专利名称：：人乳头瘤病毒16型dna疫苗和基因佐剂及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物
技术领域：
，特别是采用生物技术的手段获得的一种DNA基因，以及含有所述的基因的疫苗及其用途。
背景技术：
：慢性持续性人乳头瘤病毒16型(HPV16)感染是诱发妇女宫颈癌的主要原因，此外HPV感染还与口腔癌、食管癌、阴茎癌、膀胱癌等多种恶性肿瘤发生密切相关。宫颈癌是妇女因恶性肿瘤死亡的主要原因，世界范围内每年新发宫颈癌病例约50万，死亡病例20万，其中2/3的病例在发展中国家，我国是宫颈癌的高发区，在某些落后地区宫颈癌的发病率高居妇女恶性肿瘤的首位。我国每年约有13.9万患者死于宫颈癌。目前晚期宫颈癌的治疗尚无良策，早期宫颈癌及癌前病变的治疗多采用药物腐蚀、激光冷冻及宫颈锥形切除，不能防止HPV16再感染的可能，且技术条件要求相对较高，不适合落后地区推广应用，而对无症状的慢性持续性感染则无对策，因此，研制针对HPV16的治疗疫苗是解决这一问题的根本措施。DNA疫苗可较好的诱发机体产生全面持久的免疫反应，特别是特异性细胞免疫，免疫后不产生针对疫苗载体的抗体，可以反复多次应用，能满足肿瘤免疫治疗需反复多次应用的要求，此外，DNA疫苗还具有易于生产，物理性质稳定，人群应用成本低等特点，所以适于在宫颈癌高发的落后地区推广应用。目前多种病毒及肿瘤的DNA疫苗已进行了大规模临床试验，结果表明疫苗的安全性好。研究表明HPV16病毒感染细胞和感染相关肿瘤细胞持续表达含有抗原表位的病毒癌蛋白E7，因此，E7蛋白可作为免疫系统识别这些感染及癌变细胞的靶，对其进行特异性杀伤。由于野生型E7基因有致癌活性，且难以诱发机体产生有效的免疫保护反应，不适于直接用于疫苗的研究。因此，在相关的疫苗研究中，采取了许多措施，以消除E7蛋白潜在的致癌活性，包括1.突变E7蛋白的结合Rb蛋白的结合位点，如C24G，C26G，以消除其转化活性。2.突变E7蛋白的鋅指结合区，使E7蛋白难以形成有转化活性功能性的二聚体，这样在降低其稳定性的同时又可促进E7蛋白的迅速降解成抗原表位，增强其免疫原性。3.将E7基因切割成4段后，随意重排，形成只含有E7蛋白线性抗原表位的人工假E7蛋白后再用于疫苗的研究。由于野生性E7基因的免疫原性较弱，为增强E7基因疫苗的免疫原性，研究者们采取了多种强化策略，与本发明密切相关的有以下几种1.与结核分枝杆菌HSP70基因融合，构建E7/HSP70基因疫苗。2.采用哺乳类的偏性密码子对E7基因进行优化改造，提高E7抗原基因的体内表达水平。3.采用细胞因子基因作为基因佐剂协同疫苗免疫，被应用于HPV疫苗的基因佐剂有B7-1，IL-12，IL-2等。IL-15是一种新型的多功能的细胞因子，可刺激T细胞特别是记忆性T细胞、NK细胞等免疫细胞的活化、增殖和表型的维持，而且IL-15的T细胞活化功能，不象IL-2那样易受炎性因子及瘤细胞分泌的免疫抑制因子如TGF-β的影响而受抑制，在瘤细胞抑制因子存在及缺乏IL-2及功能性CD4+T细胞时，仍具有促进抗原特异性T细胞及记忆性T细胞活化和增殖的活性，因此，IL-15细胞因子在病毒及肿瘤免疫治疗的研究领域备受重视，以IL-15真核表达质粒转染修饰前列腺癌细胞的免疫治疗研究发现，用人IL-2的信号肽替换天然IL-15的信号肽序列的IL-15表达质粒修饰的癌细胞，可高水平分泌表达IL-15，可诱发机体产生显著的特异抗肿瘤免疫(SuzukiK，NakazatoH，MatsuiH，HasumiM，ShibataY，FukaboriY，KurokawaK，YamanakaH.NKcell-mediatedanti-tumorimmuneresponsetohumanprostatecancercell，PC-3immunogenetherapyusingahighlysecretableformofinterleukin-15genetransfer.JournalofLeukocyteBiology，69(2001)531.)，另外天然IL-15或含Igκ信号肽的表达质粒作为基因佐剂协同疫苗免疫用于病毒及寄生虫的免疫治疗研究发现IL-15可增强疫苗的免疫原性(Xin.Ke-Qin，HamajimaK，sasakiS，TsujiT，WatabeS，OkadaE.I1-15expressionplasmidenhancescell-mediatedimmunityinducedbyanHIV-1DNAvaccine.Vaccine.17(1999)858-866)，但以IL-15表达质粒作为疫苗的基因佐剂用于肿瘤疫苗的研究尚未见有报道，更未见有利用人IL-2的信号肽替换天然IL-15的信号肽序列的IL-15表达质粒用于疫苗佐剂的报道。
发明内容为了克服现有技术的不足之处，本发明的技术方案在于提供的一种DNA基因，其特征在于该基因具有SEQNO.1所示的核苷酸序列。所述的基因是将消除了转化活性同时保留并强化了免疫活性的如SEQNO.1所示的基因与分枝结核杆菌热休克蛋白基因HSP70融合获得的融合基因。本发明的另一技术方案包括一种根据SEQNO.1的核苷酸序列表达的，具有SEQNO.2所示的氨基酸序列。本发明的又一技术方案包括一种含有SEQNO.1的核苷酸序列的载体，其特征在于所述的载体是质粒。所述的质粒是真核表达质粒，该质粒已经于2006年4月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCCNO.1668。本发明的技术方案还包括一种融合基因，其特征在于所述的基因是将消除了转化活性同时保留并强化了免疫活性的SEQNO.1所示的基因与分枝结核杆菌热休克蛋白基因HSP70融合获得的，由SEQNO.3所示的融合基因。本发明的技术方案还包括一种DNA疫苗，其特征在于该疫苗具有SEQNO.3所示的融合基因。所述的DNA疫苗还包括佐剂，所述佐剂优选是IL-15表达质粒，该IL-15表达质粒优选是人IL-2的信号肽替换天然IL-15的信号肽序列的IL-15表达质粒。简言之，本发明对HPV16的早期癌基因E7进行改造，获得改造后的E7基因(mE7，即SEQNO.1所示的核苷酸序列)，然后与结核分枝杆菌HSP70基因融合，获得融合抗原基因mE7/HSP70(即，SEQNO.3所示的核苷酸序列)，以此构建mE7/HSP70基因的表达质粒，以此作为DNA疫苗。该E7基因采用了基因切割重排方法进行了基因改造，保留其天然E7蛋白所有可能存在的抗原表位，特别是CTL表位，并重复排列了其中的片段。对所述E7基因改造还包括消除了与E7蛋白的转化活性密切相关的位点。本发明对所述的E7基因采用了免疫活性加强的方法，该方法包括使用哺乳类的偏性密码子及增加HLA*A限制性T细胞表位。同时，在本发明中，发明人采用改造了IL-15基因，使其具有SEQIDNO.4所示的核苷酸序列，并构建表达所述的IL-15的表达载体，以该载体作为疫苗的基因佐剂，用于HPV16病毒感染及感染相关疾病特别是宫颈癌癌前病变及宫颈癌疫苗，进行免疫治疗，本发明使用的含IL-2信号肽序列IL-15基因的外泌表达序列是公知的，本发明仅仅是把其插入本发明的疫苗载体中，在同其它IL-15基因的外泌表达序列进行比较后，发明人发现如SEQNO.4所示的含IL-2信号肽序列IL-15基因的外泌表达序列的分泌表达水平较高。本发明的技术方案进一步涉及融合抗原基因mE7/HSP70(即，SEQNO.3所示的核苷酸序列)在制备预防性免疫诱发的免疫反应清除人乳头瘤病毒16型病毒感染或者预防人乳头瘤病毒16型感染相关疾病的发生的药剂中的应用。所述的预防性免疫诱发的免疫反应清除人乳头瘤病毒16型病毒感染或者预防人乳头瘤病毒16型感染相关疾病包括妇女宫颈癌及其它相关恶性肿瘤。由此可见，另外本发明包括将HPV16抗原基因mE7抗原基因及mE7/HSP70融合抗原基因、以及佐剂基因IL-15被分别插入一种真核表达载体VR1012，以表达重组基因，以及采用真核表达质粒形式用作佐剂来应用；本发明也包括以表达HPV16mE7蛋白及mE7/HSP70融合蛋白的形式在疫苗方面的应用；最后，本发明还包括将具有mE7及mE7/HSP70基因或重组蛋白在制备药物、药物组合物，特别是疫苗中的应用。本发明具有重要经济及社会意义。换言之，发明提供一种人乳头瘤病毒16型(HPV16)DNA疫苗抗原基因及融合抗原基因，包括采用多种策略改造HPV16E7基因(mE7)然后将mE7基因与结核分枝杆菌热休克蛋白基因融合产生HPV16融合抗原基因(mE7/HSP70)及其真核表达质粒，同时还涉及该疫苗佐剂基因-即N端含人IL-2信号肽的IL-15成熟肽cDNA的真核表达质粒的构建。mE7/HSP70DNA疫苗及IL-15基因佐剂肌肉免疫小鼠后活性检测显示，mE7/HSP70DNA疫苗具有较强的免疫原性，不仅可以产生较多E7特异性的CD8+T细胞，而且该疫苗的预防性免疫可以完全阻止移殖瘤的形成，协同IL-15基因佐剂联合免疫可进一步提高mE7/HSP70DNA疫苗的抗瘤活性，特别是肿瘤的免疫治疗活性，联合IL-15基因佐剂的治疗性免疫可以完全清除小鼠体内业已存在的肿瘤细胞。该DNA疫苗及基因佐剂可用于HPV16感染的防治及HPV16感染相关的癌前病变和恶性肿瘤的免疫治疗。图1显示其中插入了HPV16mE7抗原基因的真核表达质粒“VR1012-mE7”结构简图。图2显示其中插入了HPV16mE7/HSP70融合抗原基因的真核表达质粒“VR1012-mE7/HSP70”结构简图。图3显示其中插入了人白细胞介素-2信号肽(IL-2sig)的人IL-15成熟蛋白的cDNA基因序列基因的真核表达质粒“VR1012-IL-2sig/IL-15”结构简图。图4A，B显示HPV16mE7抗原基因、mE7/HSP70融合抗原基因表达质粒瞬时转染Cos-7细胞后的表达检测图。采用VR1012-wtE7，VR1012-mE7及VR1012-mE7/HSP70瞬时转染COS-7细胞48小时后Westernblot表达分析，其中图4A显示杂交用一抗为兔抗HPV16E7多抗；图4B显示杂交用一抗为鼠抗HSP71的单克隆抗体。在图中的数字中，1代表VR1012转染组；2代表VR1012-wtE7转染组；3代表VR1012-mE7转染组；4代表VR1012-mE7/HSP70转染组。图5显示重组人白细胞介素-2信号肽(IL-2sig)的人IL-15成熟蛋白的cDNA基因表达质粒瞬时转染Cos-7细胞后的培养上清中IL-15的表达检测图，特别是VR1012-IL-2sig/IL-15瞬时转染COS-7细胞48小时后，ELISA法检测转染细胞上清中IL-15的表达情况。图6显示Elispot法检测不同免疫组小鼠脾细胞中HPV16E7特异性的CD8+T细胞的数目。图7显示mE7/HSP70DNA疫苗和/或IL-15基因佐剂协同免疫产生的抗移殖瘤的活性分析。图8、图9显示肿瘤细胞接种后再进行mE7/HSP70DNA疫苗和/或与IL-15基因佐剂协同免疫的抗移殖瘤的活性分析，其中图8标识小鼠接种肿瘤，模拟机体的荷瘤状态，然后进行疫苗免疫(治疗性免疫)，免疫小鼠对移殖瘤的免疫排斥反应。图9表示接种肿瘤细胞的小鼠治疗性免疫后，免疫各组小鼠移殖瘤生长情况。具体实施例方式以下将结合附图和实施例对本发明进行详细说明，其中实施例仅仅是说明而非限定的作用，本领域技术人员完全可以在以下披露的具体实施例的技术上作出改进，但是不超过本发明权利要求的范围或者本发明精神之内所作出的改进都会落入本发明的保护范围。本发明采用PCR及基因克隆等分子生物学方法获得消除转化活性及保留并强化免疫活性的，具有SEQNO.1所示的核苷酸序列的HPV16mE7抗原基因，然后将mE7与结核分枝杆菌热休克蛋白基因HSP70融合，得到mE7/HSP70融合抗原基因，再将mE7及mE7/HSP70基因插入真核表达载体VR1012，获得VR1012-mE7及VR1012-mE7/HSP70。同时采用PCR及基因克隆等分子生物学方法将含人白细胞介素-2信号肽(IL-2sig)的人IL-15成熟蛋白的cDNA基因序列插入真核表达载体VR1012，获得可高水平分泌表达IL-15的VR1012-IL-2sig/IL-15，作为疫苗的基因佐剂，然后进行动物免疫实验以评价mE7及mE7/HSP70DNA疫苗及IL-2sig/IL-15基因佐剂的免疫学活性。实施例1.抗原基因mE7基因的改造方法从基因Bank内检索获得本领域技术人员公知的野生型人乳头瘤病毒16型E7基因序列(HPV16E7)，然后以HPV16E7基因为基础，对其同时进行多项改造首先对E7基因进行多位点的定点突变，在E7基因的锌指结合区引入两个点突变C61G和C93G；在Rb结合区DLYCYEQ引入三个点突变，使DLYCYEQ突变为DGYGYGQ，然后再对E7基因进行“切割”后重排(Geneshuffling)，切点选两个，一个位于E7蛋白激酶识别位点处的两个丝氨酸之间(31S/32S)，另一个位于E7蛋白的第一个锌指结合区内的第60位及61位氨基酸之间(60K/61C)，将E7基因“切割”成三段，依次命名为a、b、c，然后按abbc规律重新排列，这样即可以保留天然E7蛋白所有可能存在的抗原表位，特别是CTL表位。为了提高该疫苗将来在人群的免疫保护效率，分别在上述改造后E7基因的5’及3’端添加了已被证实可被HLA*A0201呈递的E781-93及E711-20的CTL表位基因序列，添加的表位基因与E7蛋白序列之间用AAY连接，最后，按照哺乳动物偏爱的密码子对经上述改造后的E7基因进行密码子优化，基因合成法获得改造后的E7基因，命名为mE7。改造后E7基因的基因序列及氨基酸序列见序列表中的SEQIDNO.1和SEQIDNO.2。实施例2.重组mE7表达质粒的构建方法通过实施例1改造后的HPV16E7基因命名为mE7具有SEQIDNO.1的序列，采用基因合成法获得含mE7基因的克隆质粒Puc-mE7。按图1显示策略将mE7基因重组入VR1012真核表达质粒首先根据mE7基因序列设计上游引物mE7-5’CGAGTCGTGCGGCCGCCACCATGGATCTGC和下游引物mE7-3’GCTCTAGAGCTTAGGTAGTCTCGGGCTGCAG。上下游引物5’端3’端分别设计有NotI及XbaI酶切位点。以Puc-mE7质粒为模板进行PCR扩增mE7基因，反应条件为95℃预变性300s，然后进行25个循环扩增反应94℃变性60s，60℃复性60s，72℃延伸60s，最后72℃延伸300s。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，可见大小约500bp的特异性扩增片段，这与mE7基因的预期长度相符，获得含终止密码的mE7基因片段。用NotI和XbaI分别对PCR扩增得到含终止密码的mE7进行双酶切，回收双酶切的PCR片段，定量。同时用NotI及XbaI双酶切VR1012真核表达质粒载体，电泳后回收线性化的载体片段，定量。按4∶1的摩尔比加入上述制备的mE7基因片段和线性化的载体，T4连接酶16℃连接过夜，转化感受态大肠杆菌DH5α，挑克隆，质粒提取后，用NotI及XbaI双酶法进行鉴定后，，送A&B公司采用双脱氧核杆酸终止法测序结果显示插入序列为mE7基因序列，获得VR1012-mE7重组质粒。实施例3.重组mE7/HSP70融合抗原基因表达质粒的构建方法按图2所示策略将mE7/HSP70基因重组入VR1012真核表达质粒为了获得mE7基因与分枝结核杆菌热休克蛋白基因HSP70的融合抗原基因mE7/HSP70，首先构建不含终止密码的mE7的疫苗用表达载体，具体步骤如下根据mE7基因序列设计上游引物mE7-5’CGAGTCGTGCGGCCGCCACCATGGATCTGC及下游引物mE7-3’NGCTCTAGAGCGGTAGTCTCGGGCTGCAG，上下游引物5′端3′端分别设计有NotI及XbaI酶切位点。按实施例2所述方法，获得不含终止密码的mE7的表达载体VR1012-mE7(N)，用于构建mE7/HSP70融合基因。然后根据分枝结核杆菌HSP70cDNA序列，设计上下游引物HSP-5’GCTCTAGACATGGCTCGTGCGG和HSP-3’CGGGATCCTCACTTGGCCTCCC-3’，PCR法扩增HSP70基因，上下游引物5’和3’端分别设计有XbaI和BamHI酶切位点。以PGEM-HSP70质粒为模板，用pfuDNA聚合酶行PCR扩增，反应条件为95℃预变性300s，然后进行25个循环扩增反应94℃变性60s，56℃复性60s，72℃延伸120s，最后72℃延伸300s，扩增产物电泳后可见大小约1800bp的特异性扩增片段，与HSP70基因的理论值相符。XbaI和BamHI双酶切后回收HSP70的PCR扩增片段，定量。同时取2μg的VR1012真核表达质粒进行NotI及BamHI双酶切反应，制备线性化的粘末端的载体片段。然后按照4∶4∶1的摩尔比加入NotI及XbaI双酶切的无终止密码子的mE7PCR扩增片段、XbaI和BamHI双酶切处理的HSP70的PCR扩增片段及NotI及BamHI双酶切处理的VR1012载体片段，T4连接酶连接过夜，转化感受态大肠杆DH5α菌，挑克隆，小量提取质粒后，用NotI及BamHI双酶法进行鉴定，结果表明重组质粒酶切后释放出的片段约2358bp，与mE7/HSP70融合基因的理论值大小相符，测序后序列与SEQIDNO.3所示的序列相同。通过上述方法获得的mE7/HSP70融合基因全长为2358bp，其N端的1-471bp为mE7基因序列，中间为GCTCTAGAC(472-480bp)的连接片断，连接片段之后为分枝结核杆菌HSP70cDNA序列HSP70基因(481-2358bp)。mE7/HSP70融合基因序列见SEQIDNO.3。实施例4.人IL-15佐剂基因真核表达质粒的构建方法人全长IL-15基因的N端为信号肽序列，编码长为48AA或21AA的导肽，含48AA的信号肽的IL15蛋白主要是以外泌形势表达。天然IL-15蛋白的分泌能力很低，为了获得有效的IL-15分泌表达，采用人IL-2的信号肽替换了天然IL-15的信号肽序列。按图3所示策略将IL-2sig/IL-15基因重组入VR1012真核表达质粒，构建含人IL-2信号肽的IL-15真核表达质粒及含IL-15信号肽的IL-15真核表达质粒，并对两者在真核细胞内的分泌表达作了检测和比较，择优选用。含有人IL-2信号肽的人IL-15成熟蛋白的cDNA基因序列的pCI-IL15质粒为模板，用pfuDNA聚合酶PCR扩增IL-2sig/IL-15基因，上游引物含PstI酶切位点，序列为5-5’CAACTGCAGAACCATGTACAGGATGCAACTC；；下游引物含BamHI酶切位点，序列为IL15-3’CGCGGATCCTCAAGAAGTGTTGATGAAC。反应条件为95℃预变性300s后进入25个循环94℃变性60s，59℃复性60s，72℃延伸60s，最后72℃延伸300s。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，可见大小约410bp的特异性扩增片段，与预期长度相符。琼脂糖凝胶电泳后回收PCR扩增片段，纯化后定量。然后于40μl的双酶切体系中，加入5μg的PCR扩增产物，10u的PstI及BamHI限制性内切酶，37℃孵育2h，回收酶切后的PCR扩增片段，定量。取2μg的VR1012真核表达质粒，于40μl的PstI及BamHI双酶切体系中，酶切4h后，回收线性化的载体片段。按5∶1的摩尔比加入上述制备的PCR扩增片段和线性化的载体片段，T4连接酶连接过夜，转化感受态大肠杆菌DH5α，挑克隆，小量提取质粒后，用PstI及BamHI双酶法进行酶切鉴定，结果显示重组VR1012-IL-2sig/IL-15的表达质粒酶切后释放出的片段长约420bp，与IL-2sig/IL-15的理论值大小相符，测序后证明序列正确，序列与SEQIDNO.4.所示的IL-2sig/IL-15序列一致。实施例4.质粒DNA的大量制备和纯化方法碱裂解法大量提取重组质粒及对照质粒，然后采用聚乙二醇8000法对质粒进行纯化，琼脂糖凝胶电泳判断超螺旋闭合环状质粒DNA的百分比占质粒总量的90％以上，OD260/OD280的比值在1.8和1.9之间。用生理盐水缓冲液稀释至1-2μg/μl，-20℃贮存备用。实施例5.mE7及mE7/HSP70重组质粒表达检测方法(Westernblot)采用脂质体法转染Cos-7细胞Cos-7细胞接种于35mm培养皿，各取2μg的表达质粒，5μlLiporfectamine2000(Invitrogen)按试剂盒说明书转染90％融合度COS-7细胞，37℃，5％CO2培养48h，收获转染细胞。裂解后进行10％SDS-PAGE电泳，转膜，1％BSA-PBST封闭过夜后分别用1∶500稀释的HPV16E7兔多克隆抗血清和1∶1000抗结核分枝杆菌HSP71单克隆抗体4℃孵育过夜，洗涤后加入1∶5000稀释的HRP标记的羊抗鼠或羊抗兔IgG室温摇动孵育1h，充分洗涤后，加ECL反应液作用1min，感光后进行显影与定影处理。杂交结果如附图4A显示，VR1012-wtE7重组质粒转染组可见大小约为19kD特异性杂交带，与文献报道一致。VR1012-mE7重组质粒转染组可见相对分子量约为24kD特异性杂交带，与理论值基本一致。VR1012-mE7/HSP70重组质粒转染组可见大小约为90kD特异性杂交带，空载体转染组为阴性。抗结核分枝杆菌HSP71单克隆抗体杂交结果如附图4B所示，VR1012-mE7/HSP70重组质粒转染组可见大小约为90kD特异性杂交带，其它载体转染组为阴性。表明E7和HSP70基因获得了正确表达。实施例6.人IL-15基因重组质粒的表达检测及高分泌表达IL-15佐剂基因质粒的筛选采用双抗夹心ELISA法1).各取2μg的VR1012-IL-2sig/IL-15和VR1012-IL-15质粒，采用脂质体法转染COS-7细胞，37℃，5％CO2培养48h后，收获细胞培养上清。2ml的转染细胞培养上清经30kDa截留分子量的超滤离心管离心分离浓缩得到含有分子量为14-30kDa的蛋白溶液。2).向已经包被好抗体的酶标板加入上述转染细胞培养上清浓缩液100μl，每份样品都作复孔，按试剂盒(R&D，D1500)说明书，对样品的IL-15进行定量检测。结果如附图5所示，两种质粒均能分泌表达IL-15，但VR1012-IL-2sig/IL-15的表达效率明显高于VR1012-IL15因此采用VR1012-IL-2sig/IL-15重组表达质粒作为基因佐剂协同mE7/HSP70基因疫苗免疫，以增强疫苗的免疫活性。实施例7.Elispot法检测不同免疫组小鼠脾细胞中HPV16E7特异性的CD8+T细胞的数目取5-6周龄的雌性C57BL/6小鼠，随机分为6组，分别用于VR1012(Control)，VR1012-IL-2sig/IL-15(IL-15)，VR1012-wtE7(wtE7)，VR1012-mE7(mE7)，VR1012-mE7/HSP70(mE7/HSP70)和VR1012-mE7/HSP70+VR1012-IL-2sig/IL-15(mE7/HSP70+IL-15)的质粒免疫，免疫接种的前一天，先后间隔1h于免疫接种部位-小鼠左右小腿后肌各垂直注射50μl的0.5％的布比卡因。戊巴比妥(75mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠后，每种质粒的免疫剂量为100μg/鼠，免疫3次，间隔一周，最后一次免疫一周后，取鼠脾细胞，按MouseIFN-γElispotKit试剂盒(BD，551083)说明书的要求及方法，分析各组特异性的分泌IFN-γCD8+T的活化情况，方法如下1).用50μl的10μg/ml大鼠抗小鼠IFN-γ抗体包被96孔板(MAIPS45)，4℃孵育过夜。2).弃包被液，每孔加入250μl的PBST(0.5％Tween-20)洗板2次，然后每孔加入200μl的完全IMDM培养基，37℃孵育1h。3).红细胞裂解法分离制备小鼠脾细胞，调整细胞浓度为10×106/ml。4).铺板将刺激后的脾细胞系列稀释后，加入封闭后的包被板内，每组的细胞设置1×106、5×105和2.5×105三个梯度，每个梯度设三个复孔，各组加入50IU/mlIL-2和5μg/mlE749-57肽，37℃，5％CO2孵育40h。5).取出96孔板，弃培养液，0.5％PBS-T洗板5次，0.05％PBS-T洗板1次。6).每孔内加入100μl的2μg/ml的生物素标记的抗鼠IFN-γ(BD51-1818KZ)检测抗体，4℃孵育过夜。7).弃检测抗体，0.05％PBST洗6次。8).稀释SP-HRP至250ng/ml，每孔加100μl，室温孵育1小时。9).0.05％PBST洗3次，PBS洗3次。10).每孔加入新鲜配制的100μlAEC底物溶液，室温孵育5min，显色后用去离子水终止反应，凉干后于ImmunoSpotAnalyzer上扫描分析。结果如附图6所示，mE7基因免疫诱发产生特异性CD8+T细胞的能力显著高于野生型E7基因，mE7/HSP70基因免疫组可诱发较高水平的分泌IFN-γ的CD8+T细胞，协同IL-15基因佐剂免疫可进一步显著增加分泌IFN-γ的CD8+T的数目。选取诱发产生特异性CD8+T细胞能力最强的两组mE7/HSP70及mE7/HSP70+IL-15组进行体内抗瘤活性的检测。实施例8.mE7/HSP70DNA疫苗及与IL-15基因佐剂协同免疫后的抗移殖瘤免疫活性分析5-6周龄的雌性C57BL/6小鼠，随机分为4组，分别用于VR1012(Control)，VR1012-IL-2sig/IL-15，VR1012-mE7/HSP70(mE7/HSP70)和VR1012-mE7/HSP70+VR1012-IL-2sig/IL-15(mE7/HSP70+IL-15)的质粒免疫，免疫方法同前，免疫2次，间隔一周，第二次免疫7天后，用7×104的HPV16E6E7阳性的肿瘤细胞系TC-1皮下接种攻击，通过视诊和触诊观察记录肿瘤生长状况，每周观察2次。结果如附图7所示，mE7/HSP70单独及协同IL-15免疫组于接种后45天时100％小鼠均未成瘤，空载及IL-15组则于2周内全部成瘤。实验结果表明mE7/HSP70DNA疫苗单独免疫及与IL-15佐剂基因协同免疫均可诱发机体产生免疫预防保护反应，对随后接种的肿瘤细胞进行有效的免疫排斥，完全阻止移殖瘤的形成。实施例9.肿瘤细胞接种后再进行mE7/HSP70DNA疫苗及与IL-15基因佐剂协同免疫的抗移殖瘤免疫活性分析5-6周龄的雌性C57BL/6小鼠，随机分为4组，每组小鼠4-7只不等，具体数目参见图9，分别用于VR1012(Control)，VR1012-IL-2sig/IL-15，VR1012-mE7/HSP70(mE7/HSP70)和VR1012-mE7/HSP70+VR1012-IL-2sig/IL-15(mE7/HSP70+IL-15)的质粒免疫，皮下接种7×104的TC-1肿瘤细胞，模拟机体的荷瘤状态，三天后开始免疫，免疫方法同前，免疫2次，间隔一周，观察记录肿瘤生长情况。实验结果如附图8及附图9所示，免疫各组于接种后的9天开始成瘤，45天时空载及IL-15免疫组小鼠全部成瘤，瘤体积渐增，平均体积分别为2070和2191mm2；E7/HSP70组部分鼠全程无瘤，部分成瘤后又完全消退，部分瘤体积缓慢增大，45天仅50％的小鼠移殖瘤阳性，平均瘤体积仅为376mm2；协同IL-15组部分鼠成瘤后又完全消退，部分鼠全程无瘤，45天时成瘤小鼠的肿瘤完全消退，小鼠无瘤率高达100％。结果表明单独mE7/HSP70DNA疫苗免疫对肿瘤生长的具有明显抑制作用，协同IL-15基因佐剂联合免疫可进一步提高mE7/HSP70DNA疫苗的抗瘤活性，其诱发的免疫排斥反应可完全清除体内预先接种的肿瘤细胞，而且该保护作用是持久的。序列表<110>中国医学科学院基础医学研究所<120>人乳头瘤病毒16型DNA疫苗和基因佐剂及其应用<130><160>4<170>PatentInversion3.3<210>1<211>474<212>DNA<213>人乳头瘤病毒16型(HPV16)<400>1atggatctgcttatgggaactctgggcatcgtctgtccaatcgccgcttacatgcatggg60gacactccaaccctgcacgaatacatgctggatctgcagcccgagaccaccggcctctac120ggttacgggcagctgaacgatagcagcgaagaggaagacgaaattgacggccccgccggc180caggcagagccagatagggcccactacaacatcgtgacattttgctgcaagtctgaggaa240gaggacgagatcgacggtcccgccggtcaggcagagcctgatagagcccattacaatatc300gtgacattctgttgtaaaggggattccactctgcggttgtgcgtgcagtccacccacgtc360gacattagaaccctggaagacctcctcatggggaccttgggcatcgtgtgccctatcgga420agccagaagcctgctgcctactacatgctcgatctgcagcccgagactacctaa474<210>2<211>156<212>PRT<213>人乳头瘤病毒16型(HPV16)<400>2AspLeuLeuMetGlyThrLeuGlyIleValCysProIleAlaAlaTyr151015MetHisGlyAspThrProThrLeuHisGluTyrMetLeuAspLeuGln202530ProGluThrThrGlyLeuTyrGlyTyrGlyGlnLeuAsnAspSerSer354045GluGluGluAspGluIleAspGlyProAlaGlyGlnAlaGluProAsp505560ArgAlaHisTyrAsnIleValThrPheCysCysLysSerGluGluGlu65707580AspGluIleAspGlyProAlaGlyGlnAlaGluProAspArgAlaHis859095TyrAsnIleValThrPheCysCysLysGlyAspSerThrLeuArgLeu100105110CysValGlnSerThrHisValAspIleArgThrLeuGluAspLeuLeu115120125MetGlyThrLeuGlyIleValCysProIleGlySerGlnLysProAla130135140AlaTyrTyrMetLeuAspLeuGlnProGluThrThr145150155<210>3<211>2358<212>DNA<213>人工序列<400>3atggatctgctcatgggcaccctgggcatcgtgtgcccaatcgccgcttacatgcatggg60gacactccaaccctgcacgaatacatgctggatctgcagcccgagaccaccggcctctac120ggttacgggcagctgaacgatagcagcgaagaggaagacgaaattgacggccccgccggc180caggcagagccagatagggcccactacaacatcgtgacattttgctgcaagtctgaggaa240gaggacgagatcgacggtcccgccggtcaggcagagcctgatagagcccattacaatatc300gtgacattctgttgtaaaggggattccactctgcggttgtgcgtgcagtccacccacgtc360gacattagaaccctggaagacctcctcatggggaccttgggcatcgtgtgccctatcgga420agccagaagcctgctgcctactacatgctcgatctgcagcccgagactaccgctctagac480atggctcgtgcggtcgggatcgacctcgggaccaccaactccgtcgtctcggttctggaa540ggtggcgacccggtcgtcgtcgccaactccgagggctccaggaccaccccgtcaattgtc600gcgttcgcccgcaacggtgaggtgctggtcggccagcccgccaagaaccaggcagtgacc660aacgtcgatcgcaccgtgcgctcggtcaagcgacacatgggcagcgactggtccatagag720attgacggcaagaaataeaccgcgccggagatcagcgcccgcattctgatgaagctgaag780cgcgacgccgaggcctacctcggtgaggacattaccgacgcggttatcacgacgcccgcc840tacttcaatgacgcccagcgtcaggccaccaaggacgccggccagatcgccggcctcaac900gtgctgcggatcgtcaacgagccgaccgcggccgcgctggcctacggcctcgacaagggc960gagaaggagcagcgaatcctggtcttcgacttgggtggtggcactttcgacgtttccctg1020ctggagatcggcgagggtgtggttgaggtccgtgccacttcgggtgacaaccacctcggc1080ggcgacgactgggaccagcgggtcgtcgattggctggtggacaagttcaagggcaccagc1140ggcatcgatctgaccaaggacaagatggcgatgcagcggctgcgggaagccgccgagaag1200gcaaagatcgagctgagttcgagtcagtccacctcgatcaacctgccctacatcaccgtc1260gacgccgacaagaacccgttgttcttagacgagcagctgacccgcgcggagttccaacgg1320atcactcaggacctgctggaccgcactcgcaagccgttccagtcggtgatcgctgacacc1380ggcatttcggtgtcggagatcgatcacgttgtgctcgtgggtggttcgacccggatgccc1440gcggtgaccgatctggtcaaggaactcaccggcggcaaggaacccaacaagggcgtcaac1500cccgatgaggttgtcgcggtgggagccgctctgcaggccggcgtcctcaagggcgaggtg1560aaagacgttctgctgcttgatgttaccccgctgagcctgggtatcgagaccaagggcggg1620gtgatgaccaggctcatcgagcgcaacaccacgatccccaccaagcggtcggagactttc1680accaccgccgacgacaaccaaccgtcggtgcagatccaggtctatcagggggagcgtgag1740atcgccgcgcacaacaagttgctcgggtccttcgagctgaccggcatcccgccggcgccg1800cgggggattccgcagatcgaggtcactttcgacatcgacgccaacggcattgtgcacgtc1860accgccaaggacaagggcaccggcaaggagaacacgatccgaatccaggaaggctcgggc1920ctgtccaaggaagacattgaccgcatgatcaaggacgccgaagcgcacgccgaggaggat1980cgcaagcgtcgcgaggaggccgatgttcgtaatcaagccgagacattggtctaccagacg2040gagaagttcgtcaaagaacagcgtgaggccgagggtggttcgaaggtacctgaagacacg2100ctgaacaaggttgatgccgcggtggcggaagcgaaggcggcacttggcggatcggatatt2160tcggccatcaagtcggcgatggagaagctgggccaggagtcgcaggctctggggcaagcg2220atctacgaagcagctcaggctgcgtcacaggccactggcgctgcccaccccggcggcgag2280ccgggcggtgcccaccccggctcggctgatgacgttgtggacgcggaggtggtcgacgac2340ggccgggaggccaagtga2358<210>4<211>414<212>DNA<213>人工序列<400>4atgtacaggatgcaactcctgtcttgcattgcactaagtcttgcacttgtcacaaacagt60gcaggcgccaactgggtgaatgtaataagtgatttgaaaaaaattgaagatcttattcaa120tctatgcatattgatgctactttatatacggaaagtgatgttcaccccagttgcaaagta180acagcaatgaagtgctttctcttggagttacaagttatttcacttgagtccggagatgca240agtattcatgatacagtagaaaatctgatcatcctagcaaacaacagtttgtcttctaat300gggaatgtaacagaatctggatgcaaagaatgtgaggaactggaggaaaaaaatattaaa360gaatttttgcagagttttgtacatatcgtccaaatgttcatcaacacttcttga41权利要求1.一种DNA基因，其特征在于该基因具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。2.一种根据SEQIDNO.1的核苷酸序列表达的氨基酸序列，其特征在于其具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。3.一种含有SEQIDNO.1的核苷酸序列的载体，其特征在于所述的载体是质粒。4.根据权利要求4所述的载体，其特征在于所述的质粒是真核表达质粒，该质粒已经于2006年4月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCCNO.1668。5.一种融合基因，其特征在于所述的基因是将消除了转化活性同时保留并强化了免疫活性的SEQIDNO.1所示的基因与分枝结核杆菌热休克蛋白基因HSP70融合获得的，由SEQIDNO.3所示的融合基因。6.一种DNA疫苗，其特征在于该疫苗具有SEQIDNO.3所示的融合基因。7.根据权利要求6所述的DNA疫苗，其特征在于所述的DNA疫苗进一步包括佐剂，该佐剂具有SEQIDNO.4所示的核苷酸序列。8.根据权利要求7所述的DNA疫苗，其特征在于所述的佐剂是IL-15表达质粒。9.根据权利要求8所述的DNA疫苗，其特征在于所述的IL-15表达质粒是人IL-2的信号肽替换天然IL-15的信号肽序列的IL-15表达质粒。10.根据权利要求1所述的DNA基因，其特征在于该基因采用了基因切割重排方法进行了基因改造，保留其天然E7蛋白所有可能存在的抗原表位，特别是CTL表位，并重复排列了其中的片段。11.根据权利要求1所述的DNA基因，其特征在于对所述基因改造包括消除了与E7蛋白的转化活性密切相关的位点。12.根据权利要求1所述的DNA基因，其特征在于，对所述的基因采用了免疫活性加强的方法，该方法包括使用哺乳类的偏性密码子及增加HLA*A限制性T细胞表位。13.根据权利要求7所述的DNA疫苗，其特征在于该佐剂为含人白细胞介素-2的信号肽IL-2sig的人IL-15成熟蛋白的cDNA基因序列。14.根据权利要求6所述的疫苗在制备预防性免疫诱发的免疫反应清除人乳头瘤病毒16型病毒感染或者预防人乳头瘤病毒16型感染相关疾病的发生的药剂中的应用。15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于所述的预防性免疫诱发的免疫反应清除人乳头瘤病毒16型病毒感染或者预防人乳头瘤病毒16型感染相关疾病包括妇女宫颈癌及其它相关恶性肿瘤。全文摘要发明提供一种人乳头瘤病毒16型(HPV16)DNA疫苗抗原基因及融合抗原基因，及其真核表达质粒，同时还涉及该疫苗佐剂基因N端含人IL－2信号肽的IL－15成熟肽cDNA的真核表达质粒的构建。mE7/HSP70DNA疫苗具有较强的免疫原性，不仅可以产生较多E7特异性的CD8文档编号C12N15/62GK101063142SQ20061007964公开日2007年10月31日申请日期2006年4月30日优先权日2006年4月30日发明者许雪梅,许于飞,王庆勇,宋国兴,曾毅,司静懿申请人:中国医学科学院基础医学研究所