为基本构成由处于前段的预过滤器的除去异物用过滤器1和处于后段的暗色(例如黑色)的微生物收集用过滤器2(例如在白色的过滤器上形成了碳薄膜的过滤器)构成。除去异物用过滤器1的孔径为了尽可能除去异物，做成2至20μm，微生物收集用过滤器2的孔径为了确实捕集到微生物，做成0.2至0.8μm。这里，孔径指的是最小孔径。微生物收集芯片B含有液体检体注入容器3，除去异物用过滤器1做在液体检体注入容器3的底部。微生物收集用过滤器2配置在台座4的上面，台座4保持在台座保持构件5。中空针6与保持在台座保持构件5的台座4形成一体。液体检体注入容器3和台座保持构件5可拆卸地嵌合在一起。抽滤手段C是负压管7，负压管7的口部用橡皮塞8封住。
通过将微生物收集用过滤器做成暗色的过滤器，可以对由于背景发光妨碍正确的微生物计量进行有效地抑制。另外，可以在过滤器上形成含有从金、铜、铬、铂、钯选出至少一种金属成分的薄膜。这些成分由于具有对300至550nm左右波长的激发光的分光反射率低的性质，所以如果将微生物收集用过滤器2做成暗色的过滤器，再于过滤器上形成上述薄膜，效果会进一步提高(铝和银由于对上述波长的激发光的发光反射率高，所以不能采用)。薄膜除了可以由一种金属成分构成之外，也可以由合金、金属氧化物、金属碳化物、金属氮化物等构成。另外，也可以是叠层薄膜。作为薄膜形成的方法，优选采用真空蒸(发)镀(膜)法、离子溅射法、离子镀法等众所周知的气相成长法。薄膜的厚度优选做成10至50nm。因为一方面担心如果厚度低于10nm，形成薄膜的效果不能充分发挥，另一方面担心如果超过50nm，会发生过滤器的孔堵塞，影响到过滤器本来的功能。
液体检体，当检查对象为饮料水等液体样品时，其本身就是液体检体。检查对象以蔬菜和肉代表的食品材料等固体样品时，要将其匀浆，制备成液体检体，或用棉签从其表面收集微生物，然后使其悬浮于生理盐水等中，做成液体检体。另外，当菜板等炊事用具等为检查对象时，用棉签从其表面收集微生物，然后使其悬浮于生理盐水等中，做成液体检体。将这样准备的液体检体注入到微生物收集芯片B的液体检体注入容器3中。然后，将中空针6扎入负压状态下的负压管7口部的橡皮塞8，就象图1(b)所示的那样，通过使橡皮塞8贯通中空针6，可抽滤液体检体。另外，台座保持构件5的下部伸长，为的是使其具有作为使中空针6确实扎入到橡皮塞8的导轨的功能和使中空针不伤害到操作人员。
液体检体通过除去异物用过滤器1时，比微生物更大的异物被捕集到除去异物用过滤器1后被除去。在除去异物用过滤器1的前段设置用于捕集大的异物，例如蔬菜末和纤维等的过滤器，可以将以除去异物为目的的过滤器做成叠层形式。通过了除去异物用过滤器1的液体检体到达微生物收集用过滤器2，当液体检体含有微生物时，微生物被微生物收集用过滤器2捕集。另外，在微生物收集用过滤器2和台座4的交界面设置沟，目的是使液体检体可以不遗漏地遍布到微生物收集用过滤器2的整个面。由此可以抑制微生物被集中捕集在微生物收集用过滤器2的局部的现象。
液体检体注入容器3和台座保持部5由于可拆卸地嵌合，所以微生物被捕集到微生物收集用过滤器2上后，可以将液体检体注入容器3取出，就象图1(c)所示的那样，可以只将含有微生物收集用过滤器2的部位移动到微生物计量装置的计量台。
另外，在除去异物用过滤器的前段也可以设置另外的液体检体注入容器。
另外，也可以将负压管的口部的橡皮塞做成薄层。
另外，液体检体的制备也可以使用另外的试管等进行，要预先将生理盐水等注入到液体检体注入容器3，将使用棉签等收集的微生物悬浮于生理盐水中，做成液体检体。
另外，液体检体注入容器3和台座保持部5可拆卸地嵌合在一起，两者的接合可以通过螺纹。另外，两者在最初制造时可以做成一体，在通到外周的适当位置设置用于容易将两者分离的分离沟，利用该分离沟也可以将两者分离。
另外，只要中空针贯通橡皮塞，到达负压管内部，对其长度并没有限制。
图2(a)是本发明微生物收集试剂盒其他方式的剖面图。微生物收集用试剂盒D由微生物收集芯片E和抽滤手段F构成。微生物收集芯片E与图1(a)所示的微生物收集芯片B不同点在于液体检体注入容器13的上面备有盖住其开口部的带有棉签的盖52。通过使微生物收集试剂盒附带棉签，可以很容易而且简便地从表面裂纹多的检体对象或烹调场所的角落等形状复杂的检查对象取样。另外，就象微生物收集芯片E那样，将棉签51与盖52做成一体化，可以使形状简单化。就象图2(a)所示的那样，在预先向液体检体注入容器13中注入生理盐水53的同时，将棉签51做成浸入到生理盐水53的那样长度，使用棉签52从检查对象收集微生物后，将盖52盖在液体检体注入容器13上，通过使微生物收集芯片E上下振荡，附着在棉签51上的微生物游离到生理盐水53中，可很容易地制备液体检体。
微生物游离到生理盐水53后，就象图2(b)所示的那样，通过使橡皮塞18贯通中空针16，抽滤液体检体，将微生物捕集到微生物收集用过滤器12上。然后，与图1(c)所示的同样，将液体检体注入容器13取出，只将含有微生物收集用过滤器12的部位移到微生物计量台，进行计测。
另外，棉签也不必与盖做成一体化。
另外，棉签也不必是浸到生理盐水的长度的棉签，只要是通过振荡使附着在棉签的微生物游离到生理盐水，无论多长都可以。
另外，棉签可以从微生物收集试剂盒制造当初就浸到生理盐水中。此时，由于棉签被生理盐水浸湿，可以有效地从特别干燥的检体对象收集微生物。
另外，也可以用另外的试管进行附着使在棉签上的微生物游离到生理盐水中，制备液体检体，将制备了的液体检体注入到液体检体注入容器。
就象以上所述那样，捕集到微生物收集用过滤器上的微生物通过各种方法可以进行检测的同时，还可以计量，以下就同时对活细胞和死细胞两者或任一方与特定微生物进行检测、计量的方法进行说明。
本发明的第一个微生物计量方法是通过使活细胞和死细胞发色的第1化合物、在与上述发色不同的波长下使死细胞发色的第2化合物和在与上述发色不同的波长下使活细胞发色的第3化合物中的1种或多种，以及通过与来自特定微生物的物质进行反应，在与上述发色不同的波长下发色的至少一种以上的第4化合物与液体检体接触，在液体检体含有微生物时对微生物进行染色后，使用上述那样的微生物收集芯片，将微生物捕集到微生物收集用过滤器上后，从该波长差以及发色量，同时对活细胞和死细胞两方或任一方与特定微生物进行检测的方法。利用该方法由于活、死细胞、活细胞、死细胞、特定微生物在不同的波长下发色，所以可以同时对活细胞和死细胞两者或任一方与特定微生物进行检测。
发色例如可举由荧光引起的发色。此时，通过将第1化合物做成核酸结合性的化合物，可以于活细胞和死细胞的细胞单体水平进行高精度的计量。另外，通过将第2化合物做成核酸结合性的化合物，可以于死细胞的细胞单体水平进行高精度的计量。另外，通过使第3化合物与来自微生物的物质进行反应，可以根据其发色量的差异只对微生物进行计量。此时，通过将来自微生物的物质做成酶蛋白质，根据其反应性可以判别微生物的生死。另外，通过将来自特定微生物的物质做成酶蛋白质，根据其反应性可以判别特定微生物的生死。
作为为了对微生物进行荧光染色使用的使活、死细胞发色的第1化合物，如可举4’，6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐(可以是衍生物)那样的从活、死细胞的膜表面非特异浸透，通过与存在于细胞内的核酸特异结合，进行发色的化合物。作为在与上述发色不同的波长下使死细胞发色的第2化合物，如可举プロピデユ-ムイオダイド(可以是衍生物)那样的从死细胞的膜表面非特异浸透，通过与存在于细胞内的核酸特异结合，进行发色的化合物。作为在与上述发色不同的波长下使活细胞发色的第3化合物，如可举6-羧基荧光素盐酸、2’，7’-二氯荧光素盐酸、6-(N-琥珀酰亚胺酰羟基羰基)-3’，6’-O，O，-二乙酰基荧光素、ジヒドロドロ-ダミン、二乙酸荧光素、二乙酸4-叠氮荧光素(他们都可以是衍生物)那样的浸透到细胞内，被存在于细胞内的酶蛋白质、例如通过酯酶分解发色的化合物。作为通过与来自特定微生物的物质反应，在与上述发色不同的波长下发色的第4化合物，如可举4-甲基伞形酮基-β-D-半乳糖苷、4-甲基伞形酮基-β-D-葡糖苷(他们可以是衍生物)。这些化合物通过与作为大肠杆菌或大肠杆菌群生产的酶蛋白质的β-葡糖苷酶或β-半乳糖苷酶进行特异反应分解生成4-甲基伞形酮。4-甲基伞形酮被紫外光激发，发出荧光。
第1至第4化合物，例如，以溶解在生理盐水的状态下使用，通过添加到液体检体中，在液体检体含有微生物时，能够对微生物进行染色。溶解于生理盐水的状态的第1至第4化合物，可以将其合适的量收容到眼药水瓶等容器，用时添加到液体检体中。另外，染色时间应当根据检查对象的种类和液体检体的容量适当地设定。
通过使用本发明的微生物收集试剂盒对含有被染色的微生物的液体检体进行抽滤，将被染色的微生物捕集到微生物收集芯片中的微生物收集用过滤器上。此时，例如，如果预先向含有被染色的微生物的液体检体中添加聚山梨酸酯80等的表面活性剂，附着在被除去异物用过滤器捕集的异物的、没有被微生物收集用过滤器捕集的那样微生物也可以有效地通过除去异物用过滤器，被微生物收集用过滤器捕集。另外，预先向液体检体中添加多胨等的培养基成分，可以维持操作中微生物的活性。在使用表面活性剂的同时，为了达到这样的目的也可以适当地使用含有培养基成分的液体，例如LP稀释液「ダイゴ」(日本制药公司制造的商品名)。进行抽滤后，只将含有图1(c)所示的微生物收集用过滤器2的部位移动微生物计量装置的计量台，进行计测。如果向含有被染色的微生物的液体检体添加甘油等多价醇，可以防止由于微生物收集用过滤器表面干燥引起的微生物失活和发光减退。
另外，在微生物收集芯片中，也可以在微生物收集用过滤器的前段装置负载了第1至第4化合物的过滤器。
图3是表示微生物计量装置的一种方式。该微生物计量装置含有光源104、作为光源聚焦手段的镜头110、受光部111。为了从光源104中发出的激发光中取出目的波长，利用激发光分光滤片112进行分光。被分光的激发光经棱镜113光路发生了变化。光路发生变化的激发光经镜头110被聚焦到含有设置在检查台116的微生物收集用过滤器2的部位，即由微生物收集用过滤器2、台座4、台座保持构件5和中空针6构成的组合体的微生物收集用过滤器2的表面。在那里被激发光激发的微生物具有的荧光再透过棱镜113。此时，荧光原样透过棱镜113，到达受光部111。为了只取出目的荧光，到达受光部111的荧光经荧光分光滤片114，到达内藏于受光部111的光电变换元件115，被信号化，被识别。另外，虽然图中没有示出，但该微生物计量装置备有移动检查台116的手段，可以接受微生物收集用过滤器2的表面的荧光分光的全部、或一部分光。
到达光电变换元件115的荧光在微生物判断手段105内被判断为微生物或异物，被判断为微生物的荧光被累计，可以计量其数量。
由光源104发出的激发光被镜头110聚焦，此时透过镜头110照射的激发光的范围被聚焦在微小的一定面积。这种情形下的所谓微小的一定面积是指按照微生物的大小设定时，每一边为0.2μm至7.0μm左右的范围。另外，与现在常利用的微生物检测手段之一的琼脂培养基扩散法比较时，由通过琼脂培养基扩散法培养、增殖的微生物集团形成的菌落有时会出现菌落距离接近的情形，菌落之间重合的情形，最终通过目视确认时认为是单菌落的情形。这里所谓这种情形下的微小的一定面积是指按照菌落之间不重合的距离，每一边为100μm至500μm左右的范围。
被镜头110聚焦的激发光的照射时间依赖于发出荧光的化合物的消光时间和激发光强度。由于化合物的种类不同，有时通过存在于自然界的紫外光也可以进行分解，优选是在2秒至300秒前后的范围内照射激发光。
对发光进行检测时，在光源104的波长幅度宽时，可以通过激发光分光滤片112对激发波长进行调整、分光。由于激发光分光滤片112可以根据目的检测对象变化，对应于发出各种各样荧光的化合物。还有，同时当发光的荧光波长的幅度宽时，为了检测目的发光通过根据目的检测对象改变荧光分光滤片114，可以对应于发出各种各样荧光的化合物。
作为光源104，如可举各种二极管、卤灯、氙灯、冷阴极管、激光、近紫外光灯、水银灯等。这些光源中，最大激发波长比较固定的二极管、冷阴极管、近紫外光灯等，有时不使用上述激发光分光滤片112和荧光分光滤片114也可以实施。另外，卤灯、水银灯等，有时需要使用激发光分光滤片112和荧光分光滤片114。
棱镜113和镜头110具有根据需要分别透过紫外光的性质。作为具有透过紫外光的性质的物质如可举石英玻璃等。通过这些物质也可以对应于通过紫外光激发的化合物等。设置含有微生物收集用过滤器2的部位的检查台116具有旋转的功能。被镜头110聚焦的激发光可以由微生物收集用过滤器2的外周部移动到中心部、或由中心部移动到外周部的半径的距离。此时，在被镜头110聚焦的激发光的位置存在于外周部时和存在于中心部时，通过使检查台116的旋转速度变化，可以防止在被镜头110聚焦的激发光的位置存在于外周部时和存在于中心部时激发的化合物发出的荧光偏离，防止残像和残光的发生。
如图3所示的那样，检查台116具有用于使含有微生物收集用过滤器2的部位嵌合的塌陷部分(装置沟)，在塌陷部位呈现能够将含有微生物收集用过滤器2的部位原样整合的形状。另外，此时，在例如检查台116设置能够使微生物收集用过滤器2位于其上的金属平板，通过微生物收集用过滤器2以压住金属平板那样的状态整合，在检查台116上使得微生物收集用过滤器2没有凸凹保持平滑，可以更确实地进行捕集到微生物收集用过滤器2上的微生物的定量。
还有，通过设置识别聚焦的位置的手段，设定为对通过镜头110聚焦的激发光的位置进行识别，不使聚焦偏出轨道，另外当偏出时能够再返回到轨道。
另外，照射激发光的微小的一定面积不限定于含有正方形的多角形，即使是圆形、椭圆形等也可以，只要是能够照射检体的都可以。
另外，作为对激发光和荧光进行分光的手段可以利用衍射光栅等。
另外，通过调整检查台116的旋转速度可以预防荧光的残像和残光，通过调整照射激发光的镜头110的移动速度也可以防止残像和残光。
另外，识别聚焦的位置的手段不必直接识别激发光的聚焦位置，只要是把握微生物收集用过滤器2上的轨道就可以。
本发明的第二个微生物计量方法是使用微生物收集芯片从含有微生物的液体检体将微生物捕集到微生物收集用过滤器上后，使被捕捉的微生物中活细胞和死细胞都发色的第1化合物、在与上述发色不同的波长下使死细胞发色的第2化合物和在与上述发色不同的波长下使活细胞发色的第3化合物中的1种或多种，以及通过与来自特定微生物的物质进行反应，在与上述发色不同的波长下发色的至少一种以上的第4化合物与液体检体接触，对微生物进行染色后，从该波长差以及发色量，同时对活细胞和死细胞两方或任一方与特定微生物进行检测的方法。利用该方法，即使在液体检体容量多的时候，由于微生物被捕集到微生物收集用过滤器上后对微生物进行染色，所以可以获得由于第1至第4化合物的使用量少，精度高而且简单地对活细胞或死细胞、以及特定微生物进行计量。
通过向液体检体添加墨汁，由于将微生物捕集到微生物收集用过滤器上时过滤器上变黑，抑制背景和异物的分光，可以精度高地进行微生物计量。墨汁不一定要添加到液体检体，也可以从捕集了微生物的微生物收集用过滤器的上面添加。
图4是本发明的微生物计量装置的正常状态检查确认用检体的一种方式的斜视图(部分透视图)。这个正常状态检查确认用检体151是由其表面固定由所定的数个特定波长的激发光进行发光的发光体154以及印刷了确认所定个数的倾斜高度标志155的基体材料(例如，树脂片)152和其支持框153构成。
作为固定于基体材料表面的发光体，如可举高分子荧光粒子和染了色微生物等。由于高分子荧光粒子可以长时间地稳定，并维持均一发光，所以对装置状态的确认可以多次正确反复地进行，而且在确保人体安全性方面利用价值高。高分子荧光粒子作为以聚苯乙烯-二乙烯基苯等作为材料的粒子，是在对粒子进行聚合时添加由特定波长的激发光进行发光的荧光染料制造的粒子，各种粒子都有销售。高分子荧光粒子优选使用0.1至1.0μm粒径的粒子。如果过小，高精度地计测其个数变得困难，如下所述的那样，作为基体材料采用微生物收集用过滤器时，由于高分子荧光粒子从过滤器的孔落下，会使作为检查用检体的加工性变坏，另一方面，如果过大，由于发光强度过强，担心对计测精度造成影响。高分子荧光粒子可以固定单一种类的高分子荧光粒子，例如，可以固定如由350至400nm波长的激发光发出青色光的高分子荧光粒子，由500至550nm波长的激发光发出红色光的高分子荧光粒子那样的、通过不同波长的激发光以不同色彩进行发光的多种高分子荧光粒子。
将染了色的微生物固定在基体材料的表面时，进行固定的微生物根据作为检查目的的微生物或是活菌、或是死菌、或是两者，可以从活菌、死菌、活和死菌中适当选择(例如，作为检查目的的微生物是死菌时，由于需要对死菌计量用光源的正常状态进行确认，所以必须将死菌固定在基体材料上)。对活菌或活和死的混合菌进行固定时，在操作上应当留意必须要确保对人体的安全性。
基体材料除了树脂片以外，也可以是玻璃、纸、金属等。另外作为基体材料也可以使用微生物收集用过滤器。如果作为基体材料使用微生物收集用过滤器，由于对由特定波长的激发光进行发光的发光体进行过滤，可以容易地将该发光体捕集到过滤器上、即固定于基体材料的表面。基体材料优选做成暗色(例如黑色)。这是因为抑制背景发光，可以正确进行对装置状态的确认。另外，如果在表面固定了由特定波长的激发光进行发光的发光体的基体材料上形成含有从金、铜、铬、铂、钯选出的至少一种金属成分的薄膜，由于这些成分具有对300至550nm左右波长的激发光的分光反射率低的性质，所以将基体材料做成暗色，在表面固定了由特定波长的激发光进行发光的发光体的基体材料上形成上述薄膜，效果会进一步提高(铝和银由于对上述波长的激发光的发光反射率高，所以不能采用)。另外，如果形成这样的薄膜，不仅可以进行发光体的发光强度的调整、例如发光强度过强时，可以使发光强度减弱，同时可以防止固定于基体材料表面的发光体的脱落等。薄膜除了可以由一种金属成分构成之外，也可以由合金、金属氧化物、金属碳化物、金属氮化物等构成。另外，也可以是叠层薄膜。作为薄膜形成的方法，可以适当采用真空蒸(发)镀(膜)法、离子溅射法、离子镀法等众所周知的气相成长法。薄膜的厚度优选做成10至1000nm，更优选20至100nm。因为一方面担心如果厚度低于10nm，形成薄膜的效果不能充分发挥，另一方面担心如果超过1000nm，对固定于基体材料的表面的发光体的个数进行高精度地计测或发光体的发光强度的调整变得困难。
图5是在图4所示的表面上固定着由所定个数的特定波长的激发光进行发光的发光体154以及印刷着所定个数的倾斜高度确认标志155的树脂152的正面图。将发光体154作为染了色的微生物时，微生物的染色可以适当地使用例如上述的使活、死细胞发色的第1化合物或使死细胞发色的第2化合物、或使活细胞发色的第3化合物。发光体154可以通过图3所示的微生物计量装置进行检测。确认使用该正常状态检查确认用检体能够检测所定个数的发光体后，进行液体检体的微生物计量。如果能够检测所定个数的发光体，就意味着装置处于正常状态。另一方面，如果不能对所定个数的发光体进行检测的话，意味着装置没有处于正常状态，所以需要对装置进行调整等。
除了在图5所示的树脂片152的表面固定由所定个数的特定波长的激发光进行发光的发光体154之外，还印刷着4个倾斜高度确认标志155。对4个倾斜高度确认标志155照射光，通过研究该反射光的输出水平是否均等，例如可以对位于图3所示的微生物计量装置中的检查台116有无倾斜等进行检查。另外，通过研究输出水平是否是规定值，可以检查检查台116是否达到规定高度等。
另外，有关本发明的微生物计量装置的正常状态检查确认用检体的形状应当没有特别限制，例如对于位于图3所示的微生物计量装置中的检查台116含有的塌陷部分(装置沟)优选是做成与含有微生物收集用过滤器2部位同样能够整合的形状。另外，在检查台116中设置金属平板，为的是使正常状态检查确认用检体151的基体材料152位于其上，基体材料152通过以压住金属平板那样的状态进行整合，在检查台116上使得基体材料152没有凸凹，保持平滑，可以更确实地进行装置正常状态的确认。
产业上利用的可能性如通过以上实施例所表明的那样，在从液体检体对微生物进行过滤的过程中设置除去异物用过滤器和微生物收集用过滤器，将微生物捕集到微生物收集用过滤器上为本发明的特征，提供从存在多个异物的食品材料末或环境中沙尘等特殊的检体对象制备的液体检体的过滤变得容易，具有操作的迅速化、构造可简化的效果的微生物收集芯片。
还有，通过使上述那样的微生物收集芯片和抽滤手段组合，可以提供在食品工厂等现场，无论谁都可以简单、而且确实地进行微生物计量的微生物收集试剂盒。
另外，提供使用上述那样的微生物收集试剂盒，无论谁都能够高精度、而且简单地对活细胞、或死细胞和特定微生物进行计量的微生物计量方法。
另外，提供含有在表面固定了用于在进行上述那样的微生物计量之前确认装置处于正常状态的由特定波长的激发光进行发光的发光体的基体材料的微生物计量装置的正常状态检查确认用检体。
另外，提供使用上述那样的正常状态检查确认用检体能够确认装置处于正常状态的微生物计量装置。
权利要求
1.微生物收集芯片，由前段有预过滤器的除去异物用过滤器和后段有在过滤器上形成含有从金、铜、铬、铂、钯中至少选出一种金属成分的薄膜的微生物收集用过滤器组合构成，从可能含有微生物的液体检体对微生物进行过滤之后，将微生物捕集到微生物收集用过滤器上。
2.权利要求1记载的微生物收集芯片，其中除去异物用过滤器的孔径为5至20μm，微生物收集用过滤器的孔径为0.2至0.8μm。
3.权利要求1或2记载的微生物收集芯片，其中除去异物用过滤器做在液体检体注入容器的底部。
4.权利要求1或2记载的微生物收集芯片，其中在除去异物用过滤器的前段设置液体检体注入容器。
5.权利要求3或4记载的微生物收集芯片，其中备有盖在液体检体注入容器开口部的带有棉签的盖。
6.权利要求1记载的微生物收集芯片，其中含有微生物收集用过滤器的部位做成可单独卸下的部位。
7.权利要求1记载的微生物收集芯片，其中将微生物收集用过滤器做成暗色的过滤器。
8.权利要求1记载的微生物收集芯片，其中薄膜的膜厚为10至50nm。
9.微生物收集试剂盒，是由权利要求1记载的微生物收集芯片和抽滤装置构成。
10.权利要求9记载的微生物收集试剂盒，其中将抽滤装置做成负压管。
11.权利要求10记载的微生物收集试剂盒，其中在负压管的口部设置橡皮塞。
12.权利要求11记载的微生物收集试剂盒，其中橡皮塞的中心部成薄层。
13.权利要求10至12中的任一项记载的微生物收集试剂盒，其中在微生物收集用过滤器的下部设置通到负压管内部的中空针。
14.微生物收集用过滤器，其中在过滤器上形成有含有从金、铜、铬、铂、钯中至少选出一种金属成分的薄膜。
全文摘要
本发明目的在于从检查对象有效地收集微生物，另外对收集了的微生物进行正确检测、计量。本发明的微生物收集芯片由前段有预过滤器的除去异物用过滤器和后段有在过滤器上形成含有从金、铜、铬、铂、钯中至少选出一种金属成分的薄膜的微生物收集用过滤器组合构成，从可能含有微生物的液体检体对微生物进行过滤之后，将微生物捕集到微生物收集用过滤器上，其中在收集微生物用过滤器上形成有含有从金、铜、铬、铂、钯中至少选出一种金属成分的薄膜。
文档编号C12M1/26GK1876799SQ20061008013
公开日2006年12月13日 申请日期2002年7月30日 优先权日2001年7月30日
发明者田代义和, 岛北宽仁, 衣川昭德, 笹井八郎, 中岛浩, 小林芳久, 牧濑智之 申请人:松下环境系统株式会社