专利名称：多价重组人乳头瘤病毒疫苗及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及人乳头瘤病毒感染的预防和治疗领域。具体地，本发明涉及多价重组 人乳头瘤病毒疫苗及其应用。
背景技术：
子宫颈癌(Cervical Cancer)每年直接造成约超过30万成年女性死亡(国际卫 生组织资料)，成为世界范围内仅次于乳腺癌的威胁妇女生命健康的第二号杀手。科学研究 证实，导致宫颈癌的罪魁祸首是一种名为人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，简称HPV) 的DNA致癌病毒。该病毒主要通过两性接触传染，专性侵染人体上皮细胞特别是生殖器官， 部分病毒携带者在反复感染后表现出多种临床症状。女性受高危险型(HPV16、HPV18等) 病毒感染后，小部分患者由最初的宫颈细胞学异常，发展成I-III的宫颈内皮细胞瘤样变 (CINI-III)和浸润性宫颈癌变(ICC)，最终发展成致命的子宫颈癌。部分低危险型(HPV6、 HPVl 1)病毒感染可导致男女两性生殖器官部位的尖锐湿疣。最新研究表明HPV除了直接导致宫颈癌，还与支气管肺癌、直肠癌、口腔癌和皮肤 癌有重大关系。根据国际卫生组织WHO的有关资料，除了导致宫颈癌，HPV感染还可能解释 60 %的皮肤癌，60 %的食管癌，50 %的肺癌、50 %的乳腺癌、25 %的口腔癌等人类重大癌症。HPV病毒在长期的进化中形成了上百种变异类型，其中HPV16、HPV18等13种高危 险型确认能够导致宫颈癌症。HPV6、HPVll等低危险型是造成男女生殖部位尖锐湿疣的关 键病原体。根据《Vaccine》专刊增刊(25S(2007)C27-C219)中关于中国HPV类型分布频率 的报道，HPV58是仅次于HPV16和HPV18的分布最广的类型。全球除亚洲以外HPV 58的平 均分布频率低于2%。但在亚洲，特别是中国，HPV 58在子宫颈癌患者中的分布频率高达 7. 1%，在高等级伤害患者中的分布频率甚至高达13. 1%。因此，研制多价重组人乳头瘤病 毒疫苗刻不容缓。
发明内容
(一)要解决的技术问题本发明的目的之一是提供多价重组人乳头瘤病毒疫苗；本发明的另一目的是提供 该重组人乳头瘤病毒疫苗在制备药物中的应用。( 二 )技术方案本发明所述一种多价重组人乳头瘤病毒疫苗，它由活性成分和药物学上可接受的 辅料组成，所述的活性成分包括至少一种重组HPV型的Ll蛋白五聚体和/或以五聚体为基 本单元组成的多聚体。其中，所述的以五聚体为基本单元组成的多聚体包括五聚体，十二五聚体(T = 1， 二十面体)、三十六五聚体(τ = 3，二十面体)、四十八五聚体(T = 4，二十面体)、七十二五 聚体(T = 7，二十面体)和其他具有生物活性的Ll蛋白聚合形式。
定义十二五聚体表示十二个五聚体自发聚合而成的多聚体。三十六五聚体、 四十八五聚体、七十二五聚体的定义依此类推。T表示三角可分体(Triangular division)数目。当T = 1时，表示只能有十二个 五聚体自发聚合而成多聚体。T = 3，T = 4，T = 7的定义依此类推。所述的HPV型包括流行病学意义上的HPV高危险型和低危险型。优选地，所述的HPV型指HPV16，得到重组HPV16疫苗；优选地，所述的HPV型指HPV16、HPV18，得到HPV16、HPV18 二价重组子宫颈癌疫苗。优选地，所述的HPV型指HPV6、HPV11，得到HPV6、HPVll 二价重组尖锐湿疣疫苗。优选地，所述的HPV 型指 HPV16、HPV18、HPV6、HPV11，得到 HPV16、HPV18、HPV6、 HPVll四价重组疫苗。更优选地，所述的HPV型指昍￥16、昍￥18、昍￥6、昍￥11、昍￥33，得到HPV16、HPV18、 HPV6, HPVlU HPV33五价重组疫苗。最优选地，所述的HPV型指昍￥16、昍￥18、昍￥6、昍￥11、昍￥58，得到HPV16、HPV18、 HPV6、HPV11、HPV58五价重组疫苗。所述辅料包括但不限于佐剂、赋型剂、稳定剂。其中，所述佐剂选自铝盐、3-0-去 酰化单磷酸类脂、脂质A衍生物中的一种或多种，所述稳定剂选自基于磷酸盐的生理缓冲 液中的一种或多种，所述赋型剂选自生理盐水及其它药物上可接受的赋型剂中的一种或多 种。所述每种HPV型的Ll蛋白五聚体和/或以五聚体为基本单元组成的多聚体的含 量均为10-200 μ g/支疫苗。本发明还提供了一种生产上述疫苗的方法，它包括如下步骤(1)表达、分离、纯化所需要的重组HPV型的Ll蛋白五聚体和/或以五聚体为基本 单元组成的多聚体；(2)将所得Ll蛋白五聚体和/或以五聚体为基本单元组成的多聚体与辅料混合制 剂，得到多价重组人乳头瘤病毒疫苗。其中，表达、分离、纯化重组HPV的Ll蛋白多聚体的方法参见专利PCT/ CN2008/000314, CN200810055700. 5，得到纯度均为95%以上的Ll蛋白多聚体。本发明公开了上述疫苗在制备用于预防和/或治疗由HPV引起的感染和疾病的药 物中的应用。优选地，所述的感染和疾病包括子宫颈癌、尖锐湿疣、乳腺癌、支气管肺癌、直肠 癌、食道癌、咽癌、口腔癌、皮肤癌及其它与HPV密切相关的疾病。更优选地，所述的感染和 疾病是尖锐湿疣和子宫颈癌。本发明所述的疫苗可采用多种方法作用于人体，包括肌肉和皮下注射。该疫苗在 能引发对Ll蛋白免疫反应的有效剂量范围内使用。用于增强免疫反应的复合物的特定剂 量依照Ll复合物不同而变化。一般而言，Ll蛋白多聚体的用量在1_20μ g/Kg体重之间。 上述剂量范围并不排除更高或更低剂量的可能。例如，具体的剂量会根据是否伴随有其他 药物剂量而定，或取决于个人的药代动力学、药物积累和代谢速率。(三)有益效果本发明所述的多价疫苗能够有效预防包括尖锐湿疣、子宫颈癌在内的多种与HPV感染相关的疾病。因为五聚体与HPV Ll蛋白的VLP(类病毒颗粒，为HPV Ll蛋白的七十二五 聚体)具有相同的免疫原性和抗原性，且相对于VLP而言具有结构更稳定、工业成本大幅降 低的优点，所以本发明所述的疫苗与目前已有的疫苗相比，质量稳定、成本低廉，防治范围 更大，具有显著的经济效益和社会效应。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1重组HPV16人乳头瘤病毒疫苗的制备以下步骤中涉及的基因克隆、修饰等的操作参见PCT/CN2008/000314、 CN200810055700. 5。一、HPV16L1多聚体的制备1、克隆HPV16L1衣壳蛋白基因，克隆到T-Easy vector质粒(购自美国Promega 生物试剂公司)上。2、修饰HPV16L1衣壳蛋白基因，并在大肠杆菌中表达将含有碱基替代突变的载 有HPV16L1基因插入片段的表达质粒pGEX-6-l通过热激法导入大肠杆菌BL21细胞之后， 使用LB培养基(配方见《(分子克隆》第三版，科学出版社，2002年8月出版)进行摄氏37 度培养，菌种接入后生长12小时开始用表达诱导剂IPTG(购自美国Promega公司)诱导， 9小时后收获细胞，细胞用Niro Soavi NS2006型高压勻质机在800bar下重复破碎细胞2 次，显微镜检查细胞破碎率达到90%以上。3、HPV16L1蛋白多聚体的分离、纯化上清溶液中的Ll蛋白经亲和色谱纯化蛋白 预装谷胱甘肽-琼脂糖树脂(Amersham公司生产的Glutathiones印harose 4B)色谱柱， 取浓度为50%的Glutathione Sepharose 4B勻浆放入色谱柱中(每200ml蛋白清液需要 5-10ml勻浆)。用5-10倍的柱床体积的缓冲液A (组分为:50mmol/L Tric-HCl，200mmol/ L NaCl,lmmol/L EDTA，pH8. 0)洗涤树脂，将蛋白清液加入色谱柱中，与树脂混合均勻并在 室温下作用20分钟后放出滤过液，用10倍柱床体积的缓冲液A洗涤树脂柱。用电镜观察 纯化产物，得到HPV16L1的五聚体和以五聚体为基本单元组成的多聚体。二、活性成分与辅料混合将纯化的HPV16L1的多聚体与含有IOOmM NaCl的标准 磷酸缓冲液(见《分子克隆实验指南》第三版，)通过缓冲液置换(bufferexchange，见《分 子克隆实验指南》第三版)方式混合，使得Ll多聚体保存在pH值为7. 2的磷酸缓冲液中， 通过调整使得重组HPV16蛋白多聚体含量为50μ g/支疫苗，制剂成为重组HPV16人乳头瘤 病毒疫苗，在4°C保存。实施例2 二价重组人乳头瘤病毒(HPV16、HPV18)疫苗的制备以下步骤中涉及的基因克隆、修饰等的操作参见PCT/CN2008/000314、 CN200810055700. 5。一、HPV16L1五聚体的制备同实施例1。二、采用与前述相同的方法制备HPV18L1蛋白的五聚体。三、活性成分与辅料混合将纯化的HPV16和HPV18L1蛋白的五聚体与含有IOOmM NaCl的标准磷酸缓冲液(见《分子克隆实验指南》第三版，)通过缓冲液置换(buffer exchange,见《分子克隆实验指南》第三版)方式混合，使得Ll五聚体保存在pH值为7. 2的磷酸缓冲液中，同时加入氢氧化铝150 μ g，通过调整使得重组HPV16蛋白五聚体含量为 10 μ g/支疫苗、HPV18蛋白五聚体含量为20 μ g/支疫苗，制剂成为二价重组人乳头瘤病毒 疫苗，在4°C保存。实施例3 二价重组人乳头瘤病毒(HPV6、HPVl 1)疫苗的制备以下步骤中涉及的基因克隆、修饰等的操作参见PCT/CN2008/000314、 CN200810055700. 5。一、HPV6L1蛋白三十六五聚体(VLP)的制备同实施例1。二、采用与前述相同的方法制备HPVll Ll蛋白的三十六五聚体。三、活性成分与辅料混合将纯化的HPV6和HPVll Ll蛋白的三十六五聚体与含有 IOOmM NaCl的标准磷酸缓冲液(见《分子克隆实验指南》第三版，)通过缓冲液置换(buffer exchange，见《分子克隆实验指南》第三版)方式混合，使得Ll三十六五聚体保存在pH值为 7. 2的磷酸缓冲液中，通过调整使得重组HPV6蛋白三十六五聚体含量为150 μ g/支疫苗、 HPVll蛋白三十六五聚体含量为200 μ g/支疫苗，制剂成为二价重组人乳头瘤病毒疫苗，在 4°C保存。实施例4四价重组人乳头瘤病毒(HPV6、HPV11、HPV16、HPV18)疫苗的制备以下步骤中涉及的基因克隆、修饰等的操作参见PCT/CN2008/000314、 CN200810055700. 5。一、HPV6L1蛋白七十二五聚体(VLP)的制备同实施例1。二、采用与前述相同的方法制备HPVll、HPV16、HPV18L1蛋白的七十二五聚体。三、活性成分与辅料混合将纯化的HPV6、HPVl 1、HPV16、HPV18 Ll蛋白的 七十二五聚体与含有IOOmM NaCl的标准磷酸缓冲液(见《分子克隆实验指南》第三版，) 通过缓冲液置换(buffer exchange，见《分子克隆实验指南》第三版)方式混合，使得Ll 七十二五聚体保存在PH值为7. 2的磷酸缓冲液中，通过调整使得重组HPV6蛋白七十二五 聚体含量为20 μ g/支疫苗、HPVll蛋白七十二五聚体含量为25 μ g/支疫苗、HPV16蛋白 七十二五聚体含量为20 μ g/支疫苗、HPV18蛋白七十二聚体含量为35 μ g/支疫苗，制剂成 为四价重组人乳头瘤病毒疫苗，在4°C保存。实施例5五价重组人乳头瘤病毒(HPV11、HPV16、HPV18和HPV58)疫苗的制备以下步骤中涉及的基因克隆、修饰等的操作参见PCT/CN2008/000314、 CN200810055700. 5。一、HPV6L1五聚体的制备同实施例1。二、采用与前述相同的方法制备HPV11、HPV16、HPV18和HPV58L1蛋白的五聚体。三、活性成分与辅料混合将纯化的HPV6、HPV11、HPV16、HPV18和HPV58的五聚体 与含有IOOmM NaCl的标准磷酸缓冲液(见《分子克隆实验指南》第三版，)通过缓冲液置换 (buffer exchange，见《分子克隆实验指南》第三版)方式混合，使得Ll五聚体保存在pH值 为7. 2的磷酸缓冲液中，通过调整使得重组HPV6蛋白五聚体含量为50 μ g/支疫苗、HPVll 蛋白五聚体含量为30 μ g/支疫苗、HPV16蛋白五聚体含量为50 μ g/支疫苗、HPV18蛋白五 聚体含量为20 μ g/支疫苗和HPV58蛋白五聚体含量为50 μ g/支疫苗，制剂成为五价重组 人乳头瘤病毒疫苗，在4°C保存。实施例6五价重组人乳头瘤病毒(HPV11、HPV16、HPV18和HPV33)疫苗的制备
以下步骤中涉及的基因克隆、修饰等的操作参见PCT/CN2008/000314、 CN200810055700. 5。一、HPV6L1十二五聚体的制备同实施例1。二、采用与前述相同的方法制备HPV11、HPV16、HPV18和HPV33 Ll蛋白的十二五聚体。三、活性成分与辅料混合将纯化的朋￥6、朋￥11、朋￥16、朋￥18和朋￥33 Ll蛋白的 十二五聚体与含有IOOmM NaCl的标准磷酸缓冲液(见《分子克隆实验指南》第三版，)通过 缓冲液置换(buffer exchange，见《分子克隆实验指南》第三版)方式混合，使得Ll十二五 聚体保存在PH值为7. 2的磷酸缓冲液中，通过调整使得重组HPV6蛋白十二五聚体含量为 30 μ g/支疫苗、HPVll蛋白十二五聚体含量为30 μ g/支疫苗、HPV16蛋白十二五聚体含量 为30 μ g/支疫苗、HPV18蛋白十二五聚体含量为30 μ g/支疫苗和HPV33蛋白十二五聚体 含量为30 μ g/支疫苗，制剂成为五价重组人乳头瘤病毒疫苗，在4°C保存。
权利要求
一种多价重组人乳头瘤病毒疫苗，它由活性成分和药物学上可接受的辅料组成，其特征在于所述的活性成分包括至少一种重组HPV型的L1蛋白五聚体和/或以五聚体为基本单元组成的多聚体。
2.根据权利要求1所述的多价重组人乳头瘤病毒疫苗，其特征在于所述的以五聚体为 基本单元组成的多聚体包括五聚体，十二五聚体、三十六五聚体、四十八五聚体、七十二五 聚体和其他具有生物活性的Ll蛋白聚合形式。
3.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于所述的HPV型包括流行病学意义上的HPV 高危险型和低危险型。
4.根据权利要求3所述的疫苗，其特征在于所述的HPV型指HPV16。
5.根据权利要求3所述的疫苗，其特征在于所述的HPV型指HPV16、HPV18。
6.根据权利要求3所述的疫苗，其特征在于所述的HPV型指HPV6、HPV11。
7.根据权利要求3所述的疫苗，其特征在于所述的HPV型指HPV16、HPV18、HPV6、 HPVllo
8.根据权利要求3所述的疫苗，其特征在于所述的HPV型指HPV16、HPV18、HPV6、 HPV11、HPV33。
9.根据权利要求3所述的疫苗，其特征在于所述的HPV型指HPV16、HPV18、HPV6、 HPV11、HPV58。
10.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于所述辅料包括但不限于佐剂、赋型剂、稳 定剂。
11.根据权利要求10所述的疫苗，其特征在于所述佐剂选自铝盐、3-0-去酰化单磷酸 类脂、脂质A衍生物中的一种或多种。
12.根据权利要求10所述的疫苗，其特征在于所述稳定剂选自基于磷酸盐的生理缓冲 液中的一种或多种。
13.根据权利要求10所述的疫苗，其特征在于所述赋型剂选自生理盐水及其它药物上 可接受的赋型剂中的一种或多种。
14.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于所述每种HPV型的Ll蛋白五聚体和/或 以五聚体为基本单元组成的多聚体的含量均为10-200 μ g/支疫苗。
15.一种生产如权利要求1-14之任一权利要求所述疫苗的方法，它包括如下步骤(1)表达、分离、纯化所需要的重组HPV型的Ll蛋白五聚体和/或以五聚体为基本单元 组成的多聚体；(2)将所得Ll蛋白五聚体和/或以五聚体为基本单元组成的多聚体与辅料混合制剂， 得到多价重组人乳头瘤病毒疫苗。
16.根据权利要求1-14之任一权利要求所述的疫苗在制备用于预防和/或治疗由HPV 引起的感染和疾病的药物中的应用。
17.根据权利要求16所述的应用，其特征在于所述的感染和疾病包括子宫颈癌、尖锐 湿疣、乳腺癌、支气管肺癌、直肠癌、食道癌、咽癌、口腔癌、皮肤癌及其它与HPV密切相关的 疾病。
18.根据权利要求17所述的应用，其特征在于所述的感染和疾病是尖锐湿疣和子宫颈癌。
全文摘要
本发明提供了一种多价重组人乳头瘤病毒疫苗，它由活性成分和药物学上可接受的辅料组成，其中活性成分包括至少一种重组HPV型的L1蛋白五聚体和/或以五聚体为基本单元组成的多聚体。本发明所述的多价疫苗能够有效预防包括尖锐湿疣、子宫颈癌在内的多种与HPV感染相关的疾病。本发明所述的疫苗与目前已有的疫苗相比，质量稳定、成本低廉，防治范围大，具有显著的经济效益和社会效应。
文档编号A61P17/12GK101890160SQ200910082730
公开日2010年11月24日 申请日期2009年4月28日 优先权日2009年4月28日
发明者陈小江, 马润林 申请人:北京康乐卫士生物技术有限公司